Resultat

Vi visade inledningsvis att administrering av cykloheximid, i nära anslutning till induktion av pilocarpin SE, blockerade supragranulära MFS hos råttor – men förhindrade inte den efterföljande utvecklingen av spontana anfall eller påverkade deras frekvens. Dessa resultat gav för första gången direkta bevis mot en kausal roll för supragranulär MFS i temporallobens epileptogenes. En möjlig förklaring till denna åtskillnad är att anfallsgenerering i pilocarpin- och kainatmodellerna av epilepsi skulle kunna drivas av extrahippocampala källor. Faktum är att de relativa bidragen från thalamus, amygdala och piriform cortex i initieringen av spontana anfall i dessa modeller har angetts i ett antal studier.

För att ta itu med denna fråga använde vi nästa gång den intrahippocampala appliceringen av kaininsyra i liten dos. Även här kunde cykloheximid helt blockera supragranulär MFS hos de flesta djur, utan att ändra frekvensen och intensiteten av spontana iktala och interiktala EEG-händelser. Vi drog slutsatsen att även i den intrahippocampala kainatmodellen med liten dos kainat, där det var mer sannolikt att spontana anfall inleddes i den injicerade hippocampus, är supragranulär MFS inte nödvändig för uppkomsten av iktala händelser.

Med tanke på att de flesta av våra analyser i de första experimenten utvärderade djur 2 månader efter den initiala utlösande skadan, försökte vi sedan undersöka hur supragranulär MFS skulle påverkas av de spontana anfallen. Vissa publikationer i detta ämne har visat att djur med mer frekventa anfall har en mer intensiv supragranulär MFS, vilket tyder på att denna form av synaptisk reorganisation på något sätt är förknippad med en större benägenhet att få anfall (även om den inte avgör om anfall uppstår eller inte). Andra forskare har hävdat att tätheten av supragranulära MFS inte är förknippad med det totala antalet livstidsanfall eller anfallsfrekvensen (vid experimentell eller mänsklig temporallobsepilepsi), och många författare anser inte längre att MFS är en nödvändig eller tillräcklig händelse vid temporallobsepilepsi. I det mänskliga tillståndet har vi dock ingen kontroll över vävnadens bakgrundsstatus. Och i de flesta experimentella studier krävdes SE för uppkomsten av anfall – där det inte råder någon tvekan om att supragranulär MFS till stor del är en återspegling av en föregående SE-episod. Genom att skapa ett experimentellt tillstånd där ingen supragranulär MFS härrörde från den första SE-episoden kunde vi undersöka det relativa bidraget från efterföljande spontana anfall till denna synaptiska omorganisation. Vi drog slutsatsen att supragranulär MFS inte visade något samband med frekvensen av spontana anfall och verkade vara mer kritiskt beroende av tiden efter den första skadan. Faktum är att under dessa förhållanden utvecklades supragranulär MFS så småningom hos alla djur, även om det skedde i mycket långsammare takt; vidare verkade den inte vara mer robust hos djur med högre frekvens av återkommande spontana anfall.

Beskrivningen av granulecellsspridning i mänsklig vävnad från patienter med epilepsi i tinningloben gav upphov till förslaget att utvecklingsförändringar skulle kunna ligga till grund för den efterföljande epilepsi som uppstod hos dessa patienter. Påvisningen, först i pilocarpinmodellen för råttor och senare i kainatbehandlade möss, att vuxna gnagare kunde utveckla granulecellspridning tydde på att dessa cytoarkitetoniska förändringar också kunde vara en följd av den första utlösande episoden av SE. Den efterföljande demonstrationen av att neurogenesen av dentata granuleceller ökade efter SE introducerade ytterligare en möjlighet – att hippocampal nätverksplasticitet i samband med epileptogenes skulle kunna uppstå från avvikande kopplingar som bildas av nyfödda dentata granuleceller. Vi undersökte därför om cykloheximid skulle påverka uppkomsten av supragranulär MFS genom att blockera granulecellsneurogenesen. Till vår stora förvåning observerade vi att cellproliferationen i DG ökar dramatiskt hos epileptiska djur som behandlas med cykloheximid. Induktion av SE hos djur som injicerats med enbart pilocarpin ledde till 2-7-faldiga ökningar av mitosfrekvensen hos dentata granuleceller, jämfört med 5-30-faldiga ökningar för pilocarpin/cycloheximid-behandlade djur. Vi föreslog att sådana ökade mitotiska frekvenser var förknippade med ett skydd genom cykloheximid av en sårbar prekursorcellspopulation som annars skulle degenerera efter pilocarpininducerad SE. Vi föreslog vidare att MFS och granulecellernas neurogenes inte nödvändigtvis är kopplade till varandra. Denna dissociation stämmer överens med upptäckten att bestrålning av djur som utsatts för pilocarpininducerad SE i huvudsak upphävde dentat granulecellsneurogenes, men misslyckades med att förhindra mossiga fibrer som omorganiserades i dentat molekylära skiktet.

Helcells patch-clamp-inspelningar i hippocampala skivor hade visat att amplituden och frekvensen av spontana excitatoriska postsynaptiska strömmar i granuleceller ökade med tiden efter kainatbehandling. Denna ökade excitatoriska synaptiska input korrelerade med intensiteten av Timm-färgen i det inre molekylära lagret. När inhibitionen minskades med bicucullin i skivor från kainatbehandlade djur framkallade blixtfotolys av buren glutamat applicerad i granulecellskiktet epileptiforma utbrott av aktionspotentialer (en effekt som inte sågs i granuleceller från kontrollråttor). Dessa data stödde hypotesen att kainatinducerad supragranulär MFS resulterar i en progressiv bildning av avvikande excitatoriska förbindelser mellan granuleceller. För att utvärdera de förändringar i den elektrofysiologiska profilen som skulle bli resultatet av cykloheximidbehandling utfördes in vitro-elektrofysiologi (extracellulära inspelningar) två månader efter pilokarpininducerad SE. Evokativa potentialer i skivor från pilokarpin- och pilokarpin/cycloheximidbehandlade råttor uppvisade polyspikaktivitet med liten amplitud (epileptiform respons) i CA1 och en till synes normal isolerad populationsspik i DG. Ännu viktigare är att DG i skivor från djur med pilokarpin och pilokarpin/cycloheximid inte skiljde sig åt när det gäller elektrofysiologiska avvikelser, inte ens vid hög K+ eller hög K+/bicucullin. Analys av neo-Timm-färgningen visade som väntat på stark supragranulär MFS hos pilocarpin-injicerade råttor och betydligt mindre färgning hos pilocarpin/cycloheximid-råttor. Förekomsten av onormala stimulusresponser och hög K+- eller hög K+/bicucullin-inducerad epileptiform aktivitet berodde således inte på graden av supragranulär MFS.

En långvarig fråga om utvecklingen av MFS i djurmodeller av SE är om spirande mossiga fibrer skulle lägga till nya synapser till dendriterna i molekylära skiktet – eller om dessa spirande fibrer helt enkelt ersatte lediga synapser (på grund av hilarcellsdegeneration). De flesta studier i ämnet tyder faktiskt på att förlusten av Hilar mossy cells, som normalt är ett viktigt mål för granule cell mossy fibers i Hilar, är en viktig faktor för att starta supragranulär MFS. Pilokarpininducerad SE i närvaro av cykloheximid resulterade i ett minskat antal skadade hilära celler jämfört med råttor som inte förbehandlats med cykloheximid. Förmodade mossiga celler, identifierade med hjälp av immunohistokemi för calcitonin genrelaterad peptid (CGRP), var inte signifikant reducerade i någon av grupperna 60 dagar efter SE (med tanke på den till synes inkonsekventa karaktären hos detta fynd med en övervikt av bevis som indikerar en förlust av mossiga celler SE, antar vi att CGRP kan utgöra en markör för en subpopulation av mossiga celler.). Medan kontrollerna hade ett starkt band av CGRP-positiva fibrer (förmodade mossy cellaxon) och inga neo-Timm-färgade fibrer i det inre molekylära lagret, hade pilocarpinbehandlade råttor inga CGRP-fibrer och stark neo-Timm-färgning. Cykloheximid-pilocarpinbehandlade djur hade däremot CGRP- och neo-Timm-färgning som liknade kontrollerna. Vi drog slutsatsen att cykloheximid kan skydda hilar CGRP-positiva celler under SE; genom att låta dessa celler behålla sin normala axonala projektion förhindrades MFS – ett scenario som stämmer överens med hypotesen om ”irriterade” mossy-celler som förlitar sig på mossy-cellernas överlevnad för nätverkets hyperexcitabilitet. Vi föreslog att cykloheximid förhindrar SE-inducerad supragranulär MFS genom att förhindra förlusten av cilära CGRP-positiva celler (förmodade mossy-celler).

Det faktum att cykloheximid skyddade cilära celler och ytterligare ökade cellproliferationen i DG efter SE skapade förutsättningarna för en hypotes som integrerar aktuella observationer. Forskare har visat att vissa nyfödda granuleceller utvecklas på onormala platser i hilus. Dessa ektopiska granuleceller uppvisar regelbundna utbrott av aktionspotentialer som är synkroniserade med CA3-pyramidcellernas utbrottsutladdningar och utbrotten från hilariska neuroner (inklusive mossiga celler). Förutom bildandet av ektopiska hilariska granuleceller har flera artiklar karakteriserat bildandet av hilariska basala dendriter på granuleceller hos epileptiska djur. Båda egenskaperna möjliggör säkerligen avvikande synapser i hilus, antingen genom ektopiska eller irriterbara celler eller i avvikande basala dendriter, vilket kan förklara förändringar i hyperexcitabilitet – oberoende av förekomsten av supragranulär MFS.