Promotoarele controlează legarea ARN polimerazei și a factorilor de transcripție. Deoarece regiunea promotoare conduce transcrierea unei gene țintă, ea determină, prin urmare, momentul exprimării genei și definește în mare măsură cantitatea de proteină recombinantă care va fi produsă. Mulți promotori comuni, cum ar fi promotorii CMV, EF1A și SV40, sunt întotdeauna activi și, prin urmare, sunt numiți promotori constitutivi. Alții sunt activi doar în anumite circumstanțe. În această postare, vom discuta despre promotorii inductibili, care pot fi comutați de la o stare OFF la o stare ON, și despre modul în care i-ați putea folosi în cercetările dumneavoastră. Când ați terminat cu această postare, consultați postarea noastră ulterioară despre promotorii reprimabili.

Cum sunt reglați promotorii inductibili?

Promotoarele inductibile pot fi reglementate prin control pozitiv sau negativ.

Promotoare inductibile pozitive

În starea OFF, promotorul este inactiv deoarece proteina activatoare nu se poate lega. După ce un inductor se leagă de proteina activatoare, proteina activatoare se poate lega de promotor, activându-l și inițiind transcrierea.

Inductibil negativ

În starea OFF, promotorul este inactiv deoarece o proteină represoare legată împiedică în mod activ transcrierea. Odată ce un inductor se leagă de proteina represoare, proteina represoare este eliminată din ADN. Cu proteina represoare absentă, transcripția este pornită.

Tipuri de promotori inductibili

Agenții chimici, temperatura și lumina sunt toate exemple de factori care pot duce la inducerea unui promotor. Mai jos, veți găsi o scurtă descriere a acestor trei tipuri de promotori inductibili, precum și exemple ale fiecărui tip. Multe dintre aceste sisteme de promotori sunt disponibile la Addgene!

Promotoare inductibile chimic

Promotoarele reglementate chimic sunt printre cei mai comuni promotori inductibili. Sistemul inductibil pozitiv cu tetraciclină ON (Tet-On), un instrument versatil dezvoltat pentru utilizare la procariote și eucariote, funcționează prin activare directă. În acest sistem, activatorul rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) este în mod normal inactiv și nu se poate lega de elementele de răspuns la tetraciclină (TRE) dintr-un promotor. Tetraciclina și derivații săi servesc ca agenți inductori pentru a permite activarea promotorului.

Unul dintre cei mai frecvent utilizați promotori procarioți este promotorul inductibil negativ pLac. Acest promotor necesită îndepărtarea represorului lac (proteina lacI) pentru ca transcripția să fie activată. În prezența lactozei sau a analogului lactozei IPTG, reprimatorul lac suferă o modificare de conformație care îl îndepărtează de situsurile lacO din cadrul promotorului și încetează reprimarea genei țintă. Un sistem inductibil lac simplificat se găsește în mulți vectori de expresie bacteriană.

Promoterul inductibil negativ pBad este un alt promotor procariot popular, adesea utilizat pentru purificarea proteinelor bacteriene. Atunci când arabinoza este absentă, proteina regulatoare AraC se leagă de situsurile O și I1 în amonte de pBad, blocând transcripția. Adăugarea de arabinoză face ca AraC să se lege de situsurile I1 și I2, permițând începerea transcrierii. În plus față de arabinoză, AMPc complexat cu proteina activatoare de AMPc (CAP) poate stimula, de asemenea, legarea AraC la situsurile I1 și I2. Suplimentarea mediilor de creștere a celulelor cu glucoză scade AMPc și reprimă pBad, scăzând scurgerea promotorului.

Alte exemple de promotori induși chimic includ promotori inducibili pozitiv de alcool și promotori reglați de steroizi utilizați în mod obișnuit în cercetarea plantelor.

Subtip de promotor	Exemplu de promotor	Activator	Addgene Plasmid/Kit
Alcohol-reglementat	PromoterAlcA	AlcR	pGGA008 (AlcA) și pGGC011 (AlcR) din kitul GreenGate cu flacără roșie
Steroid-reglementat	Promoter LexA	XVE (sintetic)	pFZ19 (flacără galbenă)

Promotoare inductibile la temperatură

Sistemele de expresie sensibile la temperatură sunt, de obicei, mai puțin permeabile decât promotorii induși chimic; acestea prezintă o expresie aproape nulă la temperaturi obișnuite, dar pot fi induse prin expunere la căldură sau la frig. Printre exemple se numără promotorii Hsp70 sau Hsp90 indus de șocul termic, în care o genă aleasă este exprimată numai în urma expunerii la un scurt șoc termic. În cazul Hsp70, șocul termic eliberează factorul de șoc termic 1 (HSF-1), care se leagă ulterior de elementele de șoc termic din promotor, activând astfel transcrierea. Deponenții Addgene au dezvoltat Cre și Cas9 inductibile prin șoc termic pentru a facilita ingineria genomului la specii precum C. elegans și Drosophila.

Promotoare inductibile de lumină

Lumina este o altă modalitate de a activa expresia genelor, iar sistemele cu două componente utilizate în biologia sintetică folosesc lumina pentru a regla transcripția. Plasmidă de flacără roșie pDawn conține proteina YFI de detectare a luminii albastre. În absența luminii, YFI fosforilează FixJ, care se leagă de promotorul FixK2 pentru a induce transcrierea represorului fagului cI. Represorul cI inhibă transcrierea din promotorul fagului pR, împiedicând exprimarea unei gene reporter. În prezența luminii, YFI este inactiv, împiedicând sinteza represorului cI și permițând transcrierea genei reporter. Addgene dispune, de asemenea, de sisteme cu două componente reglate de lumina galbenă de flacără, concepute de laboratorul Tabor.

Ce promotor inductibil este potrivit pentru mine?

Iată o listă cu câteva variabile importante care trebuie luate în considerare atunci când se alege un promotor inductibil.

Sistem experimental

Pentru că mașinăria de transcripție diferă între tipurile de celule sau organisme, promotorii sunt la fel de variabili. Promotorii bacterieni funcționează numai în celulele procariote și, de obicei, numai în aceeași specie sau în specii strâns înrudite din care au fost derivați. În mod similar, diferitele tipuri de celule eucariote (mamifere, drojdii, plante etc.) au nevoie de promotori unici și există foarte puțină încrucișare. Mecanismul de inducție trebuie, de asemenea, să fie compatibil cu sistemul dumneavoastră experimental.

Leakiness

Dacă exprimați o genă care poate fi toxică, este important ca promotorul dumneavoastră inductibil să nu fie prea leaky. Pentru promotorii procarioți inductibili, se știe că pLac este ușor permeabil, iar pBad este probabil o opțiune mai bună, deoarece expresia poate fi reprimată de glucoză. Promotorii inductibili prin temperatură sunt, de asemenea, cunoscuți pentru scurgerea lor redusă.

Nivelul de inducibilitate

Cât de mult doriți să induceți transcrierea genei țintă? Puterea promotorilor inductibili poate varia foarte mult. Dacă sunteți în căutarea unei inductibilități ridicate, sistemul Tet-On poate fi o alegere bună, deoarece este documentat să inducă transcrierea de >1.000 de ori atunci când este activat.

Timp de întârziere

Timp necesar pentru a induce un anumit promotor variază. Promotorii care necesită doar adăugarea unui inductor extern, cum ar fi sistemele Tet, pot fi activați foarte rapid. În schimb, sistemele de promotori care necesită transcrierea unui represor/inducător vor avea un timp de întârziere mai mare din cauza timpului necesar pentru transcriere/translație.

Mulțumiri lui Nicole Zurcher, care a contribuit la redactarea acestui articol.

Resurse suplimentare pe blogul Addgene:

• Plasmide 101: Regiunea promotorului
• Plasmide 101: Cre-lox
• Sisteme bicomponente comutabile la lumină pentru E. coli
• Vizitați alte articole de blog din seria Plasmide 101

.