Rezultate
Am demonstrat inițial că administrarea de cicloheximidă, în imediata apropiere a inducerii SE cu pilocarpină, a blocat MFS supragranulară la șobolani – dar nu a împiedicat dezvoltarea ulterioară a convulsiilor spontane și nici nu a afectat frecvența acestora. Aceste rezultate au furnizat, pentru prima dată, dovezi directe împotriva unui rol cauzal al MFS supragranulare în epileptogeneza lobului temporal. O posibilă explicație pentru această disociere este că generarea crizelor în modelele de epilepsie cu pilocarpină și kainat ar putea fi determinată de surse extrahipocampale. Într-adevăr, contribuțiile relative ale talamusului, amigdalei și cortexului piriform în inițierea convulsiilor spontane în aceste modele au fost indicate într-o serie de studii.
Pentru a aborda această problemă, am folosit în continuare aplicarea intrahipocampală a unei doze mici de acid kainic. Aici, din nou, cicloheximida a fost capabilă să blocheze complet MFS supragranulară la majoritatea animalelor, fără a modifica frecvența și intensitatea evenimentelor EEG spontane ictale și interictale. Am concluzionat că, de asemenea, în modelul intrahipocampal cu doze mici de kainat, în care convulsiile spontane au fost mai susceptibile de a se iniția în hipocampul injectat, MFS supragranular nu este necesar pentru apariția evenimentelor ictale.
Datorită faptului că majoritatea analizelor noastre din experimentele inițiale au evaluat animalele la 2 luni de la leziunea inițială precipitantă, am căutat apoi să investigăm modul în care MFS supragranular ar fi afectat de convulsiile spontane. Unele publicații pe această temă au arătat că animalele cu convulsii mai frecvente au o MFS supragranulară mai intensă, sugerând astfel că această formă de reorganizare sinaptică este cumva asociată cu o tendință mai mare de a avea convulsii (chiar dacă nu determină dacă apar sau nu convulsii). Alți cercetători au susținut că densitatea MFS supragranulare nu este asociată cu numărul total de crize de-a lungul vieții sau cu frecvența crizelor (în epilepsia experimentală sau umană a lobului temporal), iar mulți autori nu mai consideră MFS ca fiind un eveniment necesar sau suficient în epilepsia lobului temporal. Cu toate acestea, în condiția umană, nu avem niciun control asupra stării de fond a țesutului. Iar în majoritatea studiilor experimentale, SE a fost necesară pentru apariția convulsiilor – unde nu există nicio îndoială că MFS supragranulară este în mare măsură reflectarea unui episod de SE anterior. Prin producerea unei condiții experimentale în care nicio MFS supragranulară nu a fost derivată din episodul inițial de SE, am putut investiga contribuția relativă a convulsiilor spontane ulterioare la această reorganizare sinaptică. Am ajuns la concluzia că MFS supragranulară nu a prezentat nicio asociere cu frecvența crizelor spontane și pare să depindă mai mult în mod critic de timpul scurs de la leziunea inițială. Într-adevăr, în aceste condiții, MFS supragranulară s-a dezvoltat în cele din urmă la toate animalele, chiar dacă într-un ritm mult mai lent; în plus, nu părea să fie mai robustă la animalele cu o frecvență mai mare de crize spontane recurente.
Descrierea dispersiei celulelor granulare în țesutul uman de la pacienții cu epilepsie de lob temporal a dat naștere la sugestia că modificările de dezvoltare ar putea sta la baza epilepsiei ulterioare la acești pacienți. Demonstrația, mai întâi în modelul de șobolan cu pilocarpină și mai târziu la șoarecii tratați cu kainat, că rozătoarele adulte ar putea dezvolta dispersia celulelor granulare a indicat faptul că aceste modificări citoarhitectonice ar putea fi, de asemenea, consecința episodului inițial precipitant de SE. Demonstrația ulterioară a faptului că neurogeneza celulelor granule dentate a fost crescută după SE a introdus o posibilitate suplimentară – faptul că plasticitatea rețelei hipocampale asociată cu epileptogeneza ar putea apărea din conexiunile aberante formate de celulele granule dentate nou-născute. Prin urmare, am investigat dacă cicloheximida ar afecta debutul MFS supragranulare prin blocarea neurogenezei celulelor granule. Spre surprinderea noastră, am observat că proliferarea celulară în DG este dramatic crescută la animalele epileptice tratate cu cicloheximidă. Inducerea SE la animalele injectate doar cu pilocarpină a dus la creșteri de 2-7 ori a ratei mitotice a celulelor granulelor dentate, în comparație cu creșteri de 5-30 ori pentru animalele tratate cu pilocarpină/cicloheximidă. Am sugerat că astfel de rate mitotice crescute au fost asociate cu o protecție prin cicloheximidă a unei populații de celule precursoare vulnerabile care altfel ar fi degenerat după SE indusă de pilocarpină. Am sugerat, de asemenea, că MFS și neurogeneza celulelor granulare nu sunt neapărat legate una de cealaltă. Această disociere este în concordanță cu constatarea că iradierea animalelor supuse la SE indusă de pilocarpină a abolit în mod esențial neurogeneza celulelor granule dentate, dar nu a reușit să prevină reorganizarea fibrelor musculoase în stratul molecular dentat.
Înregistrările patch-clamp cu celule întregi în felii de hipocamp au arătat că amplitudinea și frecvența curenților postsinaptici excitatori spontani în celulele granule au crescut cu timpul după tratamentul cu kainat. Această intrare sinaptică excitatorie crescută a fost corelată cu intensitatea colorației Timm în stratul molecular intern. Atunci când inhibiția a fost redusă cu bicuculină în felii de la animalele tratate cu kainat, fotoliza flash a glutamatului în cușcă aplicat în stratul celulelor granulare a evocat explozii epileptiforme de potențiale de acțiune (un efect care nu a fost observat în celulele granulare de la șobolanii de control). Aceste date au susținut ipoteza că MFS supragranulară indusă de kainat are ca rezultat formarea progresivă de conexiuni excitatorii aberante între celulele granule. Pentru a evalua modificările în profilul electrofiziologic care ar rezulta din tratamentul cu cicloheximidă, s-a efectuat electrofiziologie in vitro (înregistrări extracelulare) la 2 luni după SE indusă de pilocarpină. Potențialele evocate în felii de la șobolani tratați cu pilocarpină și pilocarpină/cicloheximidă au prezentat o activitate polispiking de mică amplitudine (răspunsuri epileptiforme) în CA1 și un vârf de populație izolat aparent normal în DG. Mai important, DG-ul din felii de la animalele cu pilocarpină și pilocarpină/cicloheximidă nu a fost diferit în ceea ce privește anomaliile electrofiziologice, chiar și în condiții de K+ ridicat sau K+ ridicat/bicuculină. Analiza colorării neo-Timm, așa cum era de așteptat, a evidențiat o puternică MFS supragranulară la șobolanii injectați cu pilocarpină și o colorare semnificativ mai mică la șobolanii cu pilocarpină/cicloheximidă. Astfel, apariția răspunsurilor anormale la stimuli și a activităților epileptiforme induse de K+ ridicat sau de K+ ridicat/bicuculină nu a depins de gradul de MFS supragranular.
O întrebare de lungă durată cu privire la dezvoltarea MFS în modelele animale de SE este dacă fibrele musculoase germinate ar adăuga noi sinapse la dendritele din stratul molecular – sau dacă aceste fibre germinate au înlocuit pur și simplu sinapsele vacante (din cauza degenerării celulelor hilare). Într-adevăr, majoritatea studiilor pe această temă au sugerat că pierderea celulelor musculoase hilare, în mod normal o țintă hilară majoră a fibrelor musculoase din celulele granulare, este un factor important în inițierea MFS supragranulare. SE indusă de pilocarpină în prezența cicloheximidei a dus la un număr redus de celule hilare lezate în comparație cu șobolanii netratați cu cicloheximidă. Presupusele celule musculoase, identificate prin imunohistochimie cu peptida legată de gena calcitoninei (CGRP), nu au fost reduse în mod semnificativ în niciunul dintre grupuri la 60 de zile după SE (având în vedere inconsecvența aparentă a acestei constatări cu o preponderență a dovezilor care indică o pierdere de celule musculoase SE, presupunem că CGRP ar putea constitui un marker al unei subpopulații de celule musculoase). În timp ce controalele aveau o bandă puternică de fibre CGRP-pozitive (axoni putativi ai celulelor mossy) și nici o fibră colorată cu neo-Timm în stratul molecular intern, șobolanii tratați cu pilocarpină nu aveau fibre CGRP și o colorare puternică a neo-Timm. Animalele tratate cu cicloheximidă-pilocarpină, în schimb, au avut o colorare CGRP și neo-Timm similară cu cea a martorilor. Am concluzionat că cicloheximida ar putea proteja celulele hilare CGRP-pozitive în timpul SE; permițând acestor celule să își păstreze proiecția axonală normală, MFS a fost prevenită – un scenariu în concordanță cu ipoteza celulelor musculoase „iritabile” care se bazează pe supraviețuirea celulelor musculoase pentru hiperexcitabilitatea rețelei. Am sugerat că cicloheximida previne MFS supragranulară indusă de SE prin prevenirea pierderii de celule hilare CGRP-pozitive (celule mossy putative).
Faptul că cicloheximida a protejat celulele hilare și a crescut în continuare proliferarea celulară în DG după SE a creat cadrul pentru o ipoteză care integrează observațiile actuale. Cercetătorii au arătat că unele celule granulare nou-născute se dezvoltă în locații anormale în cadrul hilului. Aceste celule granule ectopice prezintă explozii regulate de potențiale de acțiune care sunt sincronizate cu descărcările de explozie ale celulelor piramidale CA3 și cu exploziile neuronilor hilari (inclusiv celulele musculoase). În plus față de formarea de celule granule hilare ectopice, mai multe articole au caracterizat formarea de dendrite hilare bazale pe celulele granule la animalele epileptice. Ambele caracteristici permit cu siguranță sinapse aberante în hil, fie prin celule ectopice sau iritabile, fie în dendrite bazale aberante, ceea ce poate explica modificările hiperexcitabilității – indiferent de prezența MFS supragranulare.
.