Promotores controlam a ligação de RNA polimerase e fatores de transcrição. Como a região promotora impulsiona a transcrição de um gene alvo, ela determina, portanto, o momento da expressão do gene e define em grande parte a quantidade de proteína recombinante que será produzida. Muitos promotores comuns, como os promotores CMV, EF1A e SV40, estão sempre ativos e, portanto, referidos como promotores constituintes. Outros só estão ativos sob circunstâncias específicas. Neste post, vamos discutir os promotores induzíveis, que podem ser trocados de um estado OFF (desligado) para um estado ON (ligado), e como você pode usá-los em sua pesquisa. Quando terminar este post, verifique nosso post de acompanhamento sobre promotores repressíveis.

Como os promotores induzíveis são regulados?

Produtos induzíveis podem ser regulados por controle positivo ou negativo.

Positivos induzíveis

No estado OFF, o promotor está inativo porque a proteína ativadora não pode se ligar. Após um indutor ligar-se à proteína activadora, a proteína activadora pode ligar-se ao promotor, ligando-o e iniciando a transcrição.

Negativo induzível

No estado OFF, o promotor está inactivo porque uma proteína repressora ligada impede activamente a transcrição. Assim que um indutor liga a proteína repressora, a proteína repressora é removida do DNA. Com a proteína repressora ausente, a transcrição é ligada.

Tipos de promotores induzíveis

A agentes químicos, temperatura e luz são todos exemplos de factores que podem levar à indução de um promotor. Abaixo, você encontrará uma breve descrição desses três tipos de promotores induzíveis, e exemplos de cada tipo. Muitos destes sistemas promotores estão disponíveis em Addgene!

Promotores quimicamente induzíveis

Promotores quimicamente regulados estão entre os promotores induzíveis mais comuns. O sistema positivo de tetraciclina induzível ON (Tet-On), uma ferramenta versátil desenvolvida para uso em procariotas e eucariotas, funciona através de ativação direta. Neste sistema, o activador rtTA (activador de tetraciclina invertida) é normalmente inactivo e não pode ligar os elementos de resposta tetraciclina (TRE) num promotor. A tetraciclina e seus derivados servem como agentes indutores para permitir a ativação do promotor.

Um dos promotores procarióticos mais comumente usados é o promotor pLac negativo induzível. Este promotor requer a remoção do repressor da laceração (proteína lacI) para que a transcrição seja ativada. Na presença de lactose ou IPTG analógico da lactose, o repressor da laceração sofre uma alteração conformacional que o remove dos sítios lacO dentro do promotor e cessa a repressão do gene alvo. Um sistema lac induzível simplificado é encontrado em muitos vectores de expressão bacteriana.

Promotor induzível negativo pBad é outro promotor procariótico popular frequentemente utilizado para a purificação da proteína bacteriana. Quando a arabinose está ausente, a proteína reguladora AraC liga os sítios O e I1 a montante do pBad, bloqueando a transcrição. A adição de arabinose faz com que o AraC ligue sítios I1 e I2, permitindo que a transcrição comece. Além da arabinose, o cAMP complexado com a proteína ativadora cAMP (CAP) também pode estimular a ligação de AraC aos sítios I1 e I2. O suplemento de meios de crescimento celular com glicose diminui o AMPc e reprime o pBad, diminuindo a vazamento do promotor.

Outros exemplos de promotores quimicamente induzidos incluem álcool induzível positivo e promotores regulados por esteróides comumente usados em pesquisa de plantas.

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Subtipo de promotor	Exemplo de promotor	Activador	Addgene Plasmid/Kit
Álcool-regulado	AlcA promotor	AlcR	pGGA008 (AlcA) e pGGC011 (AlcR) do kit de chama vermelha GreenGate
Steroid-regulado	Promotor LexA	XVE (sintético)	pFZ19 (chama amarela) >

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Promotores induzíveis à temperatura

Sistemas de expressão sensíveis à temperatura são tipicamente menos fugas do que os promotores quimicamente induzidos; mostram expressão quase nula a temperaturas regulares, mas podem ser induzidos por exposição ao calor ou ao frio. Exemplos incluem os promotores derivados do choque térmico Hsp70 ou Hsp90, nos quais um gene de escolha só é expresso após a exposição a um breve choque térmico. No caso da Hsp70, o choque térmico libera o fator de choque térmico 1 (HSF-1), que posteriormente se liga aos elementos de choque térmico no promotor, ativando assim a transcrição. Os depositantes de adgene desenvolveram o choque térmico Cre e Cas9 para facilitar a engenharia do genoma em espécies como C. elegans e Drosophila.

Promotores induzíveis de luz

Light é outra forma de ativar a expressão gênica, e os sistemas de dois componentes usados na biologia sintética usam a luz para regular a transcrição. O plasmídeo de chama vermelho pDawn contém a proteína YFI sensora de luz azul. Quando a luz está ausente, os fosforilatos YFI FixJ, que se ligam ao promotor FixK2 para induzir a transcrição do fago repressor cI. O repressor cI inibe a transcrição do promotor de fago pR, impedindo a expressão de um gene repórter. Quando a luz está presente, a YFI está inativa, impedindo a síntese do repressor cI e permitindo que a transcrição do gene repórter ocorra. Addgene também tem dois sistemas de dois componentes, regulados por luz de chama amarela, projetados pelo laboratório Tabor.

Que promotor induzível é adequado para mim?

Aqui está uma lista de algumas variáveis importantes a considerar ao escolher um promotor induzível.

Sistema experimental

Porque o mecanismo de transcrição difere entre os tipos de células ou organismos, os promotores são igualmente variáveis. Os promotores bacterianos funcionam apenas em células procarióticas e tipicamente apenas na mesma espécie ou em espécies intimamente relacionadas das quais eles foram derivados. Da mesma forma, os vários tipos de células eucarióticas (mamíferos, leveduras, plantas, etc.) requerem promotores únicos e há muito pouco cruzamento. O mecanismo de indução também deve ser compatível com seu sistema experimental.

Leakiness

Se você está expressando um gene que pode ser tóxico, é importante que seu promotor induzível não seja muito vazante. Para promotores procarióticos induzíveis, o pLac é conhecido por ser ligeiramente vazado, e o pBad é provavelmente uma opção melhor, uma vez que a expressão pode ser reprimida pela glicose. Os promotores induzíveis à temperatura também são conhecidos por sua baixa taxa de vazamento.

Nível de inducibilidade

Quanto você quer induzir a transcrição do seu gene alvo? A força dos promotores induzíveis pode variar muito. Se você está procurando por alta indutividade, o sistema Tet-On pode ser uma boa escolha, pois está documentado para induzir transcrição >1.000 vezes quando ativado.

Tempo de atraso

O tempo necessário para induzir um determinado promotor varia. Promotores que requerem apenas a adição de um indutor externo, como os sistemas Tet, podem ser ativados muito rapidamente. Em contraste, sistemas promotores que requerem a transcrição de um repressor/indutor terão maior tempo de atraso devido ao tempo necessário para transcrição/tradução.

Muito obrigado a Nicole Zurcher que contribuiu para a redação deste artigo.

Recursos adicionais no Blog Addgene:

• Plasmids 101: A Região Promotora
• Plasmids 101: Cre-lox
• Sistemas de Dois Componentes Ligeiros para E. coli
• Navegue em outros posts do nosso blog da série Plasmids 101