Resultados
Acabamos de demonstrar inicialmente que a administração de cicloheximida, nas proximidades da indução da pilocarpina SE, bloqueou a MFS supragranular em ratos – mas não impediu o desenvolvimento subsequente de convulsões espontâneas nem afectou a sua frequência. Esses resultados forneceram, pela primeira vez, evidências diretas contra um papel causal da MFS supragranular na epileptogênese do lobo temporal. Uma possível explicação para esta dissociação é que a geração de convulsões nos modelos de pilocarpina e kainato da epilepsia poderia ser impulsionada por fontes extrahipocampais. De fato, as contribuições relativas do tálamo, amígdala e córtex piriforme no início das convulsões espontâneas nestes modelos foram indicadas em vários estudos.
Para abordar esta questão, usamos em seguida a pequena dose de aplicação intrahipocampal de ácido kainico. Aqui novamente, a ciclo-heximida foi capaz de bloquear completamente a MFS supragranular na maioria dos animais, sem alterar a frequência e intensidade dos eventos ictal e interictal do EEG espontâneo. Concluímos que também no modelo intrahipocampal de pequena dose de kainato, onde as convulsões espontâneas eram mais suscetíveis de iniciar no hipocampo injetado, a MFS supragranular não é necessária para a ocorrência de eventos ictal.
Dado que a maioria de nossas análises nos experimentos iniciais avaliou animais 2 meses após a lesão precipitante inicial, procuramos então investigar como a MFS supragranular seria afetada pelas convulsões espontâneas. Algumas publicações sobre este assunto têm mostrado que animais com convulsões mais frequentes têm uma MFS supragranular mais intensa, sugerindo assim que esta forma de reorganização sináptica está de alguma forma associada a uma maior propensão a convulsões (mesmo que não determine se as convulsões emergem ou não). Outros investigadores têm argumentado que a densidade de MFS supragranular não está associada ao número total de convulsões ao longo da vida ou à freqüência de convulsões (na epilepsia experimental ou no lobo temporal humano), e muitos autores já não consideram a MFS como um evento necessário ou suficiente na epilepsia do lobo temporal. No entanto, na condição humana não temos controle sobre o estado de fundo do tecido. E, na maioria dos estudos experimentais, SE foi necessário para o surgimento de convulsões – onde não há dúvida de que MFS supragranular é, em grande parte, o reflexo de um episódio anterior de SE. Ao produzir uma condição experimental na qual nenhum MFS supragranular foi derivado do episódio inicial do SE, pudemos investigar a contribuição relativa das convulsões espontâneas subseqüentes para essa reorganização sináptica. Concluímos que a MFS supragranular não mostrou nenhuma associação com a freqüência das convulsões espontâneas, e pareceu depender mais criticamente do tempo após a lesão inicial. De fato, sob esta condição, a MFS supragranular acabou se desenvolvendo em todos os animais, embora a um ritmo muito mais lento; além disso, não pareceu ser mais robusta em animais com maior freqüência de crises espontâneas recorrentes.
A descrição da dispersão de células granulares em tecido humano de pacientes com epilepsia do lobo temporal deu origem à sugestão de que mudanças de desenvolvimento poderiam estar na base da epilepsia subseqüente nesses pacientes. A demonstração, primeiro no modelo do rato pilocarpino e depois em ratos tratados com kainato, que roedores adultos poderiam desenvolver dispersão de células granulares indicou que estas alterações citocarquitetônicas também poderiam ser conseqüência do episódio inicial de precipitação da SE. A posterior demonstração de que a neurogênese das células granulares dentárias foi aumentada após a SE introduzir uma possibilidade adicional – que a plasticidade da rede hipocampal associada à epileptogênese poderia surgir de conexões aberrantes formadas por células granulares dentárias recém-nascidas. Nós, portanto, investigamos se a cicloheximida afetaria o início da MFS supragranular por meio do bloqueio da neurogênese das células granulares. Para nossa surpresa, observamos que a proliferação celular no DG está dramaticamente aumentada em animais epilépticos tratados com ciclo-heximida. A indução de SE em animais injetados apenas com pilocarpina levou a aumentos de 2-7 vezes na taxa mitótica das células granulares dentárias, em comparação com aumentos de 5-30 vezes para animais tratados com pilocarpina/ciclo-heximida. Sugerimos que tal aumento na taxa mitótica foi associado à proteção por ciclo-heximida de uma população de células precursoras vulneráveis que de outra forma degenerariam após a SE induzida pela pilocarpina. Sugerimos ainda que MFS e neurogênese de células granulares não estão necessariamente ligadas umas às outras. Esta dissociação é consistente com o achado de que a irradiação de animais submetidos à SE induzida por pilocarpina essencialmente aboliu a neurogênese das células granulares dentárias, mas falhou em prevenir a reorganização das fibras musculares na camada molecular dentária.
Registros de clampeamento de células inteiras em cortes hipocampais mostraram que a amplitude e freqüência das correntes espontâneas excitatórias pós-sinápticas nas células granulares aumentaram com o tempo após o tratamento com kainato. Este aumento da entrada sináptica excitatória foi correlacionado com a intensidade da mancha de Timm na camada molecular interna. Quando a inibição foi reduzida com bicuculina em fatias de animais tratados com kainato, a fotólise em flash do glutamato em gaiola aplicado na camada celular granular evocou explosões de potenciais de ação epilépticos (um efeito não visto nas células granulares de ratos de controle). Estes dados suportaram a hipótese de que a MFS supragranular induzida por kainato resulta na formação progressiva de conexões excitatórias aberrantes entre as células granulares. Para avaliar as alterações no perfil eletrofisiológico que resultariam do tratamento com cicloheximida, a eletrofisiologia in vitro (registros extracelulares) foi realizada 2 meses após a SE induzida por pilocarpina. Os potenciais evocados em fatias de pilocarpina- e pilocarpina/ciclo-heximídica de ratos tratados apresentaram atividade de polipropilação de pequena amplitude (respostas epilépticas) no CA1 e um pico populacional isolado aparentemente normal no DG. Mais importante, o DG em fatias de pilocarpina e pilocarpina/ciclo-heximida não diferiu em relação a anormalidades eletrofisiológicas, mesmo sob alto K+ ou alto K+/bicuculina. A análise da coloração neo-Timm, como esperado, revelou forte MFS supragranular em ratos injetados com pilocarpina e significativamente menos coloração em ratos pilocarpina/ciclo-heximida. Assim, a ocorrência de respostas anormais ao estímulo e atividades epilépticas induzidas por K+ ou K+/bicuculinas elevadas não dependeram do grau de MFS supragranular.
Uma pergunta de longa data sobre o desenvolvimento de MFS em modelos animais de SE é se as fibras musculares brotadas adicionariam novas sinapses aos dendritos na camada molecular – ou se essas fibras brotadas simplesmente substituiriam as sinapses vazias (devido à degeneração celular hilar). De fato, a maioria dos estudos sobre o assunto sugeriu a perda de células musgosas hilares, normalmente um importante alvo hilar das fibras musgosas de células granulares, como um fator importante para iniciar a MFS supragranular. A SE induzida por Pilocarpina na presença de ciclo-heximida resultou em um número reduzido de células hilares lesionadas em comparação com ratos não pré-tratados com ciclo-heximida. As células mossy presumidas, identificadas pelo peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) imunohistoquímica, não foram significativamente reduzidas em nenhum dos grupos 60 dias após o SE (dada a aparente inconsistência deste achado com uma preponderância de evidências indicando uma perda de células mossy SE, assumimos que a CGRP pode constituir um marcador de uma subpopulação de células mossy). Enquanto os controles tinham uma forte faixa de fibras CGRP-positivas (axônios de células musgosas putativas) e nenhuma fibra corada de neo-Timm na camada molecular interna, ratos tratados com pilocarpina não tinham fibras CGRP e forte coloração de neo-Timm. Os animais tratados com ciclo-heximida-pilocarpina, ao contrário, tinham coloração CGRP e neo-Timm semelhante aos controles. Concluímos que a ciclo-heximida poderia proteger células hilares CGRP-positivas durante a SE; ao permitir que essas células mantivessem sua projeção axonal normal, a MFS foi evitada – um cenário consistente com a hipótese de células mossy ‘irritáveis’ que depende da sobrevivência de células mossy para a hiperexcitabilidade da rede. Sugerimos que a ciclo-heximida previne a MFS supragranular induzida pelo SE, evitando a perda de células hilares CGRP-positivas (células mossy putativas).
O fato de que a ciclo-heximida protegeu as células hilares e aumentou ainda mais a proliferação celular no DG depois que o SE criou o cenário para uma hipótese que integra as observações atuais. Investigadores têm mostrado que algumas células granulares recém nascidas desenvolvem-se em locais anormais dentro do hilo. Estas células granulares ectópicas demonstram explosões regulares de potenciais de ação que são sincronizadas com descargas de células piramidais CA3 e explosões de neurônios hilares (incluindo células mossy). Além da formação de células ectópicas de grânulos hilares, vários artigos caracterizaram a formação de dendritos basais hilares em células de grânulos em animais epilépticos. Ambas as características certamente permitem sinapses aberrantes no hilo, seja por células ectópicas ou irritáveis ou em dendritos basais aberrantes, que podem ser responsáveis por alterações na hiperexcitabilidade – independentemente da presença de MFS supragranular.