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Yersinia pestis es el agente etiológico de la peste y tiene potencial para ser utilizado como arma biológica (1, 13, 17-20, 23). Por ello, es importante que la resistencia emergente a los fármacos, ya sea natural o manipulada, sea detectable mediante métodos estandarizados que se puedan aplicar fácilmente en múltiples laboratorios. El Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) describe un método de microdilución de caldo (BMD) de referencia para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Y. pestis y proporciona directrices de interpretación de la CIM para ocho agentes antimicrobianos (6). La BMD utiliza el caldo Mueller-Hinton ajustado por cationes (CAMHB) y requiere la incubación a 35°C durante 24 horas, con la opción de incubar durante 48 horas cuando el crecimiento a las 24 horas es insuficiente para la interpretación del punto final. Lamentablemente, la DMO de referencia es difícil de incorporar en muchos laboratorios porque es relativamente costosa y laboriosa y requiere el almacenamiento de paneles en un formato congelado o deshidratado. Existen varios métodos alternativos de pruebas de susceptibilidad, incluidos los métodos de difusión en disco y Etest. Sin embargo, antes de que estos métodos puedan emplearse para una especie, deben evaluarse y compararse con la DMO para determinar las correlaciones entre los resultados obtenidos por comparación de los métodos.

Los aislados de Y. pestis son fastidiosos y pueden crecer más lentamente en medios artificiales que otras especies comunes de Enterobacteriaceae, por lo que los métodos de prueba de susceptibilidad para Y. pestis han sido difíciles de estandarizar. En la literatura se describen varios métodos. La prueba de difusión en disco se ha realizado generalmente en agar Mueller-Hinton (MHA), utilizando normalmente 48 h de incubación a 35°C, pero las descripciones metodológicas carecen a veces de detalles (10, 16, 24). El método Etest fue empleado por Wong et al. (25) utilizando MHA con 5% de sangre de oveja, incubación a 35°C y un inóculo que coincide con un no. 1 McFarland en lugar del estándar de 0,5 McFarland utilizado en la mayoría de los estudios de difusión por disco o Etest. La dilución en agar, utilizando MHA incubado a 27° a 30°C durante 48 h, es el método más común reportado en la literatura (7, 8, 11, 12, 22). También se han utilizado los métodos de macrodilución en caldo y microdilución con varias temperaturas de incubación (2, 21).

Los métodos de difusión en disco y Etest tienen varios atributos que los convierten en métodos alternativos atractivos para las pruebas de susceptibilidad, como la facilidad de almacenamiento y la larga vida útil de los discos y las tiras. Además, son métodos basados en agar y los puntos finales pueden ser más fáciles de leer que los de DMO. El Etest tiene la ventaja añadida de producir un resultado MIC. En este informe, presentamos los resultados de un estudio multicéntrico que compara los métodos Etest y de difusión en disco con el método BMD de referencia del CLSI para las pruebas de susceptibilidad de Y. pestis.

(Este informe se presentó en parte en la 107ª Reunión General de la Sociedad Americana de Microbiología, Toronto, Canadá, del 21 al 25 de mayo de 2007.)

Veintis cepas diversas de Y. pestis procedentes de las colecciones de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) y del Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército de los Estados Unidos (USAMRIID) fueron analizadas por los métodos Etest y BMD en cuatro lugares de prueba y, además, por difusión en disco en dos de estos lugares. Seis cepas eran del biovar Antiqua, siete del biovar Medievalis y 12 del biovar Orientalis; un aislado atípico no pudo asignarse a ningún biovar. Los agentes antimicrobianos fueron probados tanto por BMD como por Etest (bioMérieux, Durham, NC), y sus rangos correspondientes fueron los siguientes para BMD y Etest, respectivamente: para el cloranfenicol, 0,03 a 64 μg/ml y 0,016 a 256 μg/ml; para la ciprofloxacina, 0,03 a 64 μg/ml y 0,002 a 32 μg/ml; para la doxiciclina, 0,03 a 64 μg/ml y 0.016 a 256 μg/ml; para la gentamicina, 0,03 a 64 μg/ml y 0,016 a 256 μg/ml; para la levofloxacina, 0,06 a 64 μg/ml y 0,002 a 32 μg/ml; para la estreptomicina, 0,03 a 64 μg/ml y 0.016 a 256 μg/ml; para la tetraciclina, 0,03 a 64 μg/ml y 0,016 a 256 μg/ml; y para el trimetoprim-sulfametoxazol, 0,015/32 a 16/304 μg/ml y 0,002/0,038 a 32/608 μg/ml. Debido a que los rangos para las pruebas de DMO de algunos fármacos no abarcaban las concentraciones más bajas obtenibles por el Etest, se consideró que la concordancia esencial (± 1 log2 de dilución) entre los métodos estaba fuera de la escala para algunas comparaciones de resultados (por ejemplo, una CIM de levofloxacina de DMO de ≤0,06 μg/ml y una CIM de Etest de 0,03 μg/ml). En el CDC se prepararon bandejas de MIC de 96 pocillos utilizando 100 μl de CAMHB (BBL, Sparks, MD) por pocillo; las bandejas se mantuvieron congeladas a -70 °C y se enviaron a los laboratorios participantes. Las pruebas se realizaron mediante los métodos estándar del CLSI para DMO y difusión en disco (4-6). Los inóculos se prepararon a partir de cultivos aeróbicos de 18 a 24 horas cultivados en placas de agar sangre de oveja al 5% (BBL) por el método de suspensión directa de colonias en caldo Mueller-Hinton (MHB) (Remel, Lenexa, KS) para igualar un estándar de turbidez de 0,5 McFarland (4); los mismos inóculos se utilizaron para inocular placas MHA de 150 mm de diámetro para las pruebas Etest y de difusión en disco. Inmediatamente después de la inoculación, se realizaron al menos dos recuentos aleatorios de colonias en cada lugar de la prueba con el pozo de control de crecimiento DMO positivo para evaluar el tamaño del inóculo. No se aplicaron más de cuatro tiras Etest en una placa. Para la difusión en disco, se aplicaron discos comerciales (BBL) con un dispensador multidisco de autoapriete (BBL). Los paneles BMD y las placas MHA, tanto para el Etest como para la difusión en disco, se incubaron a 35°C y se leyeron en períodos de 24 y 48 horas. Los Etest se leyeron según las indicaciones de los prospectos de Etest, de la siguiente manera: el cloranfenicol, la doxiciclina, la tetraciclina y el trimetoprim-sulfametoxazol se leyeron con una inhibición del 80% para el punto de intersección; la ciprofloxacina, la levofloxacina, la gentamicina y la estreptomicina se leyeron con una inhibición del 100%. Para los análisis de datos, las CIM de Etest se redondearon a la dilución log2 más cercana. Se utilizaron Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 para la DMO y el control de calidad del Etest. Las CMI de las cepas de control de calidad se determinaron mediante incubación durante 16 a 20 h. Los rangos aceptables de control de calidad de la DMO para la estreptomicina se establecieron previamente en el CDC (datos no publicados). El control de calidad del Etest de cloranfenicol se realizó probando Escherichia coli ATCC 25922 y aplicando el rango aceptable para la DMO del CLSI.

Para medir la concordancia entre los resultados del Etest y de la DMO, se examinó la distribución de las diferencias en las CIM por dilución log2 y se calculó el porcentaje de determinaciones de CIM que dieron valores idénticos (concordancia esencial dentro de los límites de precisión del método de referencia) para cada fármaco. Además, para determinar si el método Etest producía MICs significativamente más bajas o más altas que el método de referencia, realizamos una prueba de rango con signo de Wilcoxon con las MICs de dilución log2 de las dos pruebas mediante el uso del software estadístico SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC); las MICs dentro de ± 1 dilución log2 se consideraron idénticas para esta prueba. La comparación de los resultados de las categorías interpretativas (susceptibles, intermedias y resistentes) se realizó mediante el cálculo de las tasas de errores menores, mayores y muy mayores.

En general, los puntos finales de la CIM fueron más fácilmente discernibles por DMO que por Etest a las 24 h (datos no mostrados). En tres sitios de prueba (A, B y C), casi todas las MIC de BMD y Etest fueron legibles a las 24 h de incubación; un solo resultado de Etest fue la excepción. El sitio D informó de MICs de DMO legibles a las 24 horas para todas las cepas excepto una. No hubo crecimiento suficiente para leer las CIM de Etest a las 24 horas para ocho cepas en el sitio D. El número de CIM de Etest ilegibles debido a un crecimiento inadecuado a las 24 h por fármaco fue el siguiente: para el cloranfenicol, n = 6; para la ciprofloxacina, n = 4; para la doxiciclina, n = 3; para la gentamicina, n = 2; para la levofloxacina, n = 5; para la estreptomicina, n = 5; para la tetraciclina, n = 4; y para el trimetoprim-sulfametoxazol, n = 4. Todos los centros de ensayo pudieron leer todos los resultados a las 48 horas, por lo que se utilizaron los resultados de las 48 horas en la comparación. Los recuentos de colonias demostraron que las densidades de inóculo en los pozos de DMO estaban dentro de los límites aceptables para los cuatro sitios de prueba; los promedios para los sitios oscilaron entre 1,1 × 105 UFC/ml y 4,2 × 105 UFC/ml.

Se comparó la CIM90 y el rango de CIM para cada agente antimicrobiano por método (Tabla 1). Para todos los fármacos, excepto el cloranfenicol, las CIM90 de todos los métodos eran iguales o se encontraban dentro de una dilución de ± 1 log2. La concordancia de categoría entre los métodos Etest y BMD para todos los fármacos fue excelente, del 97% al 100%; todos los errores fueron menores (Tabla 1). Todas las MIC de BMD y Etest estaban dentro del rango de susceptibilidad después de 24 h de incubación (datos no mostrados). A las 48 h, la mayoría de las CIM estaban dentro del rango de susceptibilidad, excepto los siguientes resultados no susceptibles: cloranfenicol (n = 2); ciprofloxacina (n = 1); y estreptomicina (n = 5). La mayoría de los resultados no susceptibles procedían del método BMD y no del Etest (Fig. 1).

La mejor forma de comparar los dos métodos es analizando la concordancia esencial (los porcentajes de MIC dentro de ± 1 log2 de dilución para los dos métodos). La concordancia esencial para todos los sitios combinados (incluyendo las CIM fuera de escala) fue ≥90% para ciprofloxacina, doxiciclina, levofloxacina, estreptomicina y tetraciclina. Los valores de concordancia esencial para la gentamicina, el trimetoprim-sulfametoxazol y el cloranfenicol fueron inferiores, con un 88%, 78% y 35%, respectivamente. Excepto en el caso del cloranfenicol y el trimetoprim-sulfametoxazol, la concordancia esencial entre centros para cada medicamento fue generalmente escasa o nula (Tabla 3). Para el cloranfenicol y la trimetoprima-sulfametoxazol, la concordancia esencial entre los métodos de CMI en los distintos centros osciló entre el 4% y el 81% y entre el 58% y el 96%, respectivamente.

Las CIM de gentamicina y doxiciclina en Etest fueron significativamente (P = 0.03) más altas que las correspondientes CIM de la DMO (Tabla 2); sin embargo, los valores de concordancia esencial entre métodos para cada fármaco seguían siendo buenos, con un 88% y un 93%, respectivamente (Tabla 2). Las CIM de cloranfenicol, ciprofloxacina y trimetoprima-sulfametoxazol de Etest fueron, en promedio, significativamente (P < 0,001) más bajas que sus correspondientes CIM de DMO, y sólo la ciprofloxacina tuvo una concordancia esencial de ≥90%. En el caso de la levofloxacina, la estreptomicina y la tetraciclina, no se observaron diferencias estadísticas entre las CIM de Etest y de DMO.

Para la difusión en disco, todos los discos antimicrobianos, excepto los de estreptomicina, produjeron zonas de gran diámetro; algunas zonas superaron los 40 a 50 mm de diámetro (Tabla 4) y se superpusieron entre sí en la placa de MHA. Los márgenes de las zonas de los fármacos que producían estas grandes zonas eran a menudo difusos o indistintos. Dos aislados en un lugar de prueba tenían zonas ilegibles para todos los fármacos debido al escaso crecimiento a las 24 h. Los discos de cloranfenicol y trimetoprim-sulfametoxazol produjeron ocasionalmente un efecto de doble zona con un margen interior de crecimiento más claro, posiblemente debido a la actividad estática del fármaco con este organismo de crecimiento lento. Los discos de estreptomicina produjeron el tamaño medio de la zona de inhibición del disco más bajo (de 23 a 24 mm de diámetro) y las zonas más definidas y legibles. Los tamaños de las zonas de los otros tipos de discos tenían un promedio de 30 a 42 mm de diámetro a las 48 h, y sus diámetros eran más difíciles de leer.

En general, hubo una buena concordancia esencial entre el método Etest y el método DMO de referencia para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Sin embargo, los índices de concordancia esencial entre el Etest y el BMD para el cloranfenicol, la gentamicina y el trimetoprim-sulfametoxazol fueron inferiores al mínimo del 90% que recomienda la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el uso de un nuevo método en las pruebas clínicas (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Las diferencias en la intensidad de la iluminación en la cabina de seguridad biológica de cada centro de pruebas pueden ser un factor que contribuya a la determinación del punto final. Hemos comprobado que la lectura de un punto final Etest es más fácil cuando se coloca una lámpara de lectura en la cabina para complementar la fuente de luz. Todos los sitios, excepto el sitio D, utilizaron esta fuente de luz adicional para mejorar la legibilidad de las pruebas de susceptibilidad. Los Etests de tetraciclina y doxiciclina, al igual que los de cloranfenicol y trimetoprima-sulfametoxazol, también se leyeron con un punto final del 80%, pero no se observaron elipses dobles y la concordancia esencial fue ≥90% para ambos fármacos de la clase de la tetraciclina, por lo que parece que este fenómeno de Etest varía según la clase de fármaco para Y. pestis.

Para la gentamicina, la concordancia esencial general fue del 88%, justo por debajo del límite de concordancia recomendado del 90%. Dos sitios demostraron un acuerdo esencial alto (96%), pero el acuerdo fue menor (77% y 81%) para los otros dos sitios. Se desconoce la razón de esta variabilidad. Sin embargo, las distribuciones generales de las CMI de Etest y DMO son similares (Fig. 1). Se ha sugerido que, para los nuevos métodos de susceptibilidad que se llevan a cabo con organismos de crecimiento lento o fastidiosos, las pruebas deberían ser menos rígidas con respecto a esta norma y que es permisible un acuerdo esencial más bajo (14). Esta lógica parece apropiada para el Etest de gentamicina, ya que la concordancia esencial fue del 88%. La aceptabilidad del Etest de trimetoprim-sulfametoxazol con una concordancia esencial del 78% no está clara.

Una limitación de este estudio fue que no se incluyeron aislados con resistencia conocida. El acceso a las cepas resistentes a los medicamentos de Madagascar (3, 9-11) es restringido. Otros informes de resistencia a los medicamentos en Y. pestis son raros, y las cepas resistentes no están bien caracterizadas (15, 16, 24). Por lo tanto, no pudimos evaluar la capacidad del método Etest para detectar la resistencia conocida en Y. pestis.

El método de difusión en disco no se recomienda para Y. pestis debido a la dificultad de leer las zonas de inhibición mal definidas y los grandes diámetros de zona encontrados con la mayoría de los fármacos probados. La prueba del disco de estreptomicina puede justificar un estudio adicional si los aislados resistentes a la estreptomicina son accesibles, porque los tamaños de las zonas eran más pequeños y más definidos que los obtenidos con otros discos.

En resumen, en una comparación de dos métodos de CMI para la prueba de susceptibilidad de Y. pestis, los resultados para todos los agentes antimicrobianos se correlacionaron bien entre el Etest y el DMO, excepto para el cloranfenicol y el trimetoprim-sulfametoxazol, para los que los puntos finales fueron difíciles de determinar por el Etest. También hubo una mayor variabilidad entre centros para el cloranfenicol y el trimetoprim-sulfametoxazol que para los demás fármacos. El método Etest parece ser una alternativa aceptable a la DMO para la ciprofloxacina, la doxiciclina, la gentamicina, la levofloxacina, la estreptomicina y la tetraciclina, pero no para el cloranfenicol y el trimetoprim-sulfametoxazol. Dado que Y. pestis creció lentamente en MHA, se recomienda 48 h de incubación para el Etest. Sin embargo, como no pudimos incluir ninguna cepa de Y. pestis resistente a los fármacos en nuestro estudio, también se recomienda que las CIM de Etest no susceptibles se confirmen mediante una prueba de CIM de DMO de referencia. También aconsejamos que se realicen pruebas BMD confirmatorias en cualquier aislado de Y. pestis con una CIM Etest de ciprofloxacino o levofloxacino de 0,25 μg/ml, una CIM en el extremo superior del rango de susceptibilidad, ya que se desconoce si se puede detectar la resistencia emergente para estos dos fármacos mediante el método Etest.