Results

Początkowo wykazaliśmy, że podanie cykloheksymidu, w bezpośredniej bliskości indukcji SE pilokarpiną, blokowało nadczaszkowe MFS u szczurów – ale nie zapobiegało późniejszemu rozwojowi spontanicznych napadów ani nie wpływało na ich częstotliwość. Wyniki te dostarczyły, po raz pierwszy, bezpośrednich dowodów przeciwko przyczynowej roli nadczaszkowego MFS w epileptogenezie płatów skroniowych. Jednym z możliwych wyjaśnień tej dysocjacji jest to, że generowanie napadów w modelach pilokarpinowych i kainianowych padaczki może być napędzane przez źródła pozapokampowe. Rzeczywiście, względne wkłady wzgórza, amygdala i kory piriform w inicjacji spontanicznych napadów w tych modelach zostały wskazane w wielu badaniach.

Aby rozwiązać ten problem, użyliśmy następnie małej dawki wewnątrzhipokampowej aplikacji kwasu kainowego. Tutaj ponownie, cykloheksymid był w stanie całkowicie zablokować supragranularne MFS u większości zwierząt, bez zmiany częstości i intensywności spontanicznych zdarzeń EEG ictal i interictal. Stwierdziliśmy, że również w modelu wewnątrzhipokampowym małych dawek kainianu, gdzie spontaniczne napady były bardziej prawdopodobne, aby zainicjować wstrzyknięty hipokamp, nadczaszkowy MFS nie jest konieczny do wystąpienia zdarzeń ictal.

Biorąc pod uwagę, że większość naszych analiz w początkowych eksperymentach oceniała zwierzęta 2 miesiące po początkowym uszkodzeniu poprzedzającym, staraliśmy się zbadać, w jaki sposób na nadczaszkowy MFS wpłynęłyby spontaniczne napady. Niektóre publikacje na ten temat wykazały, że zwierzęta z częstszymi napadami mają bardziej intensywne nadczaszkowe MFS, sugerując w ten sposób, że ta forma reorganizacji synaptycznej jest w jakiś sposób związana z większą skłonnością do napadów (nawet jeśli nie decyduje o tym, czy napady się pojawią, czy nie). Inni badacze twierdzą, że gęstość supragranularnych MFS nie jest związana z całkowitą liczbą napadów w ciągu całego życia ani z częstością napadów (w doświadczalnej lub ludzkiej padaczce płata skroniowego), a wielu autorów nie uważa już MFS za konieczne lub wystarczające wydarzenie w padaczce płata skroniowego. Jednak w warunkach ludzkich nie mamy wpływu na stan tła tkanki. A w większości badań eksperymentalnych do pojawienia się napadów konieczne było SE – gdzie nie ma wątpliwości, że nadgranularne MFS jest w dużej mierze odbiciem poprzedzającego epizodu SE. Poprzez stworzenie warunków eksperymentalnych, w których żaden nadczaszkowy MFS nie pochodził z początkowego epizodu SE, byliśmy w stanie zbadać względny udział kolejnych spontanicznych napadów w tej synaptycznej reorganizacji. Stwierdziliśmy, że nadczaszkowe MFS nie wykazywało żadnego związku z częstością spontanicznych napadów i wydawało się zależeć bardziej krytycznie od czasu po początkowym uszkodzeniu. Rzeczywiście, w tych warunkach, nadczaszkowe MFS ostatecznie rozwinęło się u wszystkich zwierząt, nawet jeśli w znacznie wolniejszym tempie; dalej, nie wydawało się być bardziej wytrzymałe u zwierząt z większą częstotliwością nawracających spontanicznych napadów.

Opis rozproszenia komórek ziarnistych w tkance ludzkiej od pacjentów z padaczką płata skroniowego dał początek sugestii, że zmiany rozwojowe mogą leżeć u podstaw późniejszej padaczki u tych pacjentów. Wykazanie, najpierw w modelu szczurzym z pilokarpin±, a następnie u myszy leczonych kainianem, że u dorosłych gryzoni może doj¶ć do dyspersji komórek ziarnistych, wskazywało, że te zmiany cytoarchitetoniczne mog± być również konsekwencj± pocz±tkowego epizodu wyzwalaj±cego SE. Późniejsze wykazanie, że neurogeneza komórek ziarnistości zębatych jest zwiększona po SE wprowadziło dodatkową możliwość – że plastyczność sieci hipokampa związana z epileptogenezą może wynikać z nieprawidłowych połączeń tworzonych przez nowo narodzone komórki ziarnistości zębatych. Zbadaliśmy zatem, czy cykloheksymid może wpływać na pojawienie się nadgranulowych MFS poprzez blokowanie neurogenezy komórek ziarnistych. Ku naszemu zaskoczeniu zaobserwowaliśmy, że proliferacja komórek w DG jest dramatycznie zwiększona u zwierząt z padaczką, którym podawano cykloheksymid. Indukcja SE u zwierząt, którym wstrzyknięto samą pilokarpinę, prowadziła do 2-7-krotnego wzrostu tempa mitotycznego komórek ziarnistości zębatych, w porównaniu z 5-30-krotnym wzrostem u zwierząt, którym podawano pilokarpinę/cykloheksymid. Zasugerowaliśmy, że takie zwiększone tempo mitotyczne było związane z ochroną przez cykloheksymid wrażliwej populacji komórek prekursorowych, które w przeciwnym razie uległyby degeneracji po SE wywołanym pilokarpiną. Ponadto zasugerowaliśmy, że MFS i neurogeneza komórek ziarnistych niekoniecznie są ze sobą powiązane. Ta dysocjacja jest zgodna z odkryciem, że napromieniowanie zwierząt poddanych SE wywołanej pilokarpiną zasadniczo zniosło neurogenezę komórek ziarnistości zębatych, ale nie zapobiegło reorganizacji włókien mossy w warstwie molekularnej zębatej.

Whole cell patch-clamp recordings in hippocampal slices had shown that the amplitude and frequency of spontaneous excitatory postsynaptic currents in granule cells increased with time after kainate treatment. To zwiększone pobudzające wejście synaptyczne było skorelowane z intensywnością barwienia Timm w wewnętrznej warstwie molekularnej. Kiedy inhibicja została zmniejszona za pomocą biklukuliny w plastrach pochodzących od zwierząt leczonych kainianem, fotoliza błyskowa klatkowego glutaminianu zastosowana w warstwie komórek ziarnistych wywołała epileptyczne wybuchy potencjałów czynnościowych (efekt ten nie był obserwowany w komórkach ziarnistych pochodzących od szczurów kontrolnych). Dane te potwierdzają hipotezę, że wywołany przez kainian nadnamiotowy MFS prowadzi do stopniowego tworzenia się nieprawidłowych połączeń pobudzających między komórkami ziarnistymi. Aby ocenić zmiany w profilu elektrofizjologicznym, które mogłyby wynikać z leczenia cykloheksymidem, wykonano elektrofizjologię in vitro (zapisy zewnątrzkomórkowe) 2 miesiące po SE wywołanym pilokarpiną. Potencjały wywołane w plastrach pochodzących od szczurów leczonych pilokarpiną i pilokarpiną/cykloheksymidem wykazywały aktywność polipikularną o małej amplitudzie (odpowiedzi epileptyczne) w CA1 i pozornie normalny izolowany pik populacyjny w DG. Co ważniejsze, DG w plastrach pochodzących od zwierząt leczonych pilokarpiną i pilokarpiną/cycloheksymidem nie różniła się pod względem zaburzeń elektrofizjologicznych, nawet w warunkach wysokiego K+ lub wysokiego K+/cykloheksuliny. Analiza barwienia neo-Timm, zgodnie z oczekiwaniami, ujawniła silny nadgranularny MFS u szczurów szczepionych pilokarpiną i znacząco mniejszy stopień barwienia u szczurów szczepionych pilokarpiną/cykloheksymidem. Tak więc występowanie nieprawidłowych odpowiedzi na bodźce i aktywności epileptycznych wywołanych wysokim K+- lub wysokim K+/bikuliną nie zależało od stopnia nadczaszkowego MFS.

Jednym z od dawna stawianych pytań dotyczących rozwoju MFS w zwierzęcych modelach SE jest to, czy kiełkujące włókna mossy dodawały nowe synapsy do dendrytów w warstwie molekularnej – czy też te kiełkujące włókna po prostu zastępowały opróżnione synapsy (z powodu degeneracji komórek wnęk). W istocie większość badań na ten temat sugeruje utratę komórek mszystych we wnęce, normalnie głównego celu włókien mszystych z komórek ziarnistych we wnęce, jako ważny czynnik inicjujący nadczaszkowe MFS. SE wywołane pilokarpiną w obecności cykloheksymidu spowodowało zmniejszenie liczby uszkodzonych komórek wnęk w porównaniu ze szczurami, którym nie podawano cykloheksymidu. Przypuszczalne komórki mszyste, zidentyfikowane przez immunohistochemię peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP), nie były znacząco zmniejszone w żadnej z grup 60 dni po SE (biorąc pod uwagę pozorną niespójność tego odkrycia z przewagą dowodów wskazujących na utratę komórek mszystych SE, zakładamy, że CGRP może stanowić marker subpopulacji komórek mszystych). Podczas gdy kontrola miała silne pasmo włókien CGRP-pozytywnych (putative mossy cell axons) i brak neo-Timm barwionych włókien w wewnętrznej warstwie molekularnej, szczury leczone pilokarpiną nie miały włókien CGRP i silne barwienie neo-Timm. Zwierzęta leczone cykloheksymidem i pilokarpiną, w przeciwieństwie do nich, miały barwienie CGRP i neo-Timm podobne do kontroli. Stwierdziliśmy, że cykloheksymid może chronić komórki CGRP-dodatnie we wnęce podczas SE; pozwalając tym komórkom na zachowanie normalnej projekcji aksonalnej, zapobiega się MFS – scenariusz zgodny z hipotezą „drażliwych” komórek mossy, która opiera się na przetrwaniu komórek mossy dla nadpobudliwości sieci. Zasugerowaliśmy, że cykloheksymid zapobiega nadnamiotowemu MFS wywołanemu przez SE poprzez zapobieganie utracie komórek CGRP-dodatnich we wnękach (przypuszczalne komórki mossy).

Fakt, że cykloheksymid chronił komórki we wnękach i dalej zwiększał proliferację komórek w DG po SE, stworzył ustawienie dla hipotezy, która integruje obecne obserwacje. Badacze wykazali, że niektóre nowo narodzone komórki ziarniste rozwijają się w nieprawidłowych lokalizacjach w obrębie wzgórza. Te ektopowe komórki ziarniste wykazują regularne wybuchy potencjałów czynnościowych, które są zsynchronizowane z wyładowaniami pękających komórek piramidowych CA3 oraz z wybuchami neuronów wnękowych (w tym komórek mszystych). Oprócz powstawania ektopowych komórek hilarnych granulocytów, w kilku artykułach opisywano powstawanie hilarnych dendrytów podstawnych na komórkach granulocytów u zwierząt z padaczką. Obie cechy z pewnością umożliwiają powstawanie nieprawidłowych synaps we wzgórzu, zarówno przez ektopowe lub drażliwe komórki, jak i w nieprawidłowych dendrytach podstawnych, co może odpowiadać za zmiany w nadpobudliwości – niezależnie od obecności nadnamiotowego MFS.

.