Promotors regelen de binding van RNA polymerase en transcriptiefactoren. Aangezien de promotor de transcriptie van een doelgen aanstuurt, bepaalt hij de timing van de genexpressie en bepaalt hij in grote mate de hoeveelheid recombinant eiwit die zal worden geproduceerd. Veel veel voorkomende promotors, zoals de CMV-, EF1A- en SV40-promotors, zijn altijd actief en worden daarom constitutieve promotors genoemd. Andere zijn alleen actief onder specifieke omstandigheden. In dit artikel bespreken we induceerbare promotors, die van een UIT- naar een AAN-status kunnen worden geschakeld, en hoe je die in je onderzoek zou kunnen gebruiken. Als je klaar bent met dit artikel, bekijk dan ons vervolgartikel over onderdrukbare promotors.

Hoe worden induceerbare promotors gereguleerd?

Induceerbare promotors kunnen worden gereguleerd door positieve of negatieve controle.

Positief induceerbaar

In de UIT-toestand is de promotor inactief omdat het activatie-eiwit zich niet kan binden. Nadat een inducer aan het activator-eiwit heeft gebonden, kan het activator-eiwit zich aan de promoter binden, waardoor deze wordt ingeschakeld en de transcriptie in gang wordt gezet.

Negatief induceerbaar

In de UIT-toestand is de promoter inactief omdat een gebonden repressor-eiwit de transcriptie actief verhindert. Zodra een inducer het repressor-eiwit bindt, wordt het repressor-eiwit van het DNA verwijderd. Als het repressoreiwit afwezig is, wordt de transcriptie ingeschakeld.

Typen induceerbare promotors

Chemische stoffen, temperatuur en licht zijn allemaal voorbeelden van factoren die kunnen leiden tot de inductie van een promotor. Hieronder vindt u een korte beschrijving van deze drie typen induceerbare promotors, en voorbeelden van elk type. Veel van deze promotorsystemen zijn beschikbaar bij Addgene!

Chemisch induceerbare promotors

Chemisch gereguleerde promotors behoren tot de meest voorkomende induceerbare promotors. Het positief induceerbare tetracycline ON (Tet-On) systeem, een veelzijdig instrument dat is ontwikkeld voor gebruik in prokaryoten en eukaryoten, werkt via directe activering. In dit systeem is de activator rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) normaal inactief en kan hij de tetracycline-responselementen (TRE) in een promotor niet binden. Tetracycline en zijn derivaten dienen als inducerend middel om promoteractivatie mogelijk te maken.

Een van de meest gebruikte prokaryote promoters is de negatief induceerbare pLac promoter. Deze promotor vereist verwijdering van de lac-repressor (lacI-eiwit) om transcriptie te activeren. In aanwezigheid van lactose of het lactose-analogon IPTG ondergaat de lac-repressor een conformatieverandering die hem verwijdert van de lacO-plaatsen in de promoter en de repressie van het doelgen beëindigt. Een vereenvoudigd lac induceerbaar systeem is te vinden in veel bacteriële expressievectoren.

Negatieve induceerbare promotor pBad is een andere populaire prokaryotische promotor die vaak wordt gebruikt voor bacteriële eiwitzuivering. Wanneer arabinose afwezig is, bindt het regulerende eiwit AraC O- en I1-plaatsen stroomopwaarts van pBad, waardoor de transcriptie wordt geblokkeerd. Toevoeging van arabinose zorgt ervoor dat AraC de I1- en I2-plaatsen bindt, zodat de transcriptie kan beginnen. Naast arabinose kan ook cAMP in complex met cAMP-activator-eiwit (CAP) de binding van AraC aan I1- en I2-plaatsen stimuleren. Aanvulling van celgroeimedium met glucose verlaagt cAMP en onderdrukt pBad, waardoor de lekheid van de promotor afneemt.

Andere voorbeelden van chemisch geïnduceerde promotors zijn positief induceerbare alcohol- en steroïdengereguleerde promotors die vaak in plantenonderzoek worden gebruikt.

Promoter Subtype	Promoter Voorbeeld	Activator	Addgene Plasmid/Kit
Alcohol-gereguleerd	AlcA promoter	AlcR	pGGA008 (AlcA) en pGGC011 (AlcR) uit rode vlam GreenGate kit
Steroïd-gereguleerde	LexA-promotor	XVE (synthetisch)	pFZ19 (gele vlam)

Temperatuurinduceerbare promotors

Temperatuurgevoelige expressiesystemen zijn typisch minder lek dan chemisch geïnduceerde promotors; Zij vertonen vrijwel geen expressie bij normale temperaturen, maar kunnen worden geïnduceerd door blootstelling aan hitte of koude. Voorbeelden hiervan zijn de van een hitteschok afgeleide, induceerbare promotors Hsp70 of Hsp90, waarin een gen naar keuze alleen tot expressie komt na blootstelling aan een korte hitteschok. In het geval van Hsp70 komt door de hitteschok hitteschokfactor 1 (HSF-1) vrij, die zich vervolgens bindt aan hitteschokelementen in de promoter, waardoor de transcriptie wordt geactiveerd. Addgene-depoters hebben heat shock-induceerbare Cre en Cas9 ontwikkeld voor eenvoudige genoom-engineering in soorten als C. elegans en Drosophila.

Lichtinduceerbare promotors

Licht is een andere manier om genexpressie te activeren, en twee-componentensystemen die in de synthetische biologie worden gebruikt, gebruiken licht om de transcriptie te reguleren. De rode vlam plasmide pDawn bevat de blauw-licht sensing proteïne YFI. Wanneer er geen licht is, fosforyleert YFI FixJ, dat zich bindt aan de FixK2-promotor om transcriptie van de faag-repressor cI te induceren. Repressor cI remt de transcriptie van de faagpromotor pR, waardoor expressie van een reportergen wordt voorkomen. Wanneer er licht aanwezig is, is YFI inactief, waardoor de synthese van repressor cI wordt verhinderd en de transcriptie van het reportergen kan plaatsvinden. Addgene heeft ook geelvlamlichtgereguleerde tweecomponentsystemen, ontworpen door het Tabor-lab.

Welke induceerbare promotor is geschikt voor mij?

Hier volgt een lijst van enkele belangrijke variabelen die u moet overwegen bij het kiezen van een induceerbare promotor.

Experimenteel systeem

Omdat de transcriptiemachinerie verschilt tussen celtypen of organismen, zijn promotors op vergelijkbare wijze variabel. Bacteriële promotors werken alleen in prokaryote cellen en meestal alleen in dezelfde of nauw verwante soorten waarvan zij zijn afgeleid. Evenzo vereisen de verschillende eukaryote celtypes (zoogdieren, gist, planten, enz.) unieke promotors en is er zeer weinig kruisbestuiving. Het inductiemechanisme moet ook compatibel zijn met uw experimenteel systeem.

Leekheid

Als u een gen tot expressie brengt dat toxisch kan zijn, is het belangrijk dat uw induceerbare promotor niet te lek is. Voor induceerbare prokaryote promotors is pLac bekend als enigszins lek, en pBad is waarschijnlijk een betere optie omdat expressie onderdrukt kan worden door glucose. Temperatuur induceerbare promotors staan ook bekend om hun lage lekheid.

Induceerbaarheidsniveau

Hoe sterk wil je de transcriptie van je doelgen induceren? De sterkte van induceerbare promotors kan sterk variëren. Als u op zoek bent naar hoge induceerbaarheid, kan het Tet-On systeem een goede keuze zijn, omdat het is gedocumenteerd om transcriptie >1.000-voudig te induceren wanneer geactiveerd.

Lag tijd

De tijd die nodig is om een bepaalde promotor te induceren varieert. Promotors die alleen de toevoeging van een externe inducer vereisen, zoals Tet-systemen, kunnen zeer snel worden geactiveerd. Daarentegen zullen promotorsystemen die transcriptie van een repressor/inducer vereisen een hogere vertragingstijd hebben als gevolg van de tijd die nodig is voor transcriptie/translatie.

Met veel dank aan Nicole Zurcher die heeft bijgedragen aan het schrijven van dit artikel.

Bronnen op de Addgene Blog:

• Plasmiden 101: De promotor regio
• Plasmiden 101: Cre-lox
• Licht-omschakelbare twee-component systemen voor E. coli
• Bekijk andere blog posts uit onze Plasmiden 101 serie