Resultaten

Wij toonden aanvankelijk aan dat toediening van cycloheximide, dicht bij de inductie van pilocarpine SE, supragranulaire MFS blokkeerde bij ratten – maar de daaropvolgende ontwikkeling van spontane aanvallen niet verhinderde, noch de frequentie ervan beïnvloedde. Deze resultaten leverden, voor de eerste keer, direct bewijs tegen een causale rol voor supragranulaire MFS in de temporale kwab epileptogenese. Een mogelijke verklaring voor deze dissociatie is dat het ontstaan van aanvallen in de pilocarpine en kainaat modellen van epilepsie zou kunnen worden aangedreven door extrahippocampale bronnen. Inderdaad, de relatieve bijdragen van thalamus, amygdala, en piriforme cortex in de initiatie van spontane aanvallen in deze modellen zijn aangegeven in een aantal studies.

Om deze kwestie aan te pakken, gebruikten we vervolgens de kleine dosis intrahippocampale toepassing van kininezuur. Ook hier was cycloheximide in staat om supragranulaire MFS volledig te blokkeren in de meeste dieren, zonder de frequentie en intensiteit van spontane ictale en interictale EEG gebeurtenissen te veranderen. We concludeerden dat ook in het intrahippocampale kleine dosis kainaat model, waar spontane aanvallen meer kans hadden om te beginnen in de geïnjecteerde hippocampus, supragranulaire MFS niet noodzakelijk is voor het optreden van ictale gebeurtenissen.

Gezien het feit dat de meeste van onze analyses in de initiële experimenten dieren evalueerden 2 maanden na het initiële precipiterende letsel, trachtten we vervolgens te onderzoeken hoe supragranulaire MFS zou worden beïnvloed door de spontane aanvallen. Sommige publicaties over dit onderwerp hebben aangetoond dat dieren met frequentere aanvallen een meer intense supragranulaire MFS hebben, wat suggereert dat deze vorm van synaptische reorganisatie op een of andere manier geassocieerd is met een grotere neiging om toe te slaan (zelfs als het niet bepaalt of aanvallen al dan niet optreden). Andere onderzoekers hebben betoogd dat de dichtheid van supragranulaire MFS niet geassocieerd is met het totale aantal aanvallen gedurende de hele levensloop of de frequentie van de aanvallen (in experimentele of menselijke temporale kwab epilepsie), en veel auteurs beschouwen MFS niet langer als een noodzakelijke of voldoende gebeurtenis bij temporale kwab epilepsie. In de menselijke conditie hebben we echter geen controle over de achtergrondstatus van het weefsel. En in de meeste experimentele studies was SE vereist voor het ontstaan van aanvallen – waarbij er geen twijfel over bestaat dat supragranulaire MFS grotendeels de weerspiegeling is van een voorafgaande SE episode. Door een experimentele conditie te creëren waarin geen supragranulaire MFS werd afgeleid van de initiële SE episode, waren we in staat om de relatieve bijdrage van daaropvolgende spontane aanvallen aan deze synaptische reorganisatie te onderzoeken. We concludeerden dat supragranulaire MFS geen associatie vertoonde met de frequentie van spontane aanvallen, en meer kritisch leek af te hangen van de tijd na de initiële verwonding. Inderdaad, onder deze conditie ontwikkelde supragranulaire MFS zich uiteindelijk in alle dieren, zij het in een veel langzamer tempo; verder leek het niet robuuster te zijn in dieren met een grotere frequentie van terugkerende spontane aanvallen.

De beschrijving van granule celdispersie in menselijk weefsel van patiënten met temporaalkwab epilepsie gaf aanleiding tot de suggestie dat ontwikkelingsveranderingen aan de basis zouden kunnen liggen van de latere epilepsie in die patiënten. De demonstratie, eerst in het pilocarpine rattenmodel en later in met kainaat behandelde muizen, dat volwassen knaagdieren granule celdispersie kunnen ontwikkelen, gaf aan dat deze cytoarchitetonische veranderingen ook het gevolg zouden kunnen zijn van de initiële neerslaande episode van SE. De daaropvolgende demonstratie dat neurogenese van dentate granule cellen verhoogd was na SE introduceerde een extra mogelijkheid – dat hippocampale netwerk plasticiteit geassocieerd met epileptogenese zou kunnen ontstaan uit afwijkende verbindingen gevormd door nieuw geboren dentate granule cellen. We onderzochten daarom of cycloheximide het ontstaan van supragranulaire MFS zou beïnvloeden door het blokkeren van granule cel neurogenese. Tot onze verrassing zagen we dat de celproliferatie in de DG dramatisch toeneemt in epileptische dieren behandeld met cycloheximide. Inductie van SE in dieren geïnjecteerd met pilocarpine alleen leidde tot 2-7-voudige toenames in de mitotische snelheid van dentate granule cellen, vergeleken met 5-30-voudige toenames voor pilocarpine/cycloheximide-behandelde dieren. Wij suggereerden dat deze verhoogde mitotische aantallen geassocieerd waren met een bescherming door cycloheximide van een kwetsbare precursorcel populatie die anders zou degenereren na pilocarpine-geïnduceerde SE. We suggereerden verder dat MFS en neurogenese van granule cellen niet noodzakelijk met elkaar verbonden zijn. Deze dissociatie is consistent met de bevinding dat bestraling van dieren onderworpen aan pilocarpine-geïnduceerde SE in wezen de dentate granule cel neurogenese afschafte, maar de mosy fiber reorganisatie in de dentate moleculaire laag niet voorkwam.

Whole cell patch-clamp opnamen in hippocampale plakjes hadden aangetoond dat de amplitude en frequentie van spontane excitatoire postsynaptische stromen in granule cellen toenam met de tijd na kainate behandeling. Deze verhoogde excitatoire synaptische input was gecorreleerd met de intensiteit van de Timm kleuring in de binnenste moleculaire laag. Wanneer inhibitie werd verminderd met bicuculline in plakjes van met kainaat behandelde dieren, wekte flitsfotolyse van gekooid glutamaat toegepast in de granule cel laag epileptiforme uitbarstingen van actiepotentialen op (een effect dat niet werd gezien in granule cellen van controle ratten). Deze gegevens ondersteunen de hypothese dat kainaat-geïnduceerde supragranulaire MFS resulteert in de progressieve vorming van afwijkende excitatoire verbindingen tussen de granule cellen. Om de veranderingen in het elektrofysiologische profiel te evalueren die het gevolg zouden zijn van cycloheximide behandeling, werd in vitro elektrofysiologie (extracellulaire opnamen) uitgevoerd 2 maanden na pilocarpine-geïnduceerde SE. Evoked potentials in plakjes van pilocarpine- en pilocarpine/cycloheximide-behandelde ratten vertoonden kleine amplitude polyspiking activiteit (epileptiforme responsen) in CA1 en een schijnbaar normale geïsoleerde populatie spike in DG. Belangrijker is dat de DG in plakjes van pilocarpine en pilocarpine/cycloheximide dieren niet verschilden met betrekking tot elektrofysiologische afwijkingen, zelfs onder hoge K+ of hoge K+/bicuculline. Analyse van de neo-Timm kleuring, zoals verwacht, onthulde sterke supragranulaire MFS in pilocarpine-geïnjecteerde ratten en beduidend minder kleuring in pilocarpine/cycloheximide ratten. Het optreden van abnormale stimulusreacties, en hoge K+- of hoge K+/bicuculline-geïnduceerde epileptiforme activiteiten, was dus niet afhankelijk van de mate van supragranulaire MFS.

Een reeds lang bestaande vraag met betrekking tot de ontwikkeling van MFS in diermodellen van SE is of gekiemde mosvezels nieuwe synapsen zouden toevoegen aan de dendrieten in de moleculaire laag – of dat deze gekiemde vezels eenvoudigweg vrijgekomen synapsen (als gevolg van degeneratie van de hilaire cellen) vervingen. De meeste studies over dit onderwerp suggereren het verlies van hilaire moscellen, normaal een belangrijk hilair doelwit van granule cell mosvezels, als een belangrijke factor in het initiëren van supragranulaire MFS. Pilocarpine-geïnduceerde SE in aanwezigheid van cycloheximide resulteerde in een verminderd aantal beschadigde hilacellen in vergelijking met ratten die niet werden voorbehandeld met cycloheximide. Veronderstelde moscellen, geïdentificeerd door calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP) immunohistochemie, waren niet significant verminderd in beide groepen 60 dagen na SE (gezien de schijnbare inconsistentie van deze bevinding met een overwicht aan bewijsmateriaal dat wijst op een verlies van moscellen SE, nemen we aan dat CGRP een marker van een sub-populatie van moscellen zou kunnen zijn). Terwijl de controles een sterke band van CGRP-positieve vezels (vermoedelijke moscellen axonen) hadden en geen neo-Timm gekleurde vezels in de binnenste moleculaire laag, hadden pilocarpine behandelde ratten geen CGRP-vezels en sterke neo-Timm kleuring. Cycloheximide-pilocarpine behandelde dieren, daarentegen, hadden CGRP en neo-Timm kleuring vergelijkbaar met de controles. We concludeerden dat cycloheximide de hilaire CGRP-positieve cellen kon beschermen tijdens SE; door deze cellen in staat te stellen hun normale axonale projectie te behouden, werd MFS voorkomen – een scenario dat consistent is met de ‘prikkelbare’ mossy cel hypothese die berust op de overleving van mossy cellen voor netwerk hyperexciteerbaarheid. Wij suggereerden dat cycloheximide SE-geïnduceerde supragranulaire MFS voorkomt door het verlies van hilaire CGRP-positieve cellen (vermoedelijke mossy cellen) te voorkomen.

Het feit dat cycloheximide hilaire cellen beschermde en de celproliferatie in de DG na SE verder verhoogde, creëerde de setting voor een hypothese die huidige observaties integreert. Onderzoekers hebben aangetoond dat sommige nieuw geboren granule cellen zich ontwikkelen op abnormale plaatsen binnen de hilus. Deze ectopische granule cellen vertonen regelmatige uitbarstingen van actiepotentialen die gesynchroniseerd zijn met CA3 piramidale cel uitbarstingen en de uitbarstingen van hilaire neuronen (inclusief mosy cellen). Naast de vorming van ectopische hilaire granule cellen, karakteriseerden verschillende artikelen de vorming van hilaire basale dendrieten op granule cellen bij epileptische dieren. Beide kenmerken maken zeker afwijkende synapsen in de hilus mogelijk, hetzij door ectopische of prikkelbare cellen of in afwijkende basale dendrieten, hetgeen veranderingen in hyperexciteerbaarheid kan verklaren – ongeacht de aanwezigheid van supragranulaire MFS.