Aanhangsel A: Verdere inzichten in de ruimtelijke organisatie van crista en haarcellen

De globale vorm van de cristae varieert naargelang de soort. Hij werd beschreven voor anamniotes (vissen en amfibieën), en voor amniotes (reptielen, vogels, zoogdieren).

Bij vissen is de crista van alle SCC’s zadelvormig en smal in het centrum. Bij verticale SCC’s is de crista breder aan de twee componenten van de grens (planum semilunatum genoemd). Bij kikkers hebben de cristae van de verticale SCC’s een haltervorm, met een prominent gewelfd oppervlak in het midden, maar de crista van het laterale kanaal heeft een enkele knotsvormige receptorzone die zich aan één uiteinde bevindt. Vanuit deze vergrote receptorzone steekt een enkele cupulaire massa uit langs de wand om de apex te bereiken, en een iets dunner gedeelte ontspringt uit de rest van de receptorzone van de crista en voltooit het grootste deel van de cupula (Hillman 1974).

In amniotes, bijvoorbeeld in roggen, hagedissen, schildpadden, duiven, de meeste knaagdieren (muis, rat, gerbil maar niet chinchilla), katten, apen en mensen, kunnen de cristae van de verticale kanalen (posterieur en anterieur) de vorm van een halter hebben. Zij vertonen twee hemi-cristae, elk met een centrale zone, gescheiden door een septum cruciatum (Fig. 2; Lindeman 1969). In dit geval strekt de cupula zich uit van de receptorbasis als twee boogvormige massa’s, die in het midden verbonden zijn door een dunnere streek. Het horizontale kanaal daarentegen bezit in het algemeen slechts één centrale zone. Morfologische variaties tussen horizontale en verticale SCC’s zijn niet verrassend; horizontale kanalen verschenen recenter in de evolutie, en gebruiken verschillende genexpressies voor hun ontwikkeling. Voor de laterale SCC treedt depolarisatie van HCs op wanneer de kracht wordt uitgeoefend in de richting van de utriculus, maar voor verticale kanalen daarentegen treedt depolarisatie op wanneer de kracht wordt uitgeoefend in de richting van de ductus (Fig. 2).

Morfologische studies uitgevoerd door Landolt et al. (1972) bij duiven, benadrukten dat de oppervlakte geometrie van de cristae van de anterior en posterior membraneuze ampullae significant verschilt van die van de laterale membraneuze ampulla. Van bovenaf gezien doet de inhoud van de ampullen die verbonden zijn met de verticale ducten denken aan een kruis. De kortere armen van dit kruis bestaan uit twee uitsteeksels, de eminentiae cruciatae, en de umbo daartussen, de torus septi. Er zijn dus morfologisch ’twee cristae’ binnen elke ampulla. Elk van deze “twee cristae” is zadelvormig, maar de crista ampullaris van de laterale membraneuze ampulla is een v-vormige richel die de korte as van het lumen van de membraneuze ampulla doorkruist, als een catenoïde. Echter, in de drie ampullen vertoont de crista ampullaris een bilaterale symmetrie over een mediaal vlak ten opzichte van de torus, en een andere bilaterale symmetrie over het mediale transversale vlak dat evenwijdig is aan de cupula (Fig. 2, Paneel c).

De crista ampullaris bereikt een derde van de hoogte van de ampul en bevat het neuroepithelium, de bloedvaten en de zenuwvezels. Het neuroepitheel bestaat voor het grootste deel uit haarcellen en uit steuncellen die in hoge mate verantwoordelijk zijn voor de biomechanische eigenschappen van de crista en voor de reologische eigenschappen van de gel in de cupula; de cellen grenzend aan het zintuigepitheel dragen eveneens bij tot de structuur van de gel (Lindeman 1969; Dohlman 1971).

De haarcellen op de crista

Bij amnioten bestaan ten minste twee verschillende typen haarcellen (HC’s): de type I-cellen worden omhuld door kelktendrieten van afferente neuronen, aan de binnenzijde van het crista-epitheel, maar de type II-cellen worden benaderd door bouton-eindpunten (Wersäll 1954, 1956). (Merk op dat de meeste afferente neuronen bij zoogdieren dimorf zijn en contact maken met HC’s van zowel type I als type II). De belangrijkste fysiologische gradiënt wordt echter gegeven door de positie in het epitheel, bijvoorbeeld op crista bevinden de meeste fasische cellen zich in het centrum en meer tonische in de periferie (Goldberg en Brichta 1998; Eatock en Songer 2011). Bij vogels zijn type I HC’s beperkt tot het centrum van de crista, maar bij zoogdieren worden type I HC’s overal aangetroffen, en bij primaten is er een dominantie van type I cellen op de hele crista (cf. Lysakowski en Goldberg 2008 over doodshoofdaapje). De crista van zoogdieren heeft echter een concentrische organisatie met drie typen afferente neuronen en HC fysiologie en morfologie: een centrum, een tussenliggende zone en een periferie.

De haarceldichtheid is niet uniform over het crista-oppervlak; zij is aanzienlijk hoger in de periferie dan in het centrum (Hillman 1974; Lindeman 1969). Het verschil in dichtheid tussen het centrum en de periferie is meer uitgesproken voor type I cellen, terwijl type II cellen meer uniform verdeeld waren tussen de top en de periferie van de cristae (Goldberg en Brichta 1998). De haarbundels zijn korter in de centrale regio dan in de perifere regio’s van de cristae (vgl. ook Njeugna et al. 1996).

De haarbundels (HB’s) van de HC’s hebben een verscheidenheid aan morfologieën en fysiologie voor alle epithelia van vestibulaire eindorganen, de crista van het kanaal of de macula van de otoliet (Brichta et al. 2002).

De stereocilia van een HB zijn in de apex van de HC in een regelmatige opstelling ingebracht, en zij zijn op ten minste drie manieren met elkaar verbonden: basale verbindingen, lateraal contact en tipverbindingen, (Howard et al. 1988). Het is bewezen (althans voor trillende bewegingen) dat de bundelafbuiging synchroon en coherent is (Kozlov et al. 2006).

Verschillende studies hebben melding gemaakt van de insertie van het kinocilium in de cupulaschaal, en filamenten die sluiers en buizen vormen, die de stereocilia verbinden met de subcupularuimte (Suzuki et al. 1984; Rüsch en Thurm 1989).

Cupula structuur

De cupula werd voor het eerst nauwkeurig beschreven door Steinhausen (1933) als een gelatineuze substantie die zich uitstrekt tot het dak van de ampulla en tot aan de laterale wanden.

Verschillende theorieën werden voorgesteld voor de cupula. Zalin (1967) stelde voor dat de cupula aan het dak van de ampulla hangt. Dohlman (1971) stelde voor dat de cupula beweegt als een zuiger, en suggereerde dat de endolymfe vloeistof circuleert aan het dak van de ampulla, niet langs de crista, maar later (1977, 1980) stelde hij een andere opvatting voor dat endolymfe circuleert in de subcupulaire ruimte. Rüsch en Thurm (1989) gaven argumenten voor een andere samenstelling van de vloeistof in het cupula antrum (Muller 1999).

In padvissen hebben Yamauchi et al. (2001) aangetoond dat de cupula los kan komen van het dak, maar vast blijft zitten op de grens van de crista.

Dohlman (1977, 1980) stelde bovendien voor dat starre structuren, zoals filamenten of buisjes, de stereocilia met de cupula verbinden. Een dergelijke filamenteuze structuur werd ook waargenomen door Suzuki et al. (1984), en Rüsch en Thurm (1989), Takumida (2001). Deze structuur zou echter afhankelijk kunnen zijn van soortverschillen. Zo meldden Silver et al. (1998) de afwezigheid van dergelijke structuren bij padvissen. De optimaliteit van een dunne subcupulaire ruimte voor het vergroten van de gevoeligheid werd bewezen door Muller (1999).

Uit het werk van Hillman en McLaren (1979), die kikkers bestudeerden, en Silver et al. (1998), die oesterpaddenvissen (opsanus tau) bestudeerden, kunnen we afleiden dat het cupula complex uit vier delen bestaat (Fig. 3): laterale vleugels aan beide zijden, gezamenlijke centrale pijlers in het midden (die de cupulaschelp vormen), en een cupula antrum nabij de crista, gevuld met isotrope gel, versterkt met verticaal lopend collageen (cf. Hunter-Duvar en Hinojosa 1984 voor zoogdieren). Het cupulaire omhulsel is gemaakt van bindweefselvezels, dicht opeengepakt en vernet. Takumida (2001) maakt dan ook onderscheid tussen cupula in enge zin (voor cupulair omhulsel) en subcupulair netwerk (voor het cupulaire antrum).

Het cupulaire antrum bevat een waterig medium waarin de haarcelbundels (gevormd door meerdere stereocilia en een enkel kinocilium) uitsteken, die ontstaan uit de apicale oppervlakte van de zintuiglijke haarcellen (Hillman en McLaren 1979). Deze gel kan vrij zijn van materiaal, zoals bij de padvis (Silver et al. 1998), maar kan ook vol zitten met verbindingsstructuren, zoals bij de cavia (Takumida 2001). Bij cavia’s beschreef Wersäll (1956) fijne verticale kanalen waarin zich HC-bundels bevinden. Dit geheel van binddunne vezels en ciliae is door Takumida (2001) het subcupulaire meshwork genoemd. Dit is een massa extra cellulair, zeer gespecialiseerd materiaal (Landolt et al. 1972; Silver et al. 1998).

Takumida stelde een functionele relatie voor tussen de sensorische haarcellen en de cupula (Takumida 2001). Volgens zijn waarneming wijst de sterk vernette isotrope textuur van de cupulaschaal erop dat deze laag zou kunnen functioneren als een stijve plaat en de traagheidskrachten door de grote massa van de hele cupula gelijkelijk verdeelt over alle sensorische haarbundels. De afschuifspanning als gevolg van de relatieve versnelling van de cupula resulteert in afschuifspanning van de cupula zelf. De energie afkomstig van de beweging van de cupula wordt direct of indirect doorgegeven aan de sensorische haren via het subcupulaire netwerk. Deze observatie van Takumida is de belangrijkste basis van onze hypothese van invariantie. In feite is de functie van het cupulair systeem om de driedimensionale cupula vervorming om te zetten in een eendimensionale haarcel buiging, en wij interpreteren de hypothese van gelijke verdeling van krachten in Takumida als een hypothese van dimensionale reductie door een één-parameter groep van symmetrie.

Cupulamodellen

Er is nu experimenteel bewijs dat de cupula zich verplaatst als een diafragma bij blootstelling aan een drukgradiënt (Hillman en McLaren 1979; Yamauchi et al. 2001).

De standaardtheorie is dat de cupula analoog is aan een trommelmembraan (Landolt et al. 1972). Ook Van Buskirk (1976) modelleerde de cupula als een elastisch membraan dat de hele ampulla overspant in de vorm van een diafragma. (Voor een overzicht van de cupulamodellen, zie ook McLaren en Hillman 1979; Hillman en McLaren 1979.)

Op grond van de experimenten die zijn uitgevoerd op de cupula van de brulkikker, hebben McLaren en Hillman (1979) en Hillman en McLaren (1979) gesuggereerd dat de basis van de cupula over het oppervlak van de crista glijdt en de subcupulaire ruimte tussen de crista en de cupula afschuift. Merk op dat de afschuifspanning over de gehele transversale breedte van de crista voor alle haarcellen tegelijk exciterend of inhibiterend is (Rabbitt et al. 2001), afhankelijk van de transversale verplaatsing van de cupula vleugels.

Kondrachuk et al. (1987) gaven een mathematisch model van de tijdsverloopvariaties van de cupula; in het bijzonder bespraken zij de viscositeit-elasticiteitseigenschappen van de cupula voor de toepasbaarheid van een membraanmodel. Anderen (b.v., Astakhova 1989, 1990) hebben het systeem beschouwd als bestaande uit een elastische zuiger (cupula) in een viskeuze vloeistof (endolymfe).

Vega et al. (2008) voerden een vergelijking uit tussen de twee modellen, die aantoonde dat de cupular gedragsdynamica onder periodieke stimulatie gelijkwaardig is voor zowel de zuiger als het membraan cupular modellen.

Daaruit volgt dat, hoewel de maximale cupulaire verplaatsing optreedt nabij het geometrische centrum van de ampulla, de maximale afschuifspanning juist optreedt op het niveau waar de sensorische haarbundels in de cupula uitsteken. Dit punt werd onderstreept in het werk van (Muller 1999). Omdat het de relatieve verplaatsing tussen aangrenzende cilia is die uiteindelijk leidt tot transductiekanaal gating, lijkt de afschuifspanning in de cupula bij uitstek geschikt te zijn om haarcellen te activeren. Voor trillende rotaties van het hoofd impliceert de gekoppelde dynamica van de vloeistof in de kanalen en van de cupula het bestaan van een kritische frequentieband waar de transversale cupula verplaatsing evenredig is met, en in fase met, de hoeksnelheid van het hoofd (Wilson en Melvill Jones 1979; Rabbitt et al. 2001). In deze band is de afschuifspanning evenredig met de volumeverplaatsing ter hoogte van de cupula. Highstein et al. (2005) en Rabbitt et al. (2001) hebben een simulatie van dat punt gemaakt.

Er is experimenteel bewijs dat de cupula (i) een zekere stijfheid heeft en bestand is tegen vervorming vanuit de rustpositie, (ii) viscositeit heeft en bestand is tegen de veranderingssnelheid van de vervorming vanuit de rustpositie, en (iii) een ruimtelijk niet-uniform vervormingsveld heeft (Damiano en Rabbitt 1996). De rotatiestijfheid (K) in SI-eenheden is (K = 7,1 ^{-11} 10) N m/rad (Grant en Van Buskirk 1976). De cupula overspant volledig de doorsnede van de ampulla. Het is een relatief dikke structuur (een derde van de hoogte, bijvoorbeeld 0,15 mm breedte voor 0,45 mm hoogte bij de axolotl, Vega et al. 2008), maar er wordt van uitgegaan dat hij gelijkmatig door de dikte vervormt, een beperkende aanname die ook in Damiano en Rabbitt (1996) wordt gevonden. Dit is in overeenstemming met het functionele plan voorgesteld door Takumida (2001).

In onze studie hebben wij het cupulasysteem gemodelleerd als een inhomogeen Newtoniaans visco-elastisch vast lichaam, samengesteld uit vier homogene domeinen: de vleugels (of twee zijwanden), de eigenlijke cupula (of twee cupula pilaren), het cupula antrum en de crista. De onsamendrukbaarheid van de gel in het antrum wordt bevestigd door Selva et al. (2009); Yamauchi et al. (2001); Kassemi et al. (2005).

Het grootste deel van de huidige studie betreft het antrum, beschouwd als een hydrogel (Selva et al. 2009). Wij gaan dus niet uit van homogeniteit van de cupula, maar wel van homogeniteit in het onderste deel van de cupula (antrum) in de nabijheid van de crista. Deze hypothese wordt door de meeste modeldocumenten expliciet gemaakt (Selva et al. 2009; Vega et al. 2008; Damiano 1999). Aangezien de verplaatsing in de cupula een kwestie is van enkele micrometers, vaak een tiental nanometers, zullen onze modelvergelijkingen overeenkomen met de lineaire wet van Hooke.

Aanhangsel B: Analyse en demonstraties

De tensor (\sigma ^{ij}) is symmetrisch (d.w.z., \(\sigma ^{ij}= \sigma ^{ji}) voor elk paar \(i,j) van indices).

We stellen de hypothese dat het cupula antrum een lineair visco-elastisch model heeft, dat onsamendrukbaar is.