Risultati

All’inizio abbiamo dimostrato che la somministrazione di cycloheximide, in prossimità dell’induzione di pilocarpina SE, ha bloccato la MFS sopragranulare nei ratti – ma non ha impedito il successivo sviluppo di crisi spontanee o influenzato la loro frequenza. Questi risultati hanno fornito, per la prima volta, prove dirette contro un ruolo causale per la MFS sopragranulare nell’epilettogenesi del lobo temporale. Una possibile spiegazione di questa dissociazione è che la generazione di crisi nei modelli pilocarpina e kainato di epilessia potrebbe essere guidato da fonti extrahippocampali. Infatti, i contributi relativi di talamo, amigdala e corteccia piriforme nell’inizio delle crisi spontanee in questi modelli sono stati indicati in una serie di studi.

Per affrontare questo problema, abbiamo poi utilizzato l’applicazione intrahippocampale a piccole dosi di acido kainico. Anche in questo caso, la cicloeximide è stata in grado di bloccare completamente la MFS sopragranulare nella maggior parte degli animali, senza alterare la frequenza e l’intensità degli eventi EEG ictali e interictali spontanei. Abbiamo concluso che anche nel modello di kainato intrahippocampale piccola dose, dove crisi spontanee erano più probabilità di iniziare nell’ippocampo iniettato, MFS sopragranulare non è necessario per il verificarsi di eventi ictali.

Dato che la maggior parte della nostra analisi negli esperimenti iniziali valutato animali 2 mesi dopo la lesione iniziale precipitante, abbiamo poi cercato di indagare come MFS sopragranulare sarebbe stato influenzato dalle crisi spontanee. Alcune pubblicazioni su questo argomento hanno dimostrato che gli animali con crisi più frequenti hanno una MFS sopragranulare più intensa, suggerendo così che questa forma di riorganizzazione sinaptica è in qualche modo associata a una maggiore propensione a cogliere (anche se non determina se le crisi emergono o meno). Altri ricercatori hanno sostenuto che la densità di MFS sopragranulare non è associata al numero totale di crisi nel corso della vita o alla frequenza delle crisi (nell’epilessia del lobo temporale sperimentale o umana), e molti autori non considerano più MFS come un evento necessario o sufficiente nell’epilessia del lobo temporale. Tuttavia, nella condizione umana non abbiamo alcun controllo sullo stato di fondo del tessuto. E nella maggior parte degli studi sperimentali, la SE era necessaria per la comparsa delle crisi – dove non c’è dubbio che la MFS sopragranulare è in gran parte il riflesso di un precedente episodio SE. Producendo una condizione sperimentale in cui nessun MFS sopragranulare è derivato dall’episodio SE iniziale, siamo stati in grado di indagare il contributo relativo delle successive crisi spontanee a questa riorganizzazione sinaptica. Abbiamo concluso che MFS sopragranulare non ha mostrato alcuna associazione con la frequenza delle crisi spontanee, e sembrava dipendere più criticamente sul tempo dopo la lesione iniziale. Infatti, in questa condizione, la MFS sopragranulare alla fine si è sviluppata in tutti gli animali, anche se ad un ritmo molto più lento; inoltre, non sembrava essere più robusta negli animali con maggiore frequenza di crisi spontanee ricorrenti.

La descrizione della dispersione delle cellule di granulo nel tessuto umano di pazienti con epilessia del lobo temporale ha dato origine al suggerimento che i cambiamenti di sviluppo potrebbero essere alla base della successiva epilessia in quei pazienti. La dimostrazione, prima nel modello di ratto pilocarpina e più tardi nei topi trattati con kainato, che i roditori adulti potevano sviluppare la dispersione delle cellule dei granuli indicava che questi cambiamenti citoarchitettonici potevano anche essere la conseguenza dell’episodio iniziale precipitante della SE. La successiva dimostrazione che la neurogenesi delle cellule del granulo dentato era aumentata dopo la SE ha introdotto un’ulteriore possibilità – che la plasticità della rete ippocampale associata all’epilettogenesi potrebbe derivare da connessioni aberranti formate dalle cellule del granulo dentato appena nate. Abbiamo, quindi, indagato se cycloheximide avrebbe influenzato l’insorgenza di MFS sopragranulare attraverso il blocco della neurogenesi delle cellule del granulo. Con nostra grande sorpresa, abbiamo osservato che la proliferazione cellulare nella DG è drammaticamente aumentata negli animali epilettici trattati con cicloeximide. L’induzione di SE negli animali iniettati con pilocarpina da sola ha portato ad aumenti di 2-7 volte nel tasso mitotico delle cellule del granulo dentato, rispetto agli aumenti di 5-30 volte per gli animali trattati con pilocarpina/cicloeximide. Abbiamo suggerito che tali tassi mitotici aumentati sono stati associati con una protezione da cycloheximide di una popolazione di cellule precursori vulnerabili che altrimenti degenerare dopo pilocarpina indotta SE. Abbiamo inoltre suggerito che la MFS e la neurogenesi delle cellule del granulo non sono necessariamente legate l’una all’altra. Questa dissociazione è coerente con la scoperta che l’irradiazione di animali sottoposti a pilocarpina indotta SE essenzialmente abolito neurogenesi delle cellule del granulo dentato, ma non è riuscito a prevenire la riorganizzazione delle fibre muschiose nello strato molecolare dentato.

Registrazioni patch-clamp intere cellule in fette ippocampali aveva dimostrato che l’ampiezza e la frequenza delle correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee nelle cellule del granulo aumentato con il tempo dopo il trattamento kainato. Questo aumento dell’input sinaptico eccitatorio era correlato all’intensità della macchia di Timm nello strato molecolare interno. Quando l’inibizione è stata ridotta con bicucullina in fette di animali trattati con kainato, la fotolisi flash di glutammato ingabbiato applicata nello strato delle cellule di granulo ha evocato scoppi epilettiformi di potenziali d’azione (un effetto non visto nelle cellule di granulo dei ratti di controllo). Questi dati hanno sostenuto l’ipotesi che kainato indotto MFS sopragranulare risultati nella formazione progressiva di connessioni eccitatorie aberranti tra le cellule del granulo. Per valutare i cambiamenti nel profilo elettrofisiologico che risulterebbero dal trattamento con cicloeximide, l’elettrofisiologia in vitro (registrazioni extracellulari) è stata eseguita 2 mesi dopo la SE indotta da pilocarpina. Potenziali evocati in fette di ratti trattati con pilocarpina e pilocarpina/cicloesimide hanno mostrato un’attività polispiking di piccola ampiezza (risposte epilettiformi) in CA1 e una popolazione apparentemente normale di spike isolati in DG. Ancora più importante, la DG in fette da pilocarpina e pilocarpina / cicloeximide animali non differiva rispetto alle anomalie elettrofisiologiche, anche sotto alta K + o alta K + / bicucullina. Analisi del neo-Timm colorazione, come previsto, ha rivelato forte MFS sopragranulare in pilocarpina iniettato ratti e significativamente meno colorazione in pilocarpina / cicloeximide ratti. Così, il verificarsi di risposte anormali stimolo, e alta K + o alta K + /bicuculina indotta attività epilettiformi, non dipendeva dal grado di MFS sopragranulare.

Una domanda di lunga data per quanto riguarda lo sviluppo di MFS in modelli animali di SE è se germogliato fibre muschiose aggiungerebbe nuove sinapsi ai dendriti nello strato molecolare – o se queste fibre germoglianti semplicemente sostituito per sinapsi vacanti (a causa della degenerazione delle cellule ilari). Infatti la maggior parte degli studi sull’argomento ha suggerito la perdita delle cellule muscose ilari, normalmente un importante obiettivo ilare delle fibre muscose delle cellule del granulo, come un fattore importante nell’iniziare la MFS sopragranulare. Pilocarpina indotta SE in presenza di cicloeximide ha portato ad un numero ridotto di cellule ilari feriti rispetto ai ratti non pretrattati con cicloeximide. Presunte cellule muscose, identificate da calcitonina gene relativo peptide (CGRP) immunoistochimica, non erano significativamente ridotti in entrambi i gruppi 60 giorni dopo SE (dato l’apparente incoerenza di questa scoperta con una preponderanza di prove che indica una perdita di cellule muscose SE, si suppone che CGRP potrebbe costituire un marcatore di una sotto-popolazione di cellule muscose). Mentre i controlli avevano una forte banda di CGRP-positivi fibre (assoni putativo cellule muschiose) e non neo-Timm macchiato fibre nello strato molecolare interno, pilocarpina ratti trattati non aveva fibre CGRP e forte neo-Timm colorazione. Gli animali trattati con cicloeximide-pilocarpina, al contrario, avevano una colorazione CGRP e neo-Timm simile ai controlli. Abbiamo concluso che la cicloeximide potrebbe proteggere le cellule ilari CGRP-positive durante la SE; permettendo a queste cellule di mantenere la loro normale proiezione assonale, la MFS è stata impedita – uno scenario coerente con l’ipotesi delle cellule mossy “irritabili” che si basa sulla sopravvivenza delle cellule mossy per l’ipereccitabilità della rete. Abbiamo suggerito che la cicloeximide previene la MFS sopragranulare indotta da SE impedendo la perdita di cellule ilari CGRP-positive (cellule mossy putative).

Il fatto che la cicloeximide proteggesse le cellule ilari e aumentasse ulteriormente la proliferazione cellulare nella DG dopo SE ha creato lo scenario per un’ipotesi che integra le osservazioni attuali. I ricercatori hanno dimostrato che alcune cellule di granulo appena nate si sviluppano in posizioni anormali all’interno dell’ilo. Queste cellule di granulo ectopiche dimostrano scoppi regolari di potenziali d’azione che sono sincronizzati con le scariche delle cellule piramidali CA3 e gli scoppi dei neuroni ilari (comprese le cellule muscose). Oltre alla formazione di cellule di granulo ilari ectopiche, diversi articoli hanno caratterizzato la formazione di dendriti ilari basali sulle cellule di granulo negli animali epilettici. Entrambe le caratteristiche permettono certamente sinapsi aberranti nell’ilo, sia da cellule ectopiche o irritabili o in dendriti basali aberranti, che possono spiegare i cambiamenti in ipereccitabilità – indipendentemente dalla presenza di MFS sopragranulare.