Háttérinformációk
A DNS transzfekció elektroporációval egy bevált technika, amely talán minden sejttípusra alkalmazható. Nagy gyakorisággal eredményez stabil transzformánsokat, és nagy hatékonyságú az átmeneti génexpresszió. Az elektroporáció mára már bizonyítottan hatékony a plazmid DNS in vivo bejuttatására számos szövettípusba. Az elektroporáció kihasználja azt a tényt, hogy a sejtmembrán elektromos kondenzátorként viselkedik, amely nem képes áramot átvezetni (kivéve az ioncsatornákon keresztül). Ha a membránokat nagyfeszültségű elektromos térnek tesszük ki, akkor azok ideiglenesen megbomlanak, és olyan pórusok keletkeznek, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy a makromolekulák (és kisebb molekulák, mint például az ATP) beléphessenek a sejtbe vagy elhagyhassák azt. A membránpórusok újbóli bezáródása természetes bomlási folyamat, amely 0°C-on késleltetett.
A pórusok nyitva tartása alatt a sejtbe és végül a sejtmagba nukleinsav kerülhet. A szabad végű lineáris DNS rekombinogénebb, és nagyobb valószínűséggel épül be a gazdakromoszómába, hogy stabil transzformánsokat eredményezzen. A szupertekercselt DNS könnyebben csomagolódik a kromatinba, és általában hatékonyabb az átmeneti génexpresszióban.
A nagyfeszültségű áramütések alkalmazását a DNS sejtekbe juttatására először Wong és Neumann végezte fibroblasztokon (Wong és Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). A technikát később általánosították (Potter et al., 1984) minden sejttípusra – még olyanokra is, mint például a limfociták, amelyek a fibroblasztokkal ellentétben más eljárásokkal nem transzfektálhatók (pl., kalcium-foszfát vagy DEAE-dextrán DNS-koprecipitátumok).
Oliver Smithies és munkatársai ezt követően elektroporációt alkalmaztak az embrionális őssejtekbe (ES) történő DNS-bejuttatásra, és olyan célvektorokat terveztek, amelyek lehetővé tették, hogy a bevitt DNS rekombinálódjon a genom homológ régióival, és vagy egy módosított gént vagy egy zavaró szekvenciát vezessen be, hogy olyan ES-sejteket hozzanak létre, amelyekben egy adott gén “kiütve” vagy “kiütve” van. A módosított ES-sejteket ezután a megfelelő knockin vagy knockout egerek létrehozására használták. Az elektroporációra azért volt szükség ezekhez a génátviteli alkalmazásokhoz, mert a DNS-t csupasz formában juttatja a sejtekbe, amely könnyen részt vehet a homológ rekombinációban. Az elektroporációnak ez a kiterjesztése vezetett ahhoz, hogy Dr. Smithies részesült a 2007-es orvosi vagy élettani Nobel-díjban. Az ES-sejtek elektroporációjának módszertana lényegében ugyanaz, mint más emlőssejteké. Ha homológ géncserét szeretnénk, akkor olyan vektorokat kell tervezni, amelyek lehetővé teszik a “pozitív-negatív” szűrést (Bronson és Smithies, 1994; Joyner 2000), úgy, hogy az egyik szelekció minden olyan sejtet visszanyerjen, amelyben az elektroporált DNS beépült a genomba, a második szelekció pedig olyan ES-klónok ellen irányul, amelyekben a DNS véletlenszerűen épült be. Knockin/out egerek ezután a szelektált klónozott ES sejtek embriókkal való egyesítésével, a fejlődés lehetővé tétele érdekében történő újra beültetéssel és az így kapott kimérák tenyésztésével olyan egereket lehet létrehozni, amelyekben minden sejt hordozza a módosított gént.
Noha egész növények vagy levélszövetek elektroporációval történő transzfekciójáról számoltak be, a növényi sejteket általában protoplasztokká kell alakítani, mielőtt a DNS-t könnyen be lehetne juttatni beléjük (alternatív protokoll; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Az emlőssejtekhez hasonlóan a növényi protoplasztok is különböző elektromos körülmények között (kritikus paraméterek) elektroporálhatók. Mind magas feszültséget alacsony kapacitással (rövid impulzusidővel), mind alacsony feszültséget magas kapacitással (hosszú impulzusidővel) használtak a sikeres géntranszfer eléréséhez (Chu és mtsai., 1991). Az in vivo EP-t eredetileg kemoterápiás szerek szolid tumorokba történő bejuttatására használták, és a preklinikai vizsgálatoktól a klinikai vizsgálatokig jutottak el (Gothelf, et al., 2003). A plazmid DNS elektroporációval történő in vivo juttatásáról először az 1990-es évek elején-közepén számoltak be (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996), és logikus előrelépés volt, amely az elektroporációval végzett in vitro transzfekciók sikerén és annak bizonyításán alapult, hogy az eljárás biztonságosan elvégezhető in vivo kis molekulák, például kemoterápiás szerek juttatása esetén. Az in vivo elektroporáció alkalmazása plazmid DNS bejuttatására óriási növekedésnek indult a preklinikai vizsgálatok számában, és a közelmúltban a klinikumba is átültették (Heller, és mtsai., 2006a és Bodles-Brakhop, és mtsai.,2009).
Az elektroporáció széles körű alkalmazását nagyrészt az tette lehetővé, hogy olyan kereskedelmi készülékek állnak rendelkezésre, amelyek biztonságosak és könnyen használhatók, és rendkívül reprodukálható eredményeket adnak. E gépek kialakítása jelentősen eltér, de két alapvető kategóriába sorolhatók, amelyek az impulzusok időtartamának és feszültségének (a pórusképződést szabályozó két elektromos paraméter) szabályozására különböző eszközöket használnak. Az egyik típus kondenzátoros kisülési rendszert használ exponenciálisan csökkenő áramimpulzus előállítására, a másik pedig valódi négyszöghullámot (vagy annak közelítését) generál. A kondenzátoros kisülési műszerek belső kondenzátorukat bizonyos feszültségre töltik fel, majd a sejt-DNS-szuszpenzión keresztül kisütik. Mind a kondenzátor mérete, mind a feszültség változtatható. Mivel az áramimpulzus exponenciálisan csökkenő függvénye (1) a kezdeti feszültségnek, (2) a műszer kapacitási beállításának és (3) az áramkör (beleértve a mintát is) ellenállásának, a kondenzátor méretének megváltoztatása, hogy több (vagy kevesebb) töltés tárolódhasson a feszültségen, hosszabb (vagy rövidebb) lecsengési időt és ezáltal különböző effektív impulzus időtartamot eredményez. Ezzel szemben a négyszöghullám-generátorok mind a feszültséget, mind az impulzus időtartamát szilárdtest kapcsolóeszközökkel szabályozzák. Gyorsan ismétlődő impulzusokat is képesek előállítani. In vivo alkalmazásokhoz a négyszöghullámú generátorokat részesítik előnyben. Az impulzusok időtartama és amplitúdója mellett az impulzusok száma és az elektródok konfigurációja is befolyásolja a beadás hatékonyságát.
A legtöbb in vitro elektroporációs kísérletünkben a Bio-Rad Gene Pulser-t, egy kondenzátoros kisülési készüléket használtuk, de közvetlenül alkalmazhatóak más kondenzátoros kisülési készülékekre, és némi módosítással a négyszöghullámú generátorokra is. A GIBCO/BRL, a BTX, a Hoeffer Scientific és az International Biotechnologies (a beszállítók címét lásd a 4. FÜGGELÉK-ben) is kínál kondenzátoros kisülési készülékeket. Ezek a gépek akár egyetlen egységben, akár kiegészítő komponensek révén a legtöbb alkalmazáshoz megfelelő elektroporációs körülmények sokféleségét képesek biztosítani. A BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan és IGEA által forgalmazott négyszöghullámú generátorok nagyfokú impulzusszélesség-szabályozást biztosítanak, többszörös, gyors impulzusokat tesznek lehetővé, és hatékonyabbak lehetnek a nagyon érzékeny vagy más módon nehezen transzfektálható sejtek esetében. Az elektroporáció élő állatokon vagy embereken történő génterápiás alkalmazása szintén megköveteli az elektroporációs paraméterek jó ellenőrzését a hatékony DNS-átvitel biztosítása érdekében, minimális szövetkárosodás mellett, és ehhez általában négyszöghullámú generátorokra van szükség. A generátorok kaphatók impulzusok beadására állandó feszültség vagy állandó áram formájában. A négyszöghullámú generátorok mellett az in vivo elektroporációra alkalmas elektródák is kaphatók ezektől a beszállítóktól. Ezek a gépek általában drágábbak. Nyilvánvalóvá vált, hogy a ~100 kHz-es váltakozó áramú impulzusok lehetnek a leghatékonyabb hullámforma az elektroporációhoz és esetleg az elektrofúzióhoz (Chang, 1989).
A legtöbb in vivo kísérletünkben BTX T820 vagy T830 négyszöghullámú generátorokat használtunk. Ezekben a kísérletekben kereskedelmi forgalomban kapható elektródákat használtunk, például 2 tűs tömböt, mérőelektródákat és csipeszelektródákat, valamint egyedi tervezésű elektródákat. Amint fentebb említettük, az elektroporációs berendezések főbb szállítói többféle behatoló és nem behatoló elektródát kínálnak. A négyszögletes hullámgenerátorok lehetővé teszik az impulzusparaméterek jobb ellenőrzését, ami különösen fontos az in vivo beadás során. Az in vivo elektroporáció alkalmazásának növekedése közvetlenül összefügg az izomba történő hatékony bejuttatással. Az intramuszkuláris génszállítás alkalmazása elektroporációval különösen fontos volt vakcinázási célokra (Abdulhagg, et al., 2008). Az izom kiváló depónak bizonyult génalapú fehérjepótló alkalmazásokhoz is (Trollet, et al., 2006). Az izomba történő bejuttatás rákellenes vakcinák bejuttatására is felhasználható (Bodles-Brakhop, et al., 2009). A bőrre történő szállítás szintén sokoldalú célpontként vált elfogadottá. A bőrbe juttatás alkalmazható bőrbetegségek közvetlen kezelésére, fehérjéknek a keringésbe juttatására szisztémás terápia céljából, rákterápiára és DNS-vakcinák juttatására (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
Az elektroporáció könnyebben kivitelezhető, mint az alternatív technikák, ezért egyre gyakrabban alkalmazzák. Hátránya a tranziens analízisben való alkalmazás szempontjából, hogy közel ötször több sejtre és DNS-re van szükség, mint a kalcium-foszfát- vagy a DEAE-dextrán-mediált transzfekció esetében (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). Az elektroporációs és a kalcium-foszfátos koprecipitációs eljárások közötti fő különbség az integrált DNS állapota a megfelelő antibiotikumos közegben történő szelekciót követően. A kalcium-foszfát esetében a felvett és az egyes transzfektált sejtek genomjába integrált DNS mennyisége 3 × 106 bp tartományban van. Ennek eredményeként a transzfektált DNS gyakran nagy tandemtömbök formájában integrálódik, amelyek a transzfektált DNS sok példányát tartalmazzák. Ez akkor jelent előnyt, ha genomi DNS-t kívánnak átfertőzni a recipiens sejtekbe, és valamilyen fenotípusos változásra, például rosszindulatú transzformációra kívánnak szelektálni; itt a recipiens sejtenként nagy mennyiségű DNS integrálódása alapvető fontosságú. Ezzel szemben az elektroporáció úgy állítható be, hogy a beillesztett DNS egy vagy több példányát eredményezze recipiens sejtenként. Ez előnyös lenne a génexpressziós vizsgálatoknál, mivel a génexpresszióért felelős konkrét kópia azonossága ellenőrizhető, és – amint azt fentebb tárgyaltuk – alapvető fontosságú az ES-sejtek géncélzásához transzgenikus egerek létrehozásához.