A Giardia lamblia fertőzés a hasmenéses megbetegedések egyik leggyakoribb oka világszerte (22). Ez a protozoon kórokozó a vékonybélben kolonizálódik, és képes a hámhoz tapadni, de nem hatol be a nyálkahártyába. A fertőzések általában önkorlátozóak, mivel az immunkompetens gazdaszervezetek képesek a G. lambliát kontrollálni és általában kiirtani, amihez CD4 T-sejtek, valamint szekréciós immunglobulin A (IgA) és más, kevéssé ismert effektorok termelődése szükséges (6, 8, 9, 18). A gyakran súlyos klinikai tünetek, hasmenés, hasi fájdalom, felszívódási zavar és fogyás ellenére a fertőzést nem kíséri jelentős nyálkahártya-gyulladás (12). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a gyulladásos mediátorok nem lehetnek fontosak a paraziták által kiváltott hasmenésben, bár a giardiasisban a hasmenést irányító mechanizmusok kevéssé ismertek. Nem mutatták ki, hogy a giardia olyan enterotoxinokat szabadítana fel, amelyek a bélnedv felszívódásának vagy szekréciójának zavarát okozhatnák. Egerekben Giardia-fertőzéskor a felszívófelület csökkenése következik be a hám mikrovillák elvesztése miatt (16), ami felszívódási zavarral járó, ozmotikus eredetű hasmenéshez vezethet, de az abszolút felületcsökkenés szerény a vékonybél előre jelzett anatómiai tartalékához képest. A G. lambliával fertőzött embereken a radiológiai vizsgálat során a bél hipermotilitásának jelei mutatkoznak (15), amely jelenséget kísérleti úton fertőzött mongol futóegereknél is megfigyeltek (5). E leletek mögöttes mechanizmusai és funkcionális jelentősége jelenleg nem tisztázott. Ezért a jelen vizsgálat célja az volt, hogy teszteljük azt a hipotézist, hogy a bélrendszeri hipermotilitás a Giardia elleni gazdaszervezet védelmi mechanizmusát jelenti, a giardiasis egérmodelljeinek felhasználásával.

A felnőtt C57BL/6, SCID és neuronális nitrogén-oxid-szintáz (nNOS)-hiányos egereket a The Jackson Laboratory-tól (Bar Harbor, ME) kaptuk. A Giardia muris fertőzésekhez a cisztákat szacharóz flotációval tisztítottuk, hemocitométeren fáziskontraszt mikroszkóp alatt megszámoltuk, és szájon át, vízben 104 cisztát/egér 0,2 ml-ben adtunk be (9). A G. lamblia-fertőzésekhez a GS/M törzs (ATCC 50580) (11) trofozoitáit TYIS-33 táptalajon tenyésztették, és 0,2 ml azonos táptalajban 107/egér mennyiségben adták be szájon át (9). A vékonybél-motilitást módosított tesztétkezési módszerrel határozták meg. Az egereket egy éjszakán át koplaltatták, majd 0,2 ml szuszpenziót adtak 106 fluoreszcens polisztirol gyöngyből (10μm átmérőjű Fluoresbrite YG karboxilát mikrogömbök; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) és 6%-os kárminfestékből 5%-os gumiarábikumban, foszfát-pufferelt sóoldatban (PBS). 20 perc elteltével a vékonybelet gyorsan eltávolítottuk, és rögzítettük a kárminfesték-front helyzetét és a vékonybél teljes hosszát. Ezután a belet nyolc egyenlő méretű darabra osztottuk, amelyek mindegyikét hosszanti irányban felnyitottuk, 2 ml PBS-be helyeztük, és 10 percig jégen hűtöttük. A keverékeket erőteljesen felráztuk a trofozoiták és a gyöngyök leválasztása érdekében, amelyeket ezután külön-külön fáziskontraszt-, illetve fluoreszcens mikroszkóp segítségével számoltunk meg. A kárminfestékfront által megtett távolságot a vékonybél teljes hosszának százalékában fejeztük ki. A gyöngyök szegmensenkénti számát a vékonybélben lévő összes gyöngy százalékában fejeztük ki. A vékonybél-motilitás gátlásának a giardialis clearance-re gyakorolt hatásának felmérése érdekében az egereket először szájon át megfertőztük G. muris vagy G. lamblia GS/M vírussal, majd a 7., illetve 4. naptól kezdve minden második napon 30 mg/kg loperamiddal vagy kontrollként PBS-szel kezeltük őket. A vékonybél-trofozoiták számát a G. muris esetében a 21. napon, a G. lamblia esetében pedig a 9. napon határoztuk meg.

Hogy meghatározzuk, hogy a normál felnőtt egerek alkalmasak-e a bélmozgás szerepének tanulmányozására a giardialis fertőzés szabályozásában, 8-10 hetes C57BL/6 egereket fertőztünk meg a természetben előforduló egérpatogén G. muris cisztáival. A vékonybél-motilitást tesztétkezéses módszerrel határoztuk meg, amely során karmingin festéket használtunk folyékony fázisú markerként (14) és 10μm-es polisztirol gyöngyöket a Giardia trofozoitákhoz hasonló méretű részecskék markereként (19). A G. muris fertőzés felgyorsította a vékonybél-tranzitot, mivel mind a kárminfesték (1A. ábra), mind a polisztirol gyöngyök (1B. ábra) szignifikánsan messzebbre jutottak a fertőzött egerekben, mint a nem fertőzött kontrollokban. E jelenség időbeli elemzése kimutatta, hogy a hipermotilitás a fertőzést követő egy héten belül jelentkezett, de 2-3 hét múlva tetőzött, amikor a trofozoiták száma csökkent az 1 hetes maximális fertőzés idején mért számhoz képest (1. ábra (1A. ábra).1A). Így a vékonybél-motilitás maximális változásai a trofozoitaterhelés csúcsához képest késleltetve következtek be, ami arra utal, hogy ezeket a változásokat a közvetlen giardialis stimulációtól eltérő mechanizmus okozhatja.

Ez az eredmény emlékeztet a Giardia által kiváltott bélhám mikrovillák elvesztéséről szóló jelentésekre, amelyekben a gazdaszervezet adaptív immunválaszát találták felelősnek (16, 17). Annak értékelésére, hogy hasonló mechanizmusok játszhatnak-e szerepet a vékonybél hipermotilitás kiváltásában, súlyos kombinált immunhiányos egereket (SCID egerek) vizsgáltunk. Ezek az egerek a DNS-függő fehérjekináz katalitikus alegységének, a PRKDC-nek a hibája miatt nem rendelkeznek funkcionális T- és B-sejtekkel, ami szükséges a normális V(D)J rekombinációhoz, és nem képesek a Giardia kiirtására (9, 18). Az SCID egerek G. muris fertőzése nem változtatta meg a vékonybél-tranzitot, ami éles ellentétben állt az immunkompetens kontrollok megfigyeléseivel (2. ábra).2). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a giardiasis okozta vékonybél-hypermotilitás a kórokozóval szembeni normális adaptív immunválasz indukciójától függött.

Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a megfigyelt vékonybél hipermotilitás hozzájárult-e a Giardia kiürüléséhez, egereket loperamiddal kezeltünk, amely gyógyszer a gyomor-bél traktus μ-opioid receptorainak aktiválásával gátolja a bélmozgást (2, 13, 21). A gyógyszeres kezelést a G. muris-fertőzés csúcspontjának idején (7. nap) kezdtük el, hogy a motilitás farmakológiailag indukált változásai ne zavarják a fertőzés kezdeti kialakulását. A vékonybél-motilitás loperamiddal történő gátlása jelentősen rontotta a giardialis clearance-t. A loperamiddal kezelt egerekben a 21. napon 25-ször nagyobb volt a trofozoiták száma, mint a PBS-kezelt kontrollokban (3. ábra).3). A loperamid-kezelésnek nem volt hatása az adaptív immunitás kialakulására, mivel a bélnyálkahártya-szekrécióban az antigiardiális IgA titerét a kezelés nem befolyásolta (az adatok nem láthatóak). Továbbá ez a kísérleti stratégia hasonló gátló hatást mutatott a G. lamblia GS/M humán giardialis patogénnel történő egérfertőzésre, amely képes normális felnőtt egereket megfertőzni (3, 9). A PBS-szel kezelt egerek 9 napra nagyrészt megtisztultak a fertőzéstől, míg a 4. naptól kezdve loperamiddal kezelt egereknél továbbra is jelentős számú G. lamblia trofozoita volt a vékonybélben (3. ábra).3). Így a vékonybél-motilitás gátlása a giardia kiürülését veszélyeztette az egér-gazdában, függetlenül a giardia-fajtól. További megközelítésként, hogy meghatározzuk a bélmotilitás jelentőségét a gazda giardia elleni védekezésben, olyan genetikai megközelítést alkalmaztunk, amelyben az nNOS génjének megszakítása zavarja a hatékony propulziót a bélben egerekben (20). A motilitáselemzés megerősítette, hogy az nNOS-hiányos egerek konstitutív késést mutattak a gasztrointesztinális tranzitban vad típusú alomtestvéreikhez képest (4A. ábra).4A). Ezzel párhuzamosan a knockout egerek nem tudták normálisan kiüríteni a G. lamblia fertőzést (4B. ábra).4B). Így farmakológiai és genetikai megközelítéssel azt találtuk, hogy a csökkent bélmotilitás a Giardia elleni gazdaszervezeti védekezés károsodásával jár együtt.

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a bél hipermotilitása a Giardia elleni fontos gazdaszervezeti védekezés, mely következtetésre egy másik közelmúltbeli jelentés is jutott (10). Úgy tűnik, hogy ez a védekezés a parazitával szembeni normális adaptív immunválasz kialakulásától függ, mivel a T- és B-sejteket nélkülöző egerekben nem fordult elő, bár elvileg lehetséges, hogy a T- vagy B-sejtek az adaptív antigiardiális immunitásban betöltött szerepüktől függetlenül hozzájárulnak a hipermotilitáshoz. Az immunfüggő hipermotilitás más bélparaziták, különösen a helminták elleni gazdaszervezeti védekezésben is szerepet játszik. Például az életciklusa jelentős részét a vékonybélben töltő Trichinella spiralis fonalféreg kiirtása nagymértékben korrelál a fokozott bélmotilitással (4, 23). Hasonlóképpen, a Nippostrongylus brasiliensis horogféreg kiűzését patkányokban a vékonybél hipermotilitása kíséri, ami arra utal, hogy szerepe van a gazda védekezésében ezzel a helmintával szemben (7). Mindezen enterális patogének közös jellemzője, hogy elsődlegesen, ha nem is kizárólagosan, de a béllumenben lokalizálódnak. Anatómiai szempontból nézve a fertőzésnek ez a helye a hámmal bélelt testen kívül helyezkedik el, és ezért nem könnyen hozzáférhető számos immunhatású sejt és molekula, például a neutrofilek vagy a komplement számára, amelyek a szervezeten belül hatékonyan működnek. Valójában a hatékony antimikrobiális védelem a bél lumenében különleges kihívást jelent a gazdaszervezet számára, amely korlátozott védelmi repertoárral rendelkezik ezen a helyen. Ezek közül a szekretoros IgA-t általában elsődleges luminális védelmi mechanizmusnak tekintik, de tényleges jelentősége a giardialis clearance-ben változónak tűnik, és függhet a kevéssé meghatározott gazdaszervezeti és parazita tényezőktől (6, 9, 18). Adataink és a helmintákkal kapcsolatos korábbi munkák (4, 23) arra utalnak, hogy a bél hipermotilitása egy másik fontos védelmi mechanizmus a béllumen kolonizációjával szemben.

Az immunfüggő hipermotilitás mechanisztikus magyarázatot adhat a giardiasishoz társuló hasmenésre, amint azt korábbi jelentésekben (5, 15) is megjegyezték. Elvileg a hasmenést okozhatja csökkent folyadékfelszívódás vagy fokozott szekréció, illetve e két mechanizmus kombinációja. Kevés bizonyíték van a giardiasisban a fokozott ion- és folyadékszekrécióra, így a valószínű ok a csökkent folyadékfelszívódás marad. A luminális folyadékokkal való rövidebb kontaktidő, amely lehet lenyelt vagy gyomor- vagy hasnyálmirigy-szekrécióból származó folyadék, várhatóan veszélyezteti az iontranszport hatékonyságát a hámon keresztül, különösen, ha a hipermotilitás a felszívó hámfelületek jelentett elvesztésével párosul (16). Meg kell azonban jegyezni, hogy az egerek Giardia-fertőzéskor nem mutatnak nyílt hasmenést. Mindazonáltal lehetséges, hogy mind az emberi, mind az állati gazdaszervezetekben előfordul egy bélfolyadék-egyensúlyhiány, amely az egerekben kompenzált marad, az emberekben azonban nem. Ha a hipermotilitás valóban hozzájárul a hasmenés patogeneziséhez, akkor az a megállapításunk, hogy az SCID egereknél nem mutatkozott Giardia által kiváltott hipermotilitás, arra utal, hogy a Giardia-fertőzésekre való fokozott fogékonysággal járó sejtes immunhiányos betegeknél (pl. krónikus változó immunhiány) kisebb valószínűséggel alakulhat ki fertőzéssel összefüggő hasmenés. Továbbá eredményeink azt sugallják, hogy óvatosságra int a bélmotilitásgátlók alkalmazásának megfontolásakor a Giardia által kiváltott hasmenés kezelésében (1), mivel az ilyen kezelés meghosszabbíthatja az alapfertőzést.