IFN-γ ELISpot assay optimalizálása T-aktivált® IE-1 és pp65 CMV antigénekkel történő PBMC stimulációt követően

Frissen izolált PBMC-t használtunk az ELISpot assayhez. A T-sejtek funkcióvesztésének megelőzése érdekében, például az aktivált granulociták miatt, a heparinizált vérmintákat 8 órán belül további adalékanyagok nélkül dolgoztuk fel. Az ELISpot vizsgálati protokoll kifejlesztéséhez 2 × 105 PBMC-t választottunk kutanként, mivel ez a sejtszám a konfluencia alatt van, és általában kevesebb mint 15 ml teljes vérből származó mintákból nyerhető. A CMV azonnali korai fehérje IE-1 és a késői tegument fehérje pp65 jól jellemzett immunodomináns T-sejt antigéneket képvisel. A teljes hosszúságú IE-1-et és a pp65 181 aminosavas C-terminális fragmentumát karbamid jelenlétében állították elő és formulálták (T-activation®), hogy növeljék a sejtközvetített immunitás különböző típusú CMV-reaktív effektorsejtjeinek stimuláló képességét . Az optimális T-aktivált® antigénkoncentrációt először dózis-válasz kísérletek elvégzésével határozták meg. Egy egészséges CMV-szeropozitív donor frissen izolált PBMC-it 31,6 fg/ml-31,6 μg/ml T-aktivált® pp65-tel vagy 0,01-31,6 μg/ml T-aktivált® IE-1-gyel stimuláltuk, és az IFN-γ szekretáló sejtek számát IFN-γ ELISpot segítségével határoztuk meg. A T-aktivált® pp65 sokkal erősebb képességet mutatott az IFN-γ-szekretáló effektorsejtek stimulálására, mint a T-aktivált® IE-1, elérve a válaszkészség platóját 0,316 és 3,16 ng/ml pp65 között, míg az IE-1 esetében körülbelül 31,6 μg/ml között (1. ábra). Ennek megfelelően 3 μg/ml pp65 és 15 μg/ml IE-1 T-aktivált® antigén koncentrációt választottunk a további PBMC stimulációkhoz és ELISpot vizsgálatokhoz.

A vizsgálat érzékenységét és specificitását úgy határoztuk meg, hogy a meghatározott pp65 és IE-1 T-aktivált® antigén koncentrációkkal 10 CMV-szeropozitív és CMV-szeronegatív egészséges donorból izolált PBMC-t stimuláltunk. A reaktív effektorsejtek számát IFN-γ ELISpot segítségével számszerűsítettük. A szignifikáns stimulációt Mann-Whitney U-teszt segítségével úgy határoztuk meg, mint statisztikailag szignifikáns különbséget a nem stimulált és a CMV-antigénnel stimulált körülmények SFC-értékei között (mindegyik négy példányban). A T-aktivált® pp65 és az IE-1 szignifikánsan aktiválta a reagáló effektorsejteket 10-ből 10, illetve 10-ből 9 CMV-szeropozitív donorból származó PBMC-készítményben (2. ábra). Ebben a kollektívában a T-aktivált® pp65 összességében nagyobb kapacitást mutatott a reszponzív sejtek aktiválására, a medián 399 SFC/200 000 PBMC (tartomány 12-864 SFC/200 000 PBMC), szemben a T-aktivált® IE-1-gyel, amelynek mediánja 26 SFC/200 000 PBMC (tartomány 1,3-96 SFC/200 000 PBMC) volt. Mindazonáltal a CMV-szeropozitív donorok egyedi mintáiban jelentős, akár 96 SFC/200 000 PBMC értékű választ mutattak ki a T-aktivált® IE-1-re (2. ábra). A különböző CMV-széronegatív donoroktól származó mind a 10 PBMC-minta (100%) negatív vizsgálati eredményt mutatott a pp65-tel történő stimulációt követően (medián 0,3 SFC/200 000 PBMC; tartomány 0-2,8), míg a CMV-széronegatív egyének 10-ből 9 (90%) PBMC-mintája negatív volt az IE-1-gyel történő stimulációt követően (medián 2,9 SFC/200 000 PBMC; tartomány 0,3-6,8). A foltok száma a CMV-szeronegatív IE-1-stimulált PBMC-ben magasabb volt, mint a CMV-szeronegatív pp65-stimulált PBMC-ben, de nem haladta meg a 7 SFC/200 000 PBMC-t (2. ábra).

AzIFN-γ bizonyítottan folyamatosan szekretálódik az antigénstimuláció során. Így a jel intenzitása az IFN-γ ELISpotban a stimuláció időtartamától függ . Az antigénstimuláció időtartama az IFN-γ ELISpotban a szakirodalomban általában 16 és 24 óra között mozog . Az inkubációs időnek a vizsgálati eredményekre gyakorolt hatásának vizsgálatára az IFN-γ ELISpotot 3 független, CMV-szeropozitív egészséges donor PBMC-jén végeztük el, miután 17, 19 és 21 órán keresztül T-aktivált® pp65 és IE-1 antigénekkel stimuláltuk őket. Így az optimalizált ELISpot-teszthez 19 h inkubációs időt választottunk.

A protokoll számos változója befolyásolhatja az ELISpot teszt eredményeit. Például az elsődleges sejttenyésztéshez használt közeg gyakran tartalmaz szérumot, amely különböző tételfüggő, nem jellemzett bioaktív molekulákat tartalmaz különböző koncentrációkban . A standardizált sejttenyésztési feltételek meghatározása érdekében megvizsgáltuk a különböző szérumtartalmú (RPMI 1640, 5% FCS, humán AB, szintetikus NTA vagy szintetikus NTS) és a szérummentes (AIM-V®, UltraCulture) közegek hatását a vizsgálat eredményességére. A szérummentes közeg adta a legjobb effektorsejt-választ, amely az 5% FCS-vel kiegészített RPMI 1640-hez hasonló volt (4a. ábra). Ezenkívül az AIM-V® mutatta a legalacsonyabb háttérjeleket stimulálatlan körülmények között (4b. ábra), így maximalizálta a jel-zaj arányt. Következésképpen az ELISpot protokollt a továbbiakban az AIM-V® szérummentes közeg használatával hoztuk létre.

Az ELISpot-tesztek különböző membránanyagokkal, többek között nitrocellulózzal (NC), vegyes cellulózészterrel (MCE) és polivinilidén-fluoriddal (PVDF) végezhetők. Hat egészséges személy PBMC-mintáiból származó IFN-γ ELISpot eredményeket hasonlítottunk össze (négy ismétlés, donoronként két preparátum) a leggyakrabban használt MCE lemezek, PVDF lemezek és a Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Németország) PVDF csíkok alkalmazásával. A PVDF-membránok a befogadó antitest megkötése előtt etanollal történő aktiválást igényelnek. Ezenkívül a PVDF-alapú lemezek esetében a foltok kialakítását megelőzően szigorúbb mosási lépésekre volt szükség, mint az MCE-lemezek esetében, a membránok nemkívánatos háttérfestésének elkerülése érdekében. Mindazonáltal a kimutatott foltok felbontása az élesség és a homogenitás tekintetében jobb volt a PVDF-membránokon (nem látható), ami az MCE-membránokhoz képest nagyobb foltszámot eredményezett (akár 10-szer több IE-1 stimuláció esetén, 155 vs. 13/200 000 PBMC medián SFC-vel; 5. ábra). Mivel a PVDF 8 lyukú csíkok nagyobb teljesítményt mutattak, és mivel használatuk lehetővé teheti a költségek csökkentését, különösen akkor, ha a klinikai rutinban egyetlen beteg mintáit vizsgálják, a PVDF 8 lyukú csík formátumot választottuk az optimalizált assay kifejlesztéséhez.

A mikrotiterlemezek befogadó antitesttel való optimális bevonása kulcsfontosságú a vizsgálat robusztus teljesítményéhez. A PVDF-membránhoz kötött IFN-γ befogadó antitest sűrűségének nem szabad korlátozónak lennie, és különösen lehetővé kell tennie a magas pontszámok megbízható kimutatását. A PVDF-csíkokat növekvő koncentrációjú (2,5-7,5 μg/ml) anti-IFN-γ antitesttel vontuk be. Öt CMV-szeropozitív donor PBMC-jét a bevont lyukakba ültettük, és vagy nem stimuláltuk, vagy T-aktivált® IE-1-gyel vagy pp65-tel stimuláltuk. A 2,5 és 7,5 μg/ml közötti tartományban a növekvő antitestkoncentráció nem volt hatással a háttérfestésre a stimulálatlan PBMC-ben (az SFC mediánja 0 és 0,5/200 000 PBMC között volt, függetlenül az IFN-γ befogadó antitest koncentrációjától; 6a-b ábra). Hasonlóképpen, az IE-1-specifikus alacsony-közepes SFC-szintek (medián 19-26 SFC/200 000 PBMC) hasonlóak voltak minden bevonat-antitest körülmények között (6a. ábra). Ugyanez volt igaz a pp65-specifikus válaszokra ~300 SFC/200 000 PBMC-ig (donorok d032, d120 és d241; 6c. ábra). Ezzel szemben a magasabb pontszámú egyéni donoroknál (pl. d172, d202; 6c. ábra) a pp65-reaktív sejtek kimutatása dózisfüggő módon nőtt a bevonáshoz használt IFN-γ befogadó antitest koncentrációjával, különösen 2,5 és 5 μg/ml antitest között. Az 5 μg/ml és az azt meghaladó antitestkoncentrációknál a foltok száma stabil maradt (6b-c. ábra). Ezen eredmények alapján az optimalizált ELISpot protokollban a bevonáshoz 5 μg/ml IFN-γ befogadó antitest koncentrációt választottunk.

Az ELISpot-próbák a befogott citokin kimutatásán alapulnak citokin-specifikus antitestekkel, amelyek vagy közvetlenül kapcsolódnak egy riporterenzimhez (egylépéses próbafejlesztés), mint például az alkalikus foszfatáz (AP), vagy egy biotinilált másodlagos antitest és egy sztreptavidin-konjugált riporterenzim kombinációja (kétlépéses próbafejlesztés). Az egylépéses tesztfejlesztés megtakarítja a kezelési időt és megelőzi a kezelői hibákat. A standardizált ELISpot protokollban AP-konjugált mAb-t (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Németország) használtunk detektáló konjugátumként. Különböző inkubációs paramétereket (pl. 0,5-3 óra 37 °C-on, 2 óra szobahőmérsékleten ) teszteltünk. A foltok száma minden körülmények között összehasonlítható volt. A spotok morfológiája és így a megfelelő detektálás azonban a többi körülményhez képest az AP-konjugáttal való 2 órás RT-n történő inkubáláskor volt a legjobb (nem látható). A detektáló konjugátum koncentrációjának 0,025-ről 0,4 U/ml-re történő növelése a pp65 SFC medián értékeinek enyhe emelkedését eredményezte, és a maximális foltszámok meghaladták a kétlépéses próbafejlesztés által generált értékeket (nem látható). Ezért a 0,4 U/ml detektáló konjugátummal történő egylépéses, RT-n 2 órán át tartó próbafejlesztést választottuk.

Végül az SFC festési reakció standardizálásával foglalkoztunk a próba teljes optimalizálása érdekében. Az AP-szubsztráttal való inkubáció időtartama befolyásolja a foltok méretét és/vagy a háttérszintet, és ezért kritikus fontosságú a megbízható foltszámláláshoz. Festőoldatként egylépéses kromogén alkalikus foszfatáz NBT/BCIP szubsztrátot (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) használtunk, és sötétben 2 és 13 perc közötti inkubációs időt értékeltünk. Az SFC-számlálás minden körülmények között összehasonlítható volt. A rövidebb inkubációs idő azonban kisebb foltátmérőt eredményezett, míg a hosszabb inkubációs idő fokozott háttérszintet eredményezett (az adatok nem láthatóak). Ezért az optimalizált ELISpot protokollhoz hat perc sötétben történő festési időtartamot határoztunk meg.

Az optimalizált CMV ELISpot assay linearitása és pontossága

Az optimalizált ELISpot protokollt a PBMC azon munkatartományának meghatározására használtuk, amely biztosítja az assay linearitását. Egy egészséges CMV-szeropozitív donorból származó PBMC-t ültettünk be 2 × 104 és 2,5 × 105 PBMC/lyuk sűrűséggel. A lyukankénti 6 × 104 és 2 × 105 PBMC közötti sejtszámok esetében az ELISpotok száma közvetlenül arányos volt a beültetett PBMC-k számával, IE-1 (lineáris regressziós elemzés; R2 = 0,97) vagy pp65 (R2 = 0,99) stimulációt követően (7a. ábra). Az IE-1 stimulációból eredő, általában alacsonyabb spotszám miatt a standardizált ELISpot-teszthez 2 × 105 PBMC/lyuk használatát választottuk a megfelelő SFC-értékek biztosítása érdekében.

A CMV-reaktív effektorsejtek száma és a megszámlált SFC közötti linearitás további ellenőrzéséhez egy CMV-szeropozitív egészséges donorból származó PBMC növekvő számát vetettük be, majd a PBMC összlétszámát egy CMV-szeronegatív donorból származó PBMC-vel 2 x 105-re állítottuk be kutanként. E kísérletekhez két olyan donorpárt (d034 + d219, d204 + d067) választottunk, amelyek 19 órás ko-kultúrában nem mutattak allo-reaktivitást. Az alacsony SFC számok miatt (20 SFC/200 000 PBMC alatt) az IE-1 stimulációs eredmények a pp65-höz képest nagyobb variabilitást mutattak, és nem tették lehetővé a megbízható linearitás kiszámítását (0,96 alatti R2 értékek; az adatok nem láthatóak). A pp65 stimulációt követő ELISpot vizsgálat eredményei mindkét donorpár esetében jó lineáris korrelációt mutattak, a lineáris regressziós elemzés során az R2 értékek 0,99 (d034 + d219) és 0,98 (d204 + d067) voltak (7b. ábra).

Az optimalizált vizsgálat pontosságát és ismételhetőségét az intra-assay, inter-assay, inter-operator és inter-site variabilitás kiszámításával értékeltük. Minden esetben három CMV-szeropozitív egészséges donor PBMC-jét vizsgálták négyszeresére, és a variabilitást a variációs együttható (CV) kiszámításával értékelték, amelyet a standard eltérés és az átlag hányadosaként határoztak meg. A < 10 SFC/200 000 PBMC ELISpot értékekre vonatkozó CV-t nem számoltuk ki (lásd alább a pozitivitás határértékének kiszámítását). A vizsgálaton belüli CV elérte a 14%-ot az IE-1 stimuláció és a 6%-ot a pp65 stimuláció esetében (Additional File 1: S1 táblázat). A CV az IE-1 esetében nem haladta meg a 17%-ot, a pp65 esetében pedig a 22%-ot (Additional File 1: S2 táblázat). Az IE-1 és a pp65 esetében az operátorok közötti CV 13% és 18% alatt volt (Additional File 1: S3 táblázat). Végül értékeltük a helyszínek közötti szórást, amely alapvető fontosságú a diagnosztikai célú tesztek validálásához. Három CMV-szeropozitív egészséges donortól egyszerre vettünk teljes vérmintákat, amelyeket (állandó RT körülmények között) négy különböző németországi laboratóriumba szállítottunk. A PBMC-ket frissen izolálták, és az ELISpot-teszteket az optimalizált protokoll szerint összesen 7 operátor végezte el. A helyszínek közötti CV az IE-1 esetében elérte a 39%-ot, a pp65 esetében pedig a 28%-ot (Additional File 1: Table S4).

A statisztikailag szignifikáns ELISpot eredmények eléréséhez legalább négy független mérés kiértékelése ajánlott . A replikáción belüli eltéréseknek a vizsgálat eredményére gyakorolt hatását vizsgálva összehasonlítottuk az egyes kontroll- és antigénstimulációk öt- és négyszeres méréseinek ELISpot eredményeit. Nem találtunk szignifikáns eltérést a vizsgálati eredményekben (az adatok nem láthatóak). Ezért a stimulálatlan és a T-aktivált® IE-1- és pp65-stimulált körülmények négyszeres mérései lehetővé teszik a vizsgálat megbízhatóságát, valamint a 8 lyukú csíkok használatával kombinálva a gyakorlati alkalmazhatóságot.

A sztafilococcus enterotoxin B (SEB) egy erős szuperantigén, a fitohemagglutinin (PHA) pedig egy erős mitogén, mindkettő a T-sejtek masszív IFN-γ kiválasztását indukálja . Így a SEB és a PHA megfelelő pozitív kontrollok a sejtek életképességére, a citokinszekréció sikeres stimulálására és a T-sejtek általános funkcionalitására. Ez különösen fontos az eredmények értelmezése szempontjából, ha alacsony T-sejtfrekvencia várható, például allogén őssejt-transzplantációban részesülőknél. Az optimalizált ELISpot-tesztben a vizsgálati minták SEB-vel vagy PHA-val történő stimulációját két példányban végezzük el.

Ezeken kívül egy effektorsejt-független operátori kontrollt is létrehoztunk a teszt megfelelő teljesítményének validálása érdekében. Ez az üzemeltetői ellenőrzés a rekombináns IFN-γ kimutatásán alapul az immobilizált anti-humán-IFN-γ mAb (1-D1K) befogadó antitesttel történő közvetlen inkubáció során. Ennek a szintén két példányban végzett ellenőrzésnek a PVDF-membrán homogén sötét festését kell eredményeznie.

Technikai vizsgálat validálása: pozitivitási határérték meghatározása

Az IFN-γ ELISpot vizsgálat eredményeinek könnyebb értelmezése és a specificitás maximalizálása (azaz a hamis pozitív eredmények elkerülése a stimulálatlan körülmények között és a stimulált körülmények között CMV-szeronegatív egyéneknél) érdekében technikai határértéket határoztunk meg. Az IFN-γ ELISpot vizsgálatokat az optimalizált protokoll szerint 45 egészséges donor PBMC-jén végeztük el, amelyek közül 32 CMV IgG-szeropozitív volt (1. táblázat).

A CMV-szeronegatív és CMV-szeropozitív egyének stimulálatlan PBMC-jéből származó SFC-értékek átlaga és tartománya hasonló volt . A CMV-szeronegatív személyek IE-1- és pp65-stimulált PBMC-jeiben a spotszámok alacsonyak voltak . CMV-szeropozitív egyénekben az IE-1- és pp65-stimulált PBMC SFC-szintje elérte az 1114 és 954 spotszám/200 000 PBMC-t (22, illetve 265 medián; 8. ábra). A technikai cut-off meghatározásához a CMV-széronegatív és CMV-széropozitív egyének stimulálatlan kontroll, valamint T-aktivált® pp65- és IE-1-stimulált körülmények között mért pontszámát vették figyelembe. A pozitivitási küszöbértéket a log10-transzformált geometriai átlagértékek z-statisztikája (α-szint = 0,05) segítségével határoztuk meg. A = 0 értékeket a kimutatási határhoz közeli értékekkel helyettesítettük, amelyet 0,5 értéknek tekintettünk. Az ELISpot mérések standard eltérése (SD) a stimulálatlan kontroll, az IE-1 stimuláció és a pp65 stimuláció esetében 0,234, 0,192 és 0,136 volt. A 0,2 SD-t figyelembe véve, és feltételezve, hogy minden negatív kontroll és vizsgálati minta esetében 4 ismétlést mértünk, kiszámítottuk azt a kritériumot, hogy a stimulált és a nem stimulált értékek geometriai átlagainak aránya legalább 2,5 legyen. Másrészt precíziós profilokat készítettünk mind az IE-1-, mind a pp65-specifikus vizsgálati eredményekből, ahol a vizsgálat érvényességének elfogadási határaként 40%-nál nem nagyobb variációs együtthatót (CV) használtunk a megfelelő mennyiségi határérték (LoQ) meghatározásához. A 45 egészséges donorból származó IE-1- és pp65-specifikus ELISpot-eredmények precizitási profiljai 8,6, illetve 7,1 LoQ-értéket adtak (Additional File 2). Megjegyzendő, hogy a 124 hemodializált betegből álló kohorszon végzett hasonló elemzés hasonló SD-értékeket mutatott stimulálatlan és antigénnel stimulált körülmények között (tartomány 0,199-0,240), és 7,8 (IE-1) és 8,3 (pp65) LoQ-értéket eredményezett. Ezen elemzések alapján a pozitív teszteredmény meghatározásához 10 SFC/200 000 PBMC határértéket választottunk.

Összességében, a T-aktivált® pp65 és IE-1 antigéneket és az optimalizált IFN-γ ELISpot-tesztet használva a vizsgálati eredmények akkor tekinthetők pozitívnak, ha a pp65 vagy IE1 stimulációból származó foltok geometriai átlaga ≥ 10 SFC/200 000 PBMC, és ha a stimulált és a nem stimulált körülmények geometriai átlagának aránya ≥ 2. Az eredmények akkor tekinthetők pozitívnak, ha a pp65 vagy IE1 stimulációból származó foltok geometriai átlaga ≥ 10 SFC/200 000 PBMC.5. E definíciók szerint 45 egészséges donor (32 CMV IgG-szeropozitív, 13 CMV IgG-szeronegatív) kollektívája 97%-os érzékenységet (az elsődleges referencia mérési eljárásként használt CMV IgG-szerológiával való pozitív egyezésként definiálva) és 85%-os specificitást (CMV IgG-szerológiával való negatív egyezés) mutatott (8. ábra).

Funkcionális assay validáció: A T-aktivált antigének a klinikailag releváns CMV-reaktív effektorsejtek széles spektrumát stimulálják

A rekombináns (T-aktivált®) fehérjéket mind az exogén (MHC II. osztályú), mind az endogén (MHC I. osztályú) antigén-feldolgozási és prezentációs útvonalak feldolgozzák . A PBMC T-aktivált® fehérjékkel történő stimulálása így jobban reprodukálja a természetes fertőzést, ami potenciálisan a klinikailag releváns CMV-reaktív sejtek széles spektrumának (pl. Th, CTL, NK, NKT sejtek; ) aktiválódását eredményezi, ami hozzájárulhat az IFN-γ ELISpot teszt magas érzékenységéhez. A T-aktivált® IE-1 és pp65 antigének által megcélzott sejtek további jellemzésére, valamint az effektorsejtek válaszának lehetséges interindividuális variabilitásának vizsgálatára az IFN-γ ELISpot vizsgálatokkal párhuzamosan intracelluláris IFN-γ festést és áramlási citometriás elemzéseket végeztünk. Hat CMV-szeropozitív egészséges donor frissen izolált PBMC-jét 19 órán keresztül T-aktivált® IE-1 és pp65 fehérjékkel stimuláltuk, és az IFN-γ-termelő sejteket az optimalizált ELISpot-mérésnek megfelelően megszámoltuk. Ugyanezeket a PBMC-készítményeket (egyenként 4 ismétlés) 6 órán keresztül stimuláltuk ugyanazzal a T-aktivált® IE-1 és pp65 fehérjetétellel, társ-stimuláló anti-CD28 és anti-CD49d antitestek jelenlétében. A felszíni markereket (CD3, CD4, CD8, CD56) és az intracelluláris IFN-γ festődést áramlási citometriával elemeztük a Módszerek részben leírtak szerint. A CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (NKT-szerű) és CD3-CD56+ (NK) limfociták IFN-γ+ szubpopulációit a 3. kiegészítő fájlban bemutatott kapuzási stratégiát követve számoltuk meg. Mind a hat donor különbözött abban a képességében, hogy IE-1- és/vagy pp65-függő választ váltson ki az IFN-γ ELISpot-tesztben. A válasz intenzitása is heterogén volt a hat donor között, az értékek 7 és 1054 SFC (IE-1 stimuláció), illetve 28 és 780 SFC (pp65 stimuláció) között mozogtak 200 000 PBMC-re vetítve (9a. ábra). Hasonlóképpen az egyes donorok az áramlási citometriával vizsgált különböző sejtszubpopulációk gyakoriságában és arányában is különböztek (9b. ábra). Érdekes módon az alacsonyabb spotszámú (d120, d300, d343; 9a. ábra) egészséges CMV-szeropozitív egyének az IFN-γ+ limfociták alacsonyabb frekvenciáját mutatták áramlási citometriával is (9b. ábra), ami kiemeli az ELISpot-próbának az alacsony és magas reagálók megkülönböztetésére való képességét. Az egyes vizsgált limfocita alpopulációk aktiválódása néhány, de nem minden donorban kimutatható volt. Például 6 donorból 4-ben (d120, d172, d300, d343) gyenge vagy erős CD4+ T-sejt-aktivációt észleltünk IE-1-re, pp65-re vagy mindkettőre adott válaszként. Hasonlóképpen, 6 donorból 5 (d172, d290, d300, d343, d361) CD8+ T-sejt aktivációt mutatott az egyik vagy mindkét stimulációs körülmények között. CD3-CD56+ (NK-sejtek) egy donorban (d120) mindkét antigénre adott válaszként jelentkezett. A CD3+CD56+ (NKT-szerű) sejtek 6 egyedből 4-ben (d120, d172 d300, d361) gyengén aktiválódtak mind az IE-1-re, mind a pp65-re adott válaszként (9b. ábra). Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy a T-aktivált® IE-1 és pp65 fehérjék képesek a CMV-specifikus effektorsejtek széles körét stimulálni. Ezek a kísérletek az egészséges CMV-szeropozitív egyének körében a válaszok nagyfokú heterogenitását is feltárták. Különösen az a megfigyelés, hogy egyes egyének mind az IE-1-re, mind a pp65-re reagálnak, hangsúlyozza a mindkét antigénre adott válasz értékelésének fontosságát. Az IE-1- és pp65-specifikus válaszok nyomon követése az optimalizált IFN-γ ELISpot-tesztben javíthatja a teszt általános érzékenységét.

.