BASIS KUTATÁS

Növekedési hormon válasz a növekedési hormont felszabadító peptid-2-re növekedési hormonhiányos Little egerekben

Cibele N. PeroniI; Cesar Y. HayashidaII; Nancy NascimentoI; Viviane C. LonguiniII; Rodrigo A. ToledoII; Paolo BartoliniI; Cyril Y. BowersIII; Sergio P.A. ToledoII

IBiotechnológiai Osztály, Nemzeti Atomenergia Bizottság (IPEN-CNEN), Cidade Universitária, São Paulo/SP, Brazília
IIFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Orvosi Tanszék, Endokrinológia, Endocrine Genetics Unit/LIM 25, São Paulo/SP, Brazília
IIITulane University Health Sciences Center, Department of Medicine, Division of Endocrinology, Endocrine Section, New Orleans, LA/USA

ABSTRACT

OBJECTIVE: Egy növekedési hormon szekretagóg, a GHRP-2, növekedési hormon-felszabadító hormonoktól független, lehetséges közvetlen, növekedési hormont felszabadító hatásának vizsgálata hipofízis szomatotróf sejtekben, inaktív növekedési hormon-felszabadító hormon receptorok jelenlétében.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK: A szérum növekedési hormon válaszait a növekedési hormont felszabadító P-2 akut injekciójára lit/lit egerekben, amelyek a mutálódott növekedési hormon-felszabadító hormonreceptorokból eredő GH-hiány modelljét képviselik, összehasonlítottuk a heterozigóta (lit/+) és a vad típusú (+/+) C57BL/6J egerekben megfigyelt válaszokkal.
Eredmények: A lit/lit egereknek 10 mcg növekedési hormont felszabadító P-2 beadása után 9,3±1,5 ng/ml növekedési hormon felszabadulást figyeltünk meg, szemben a kontrollok 1,04±1,15 ng/ml értékével (p<0,001). Ehhez képest a lit/+ egerekben és a vad típusú egerekben 34,5±9,7 ng/ml közepes, illetve 163±46 ng/ml magasabb növekedési hormonfelszabadulás indukálódott. Így a GHRP-2 stimulálta a növekedési hormont a lit/lit egerekben, és a növekedési hormon in vivo felszabadulása csak részben függhet a növekedési hormont felszabadító hormontól. Emellett a plazma leptin- és ghrelinszintjét is vizsgáltuk a lit/lit egerekben alap- és stimulált körülmények között.
Összefoglalások: Itt kimutattuk, hogy a növekedési hormon-felszabadító hormon gén csíravonal-mutációját hordozó lit/lit egerek korlátozott, de statisztikailag szignifikáns növekedési hormonszint-emelkedést tartanak fenn a GHRP-2 exogén stimulációt követően. A jelen adatok valószínűleg egy közvetlen, növekedési hormontól független hatást tükröznek a növekedési hormon S (ghrelin) stimulációjára a kis egerek megmaradt hipofízis szomatotrófjaiban, amelyet a növekedési hormon S-R 1a közvetít.

Kulcsszavak:

BEVEZETÉS

A növekedési hormon (GH) szintézisét és szekrécióját elsősorban a hipotalamusz GH-felszabadító hormon (GHRH) és szomatosztatin hormonok szabályozzák a GH és az IGF-I negatív visszacsatolásával, valamint a természetes endogén GH-felszabadító hormon, a ghrelin (1-8) által. A normális szomatotróf éréshez, proliferációhoz, valamint a szomatikus növekedéshez és fejlődéshez a GHRH-ra van szükség (9). A szomatotróf sejtek késői differenciálódási fázisaiban a GHRH aktiválja a Gs alfa, a cAMP és a protein kináz A útvonalat a sejtmembrán receptorán, a GHRH-R-en keresztül (1,10,11). Ezzel szemben a ghrelin, amelyet eredetileg patkány gyomorból és hipotalamuszból izoláltak, a növekedési hormon szekretagóg (GHS) receptorán (GHS-R 1a) keresztül hat, amely a Gq/i család tagjaihoz kapcsolódik és aktiválja a foszfolipáz C-t (2,12,13).

A szintetikus GHS-ek olyan ghrelinreceptor-agonisták, amelyek in vitro és in vivo stimulálják a GH-szekréciót. Ide tartoznak a GH-felszabadító peptidek (GHRP-k), mint például a GHRP-2, és a nem peptid vegyületek. A szintetikus GHS-ek és a ghrelin hipotalamikus hatásokon keresztül az ACTH/kortisol és a prolaktin felszabadulását is stimulálják, és kimutatták, hogy növelik a táplálékfelvételt, az energiafelhasználást, az alvást és a szívtónust (15-17). Bár kémiai szerkezetük eltérő, úgy tűnik, hogy valamennyi GHS a GHS-R-en keresztül hat a GH-szekréció és a táplálékfelvétel fokozására. A GHS-R mRNS-t azonosították az agyalapi mirigyben, a hipotalamusz íves magjában és más szövetekben (6,15-17). A maximális GH-stimulációhoz a GHRP-knek szükségük van a hipotalamusz GHRH egyidejű szekréciójára (18-21). Továbbá a ghrelin és a szintetikus GHS-ek potenciálják a GHRH által kiváltott cAMP-termelést és növelik több GHRH-R szintjét, ami a GHS-R és a GHRH közötti megváltozott kölcsönhatásokat is eredményezheti (22-25). Ebben az összefüggésben a ghrelin és a GHRP kettős és egymást kiegészítő hatása léphet fel a hipotalamuszra és az agyalapi mirigyre. Továbbá meg kell említeni a hypothalamus arcuatus magjára gyakorolt parakrin hatást, amely részt vesz a táplálékfelvétel és az energiafelhasználás szabályozásában (17).

A GHS-ek GH-szekrécióra gyakorolt hatásának domináns helye nem teljesen tisztázott. A GHS-R-eket mind az agyalapi mirigyben, mind a hipotalamuszban azonosították, és a GHS-ek bármelyik vagy mindkét helyen hathatnak. Egyes bizonyítékok arra utalnak, hogy a GHS-ek és a ghrelin GH-szekretáló hatása elsősorban a hipotalamuszban játszódhat le, és csak marginálisan hat közvetlenül az agyalapi mirigyre (25-27). Ennek megfelelően először dokumentáltak korlátozott, de statisztikailag szignifikáns GH-emelkedést (p<0,05) a GHRH-R gén csíravonalbeli mutációjából eredő alacsony termetű, GH-hiányos betegeknél GHRP2-vel történő akut stimulációt követően (28). Nem sokkal később más vizsgálatok is alátámasztották ezeket a kezdeti eredményeket (29,30), ami a GHRP-2 közvetlen hatását jelzi az agyalapi mirigyben. Az egér és a humán növekedési hormon-felszabadító hormon receptor gén (ghrhr) klónozására azt követően került sor, hogy megállapították, hogy a GH-hiányos kisegerek ghrhr Asp60Gly inaktiváló mutációjával analóg különböző mutációk GH-hiányos emberekben is előfordultak (31-37). A ghrhr mutáció lit/lit egerekben a GHRH által közvetített GH felszabadulás teljes hiányát eredményezte, amit az a megállapítás is alátámasztott, hogy a mutált GHRH-R fehérje nem kötődik a GHRH-hoz (32,33). Ahogyan az várható volt, a GHRH1-29NH2-re adott GH-válasz teljes hiányáról kis egerekben is beszámoltak (38-40). A GHRP-6-ra adott GH-válasz teljes hiányáról is beszámoltak kis egerekben (41). Mindazonáltal, mivel a GHS-ek specifikusan a GHS-R-en keresztül hatnak, ésszerű feltételezni, hogy kis egerekben GHS-kihívásra GH-válasz léphet fel. E hipotézis alátámasztására kimutatták, hogy a GHRP-2 in vitro növelte a GH felszabadulását patkány hipofízisekből, még azután is, hogy a GHRH-R-t antisense oligonukleotid megközelítéssel blokkolták (42).

A kisegér egy bevett állatmodell a GHS-ek és a ghrelin hipofízis szomatotróf sejtekre gyakorolt közvetlen, GHRH-független hatásainak értékelésére (33-35). Itt a GHRP-2-re adott GH-választ értékeltük kis egerekben (lit/lit), heterozigóta (lit/+) littermátumaikban és vad típusú (+/+) kontrollokban. Emellett a GHRH és a GHRH-R lehetséges szerepét a ghrelin szekréciójában és hatásában értékeltük az éhgyomri és táplált plazma ghrelin- és szérum leptinszintjének mérésével ezekben az állatokban.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Állatok és tartási körülmények

A kisegereket (C57BL/6J lit/lit) és heterozigóta (lit/ +) lit-társaikat a The Jackson Laboratory-tól (Bar Harbor, ME, USA) vásároltuk, és az állatházunkban (43) tenyészkolónia létesült. A mutáns egereket C57BL/6J lit/lit nőstények és C57BL/6J lit/+ hímek párosításával állítottuk elő. Mindkét nemű, 45-90 napos egereket használtunk a vizsgálatokhoz. Kontrollként vad típusú (+/+) C57BL egereket használtunk 45-90 napos korban (testtömeg ,30 g), amelyeket a São Paulo-i Egyetem Orvosi Karának Trópusi Orvosi Osztályától (São Paulo, Brazília) szereztünk be. A lit/lit és lit/+ egerek testtömege ugyanabban az életkorban körülbelül 10-12 g, illetve 20-25 g volt, amit egy érzékeny módszerrel kaptunk (43).

Az egereket 24±1ºC hőmérsékletű, légkondicionált helyiségben tartották. A vizet és a táplálékot ad libitum biztosítottuk, a fényt pedig 12 órás világos/12 órás sötét menetrend szerint szabályoztuk.

Az egerek egy csoportját koplalási körülmények között tartottuk úgy, hogy délután kb. 17:00 órakor elvettük a táplálékot. A koplaltatott és a nem koplaltatott egerek csoportjából a következő napon 09:00 órakor vért vettünk.

Ezt a kutatást a helyi etikai bizottság jóváhagyta, és megfelelt az állatkísérletek kritériumainak.

Szekvenciaelemzés

Genotipizálást végeztünk a lit/lit, lit/+ és wt/wt egerek megerősítésére és genetikai jellemzésére. Az egerek genotipizálása a laboratóriumunk standard fenolos protokolljával izolált farok-DNS PCR-amplifikációjával történt (44,45). Két primert, 5′-TGAGCTTGCATGTCTTCTTCA GG-3′ és 5′-GGGATTAGACCAGCCAGTGA-3′ (lágyulási hőmérséklet 60ºC) használtunk a kisegér fenotípust eredményező ghrhr Asp60Gly mutáció génterületének felerősítésére (24). A mutációelemzést automatizált szekvenálással végeztük a Big Dye Terminator v3.1 (310 Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével.

Az előre és a hátrafelé irányuló szálakat két DNS-mintában elemeztük. A DNS-rendellenességek azonosítására két szekvenáló szerkesztőprogramot (Gene StudioTM Professional Edition, Suwanee; és Mutation Surveyour, Softgenetics, PA, USA) használtunk.

Készítmények és injekciók

GHRP-2 (200 µg/ml; tétel KP102-HQ007; Pramorelin: D-alanyl-3-(2-naftil)-D-alanyl-L-alanyl-L-triptofil-D-fenilalanyl-L-liszinamid-dihidroklorid) a Fujisawa USA, Inc. (Deerfield, IL). Az egereknek intra-peritoneális (i.p.) injekciókat adtunk, majd megmértük őket. A kísérleti elrendezéstől függően vérmintákat vettek az orbitális sinusból a GH, az IGF-I, a leptin vagy a ghrelin méréséhez.

Immunoassays

Az egér GH (mGH) szérumszintjét házon belüli, igen érzékeny, specifikus RIA-val határoztuk meg, a National Hormone and Pituitary Program (NHPP, Torrance, CA) Dr. A. F. Parlow-tól (46) kapott reagensek felhasználásával. Minden mintát két példányban vizsgáltunk. Minden vizsgálatban belső kontrollként wt/wt C57BL és lit/lit egerek szérumait használtuk. Mindkét törzsből nyolc egeret használtunk, és az összevont (n = 8) GH-szérumszint 1,3±0,7 ng/ml volt a lit/lit egerekben és 6,5±1,8 ng/ml a wt/wt C57BL egerekben. A kezdeti GH-szintek a lit/+ egerekben nem különböztek jelentősen a wt/wt C57BL egerekétől, valószínűleg az állatok száma miatt. A késleltetett nyomjelzőanyag-adalékolással végzett GH-vizsgálat érzékenysége 0,25±0,15 ng/ml volt a Rodbard-féle definíció szerint számítva (47). A vizsgálatok közötti variációs együttható kevesebb mint 10% volt.

Az IGF-I szintjét két példányban határoztuk meg egy patkány IGF-I RIA kit (DSL-2900, Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, USA) segítségével, amelynek minimális kimutatási szintje 21 ng/ml, a mérhető koncentrációk pedig 150-4500 ng/ml között mozogtak.

A leptinszintet patkány leptin RIA kit (Linco Research Inc., St. Charles, MO, USA) segítségével határozták meg, amelynek minimális kimutatási értéke 0,2 ng/ml, mérhető koncentrációtartománya pedig 0,2-12,8 ng/ml.

A teljes ghrelin (oktanoilált + dezoctanoilált)(48) szintet patkány ghrelin RIA kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA, USA) segítségével határoztuk meg, ~5,4 pg/tube érzékenységgel és 1-128 pg/tube tartományban. Az aktív ghrelin (oktanoilált) szintjét a Linco Research kit (St. Charles, MO) segítségével határoztuk meg. E mérésekhez a vérmintákat 0,78 mg K2EDTA-t tartalmazó csövekbe gyűjtöttük (250-500 ml vér/cső), jégen tartottuk és hűtött centrifugában pörgettük. A plazmamintákhoz PMSF-et (0,1 mg/ml plazma) és 1 M HCl-t (50 ml/ml plazma) adtunk. A mintákat a ghrelinszintek méréséig -70ºC-on fagyasztva tartottuk. Az aktív ghrelin kit esetében a vizsgálaton belüli és a vizsgálatok közötti variációs együttható 6,5-9,5%, illetve 9,6-16,2% volt. A teljes ghrelin kit esetében a vizsgálaton belüli és a vizsgálatok közötti variációs együttható <10% és <15% volt.

Vizsgálat felépítése

Két csoport korban illeszkedő, vad típusú (+/+) C57BL egeret kezdetben 1 µg (32 állat/csoport) vagy 10 µg (18 állat/csoport) GHRP-2-t adtak be i.p., és a GH-mérésekhez különböző időpontokban vettek vérmintát, legfeljebb 1 órával az injekció beadása után. Minden időponthoz három egeret használtunk, és a vért csak egyszer vettük le az állatok feláldozása előtt. Egy kísérleti vizsgálatban 10 µg GHRP-2-t adtunk be i.p. 2-3 lit/lit, lit/+ és (wt/wt) egereknek (n = 18 állat/csoport), és a GH-választ az injekció beadása után 1 óráig különböző időpontokban mértük, hogy felmérjük a dózis és az időzítés hatását.

Egy független kéthetes vizsgálatot végeztünk lit/lit egerekkel, amelyeket naponta 10 µg GHRP-2-vel kezeltünk i.p. egérenként (n = 6 egér a kontroll és n = 8 egér a kísérleti csoportban). A testsúlyt megmértük, és 3-4 naponta vért vettünk a GH-, IGF-I- és leptinszintek mérésére. A testtömeg mérése a korábban leírtak szerint precíz, nagy érzékenységű módszerrel történt (40). Röviden, az állatok testtömegét a kísérlet teljes időtartama alatt naponta megmértük, majd egyéni növekedési görbék kiszámításához használtuk; a növekedési görbék meredekségét ezután válaszparaméterként használtuk. A megvilágított/megvilágított egerek esetében az elfogadható napi testtömeg-ingadozás az egyes vizsgálatok előtti utolsó tíz napban (vizsgálat előtti időszak) 0,0025±0,0045 g/napon belül volt (36,40). Így a homozigóta törpe egérpopuláció körülbelül 10%-át utasították el. A lit/lit egerek kiválasztásának kritériumai a C57BL/6J törzs homozigóta (lit/lit) és heterozigóta (lit/+) egereinek növekedési görbéin alapultak, amelyeket egy korábbi vizsgálatban már megállapítottunk (36) és az itt végzett genotipizálással tovább erősítettünk.

A hormonértékek görbe alatti területeinek értékeléséhez és összehasonlításához egy önkényes koncentrációs egységet (ng/ml/idő (perc)) határoztunk meg.

Statisztikák

A görbe alatti terület (AUC) adatokkal mért leptinszintek és hormonválaszok elemzéséhez kétirányú varianciaanalízist (ANOVA) végeztünk az idő és a kezelés független változóként. A kezelés megkezdése után kapott valamennyi értékre Student’s t-próbát alkalmaztunk Bonferroni kiigazítással. Minden más mérésnél Student párosított t-tesztet alkalmaztunk a különbségek szignifikanciájának értékelésére. p,0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.

EREDMÉNYEK

ghrhr mutációelemzés

A DNS-t máshol leírt rutinmódszerekkel nyertük lit/lit egér vérmintájából (44,45). PCR-t végeztünk korábban ismertetett primerekkel, majd a ghrhr gén szekvenciaelemzését végeztük el.

A lit/lit egérben egy csíravonalbeli homozigóta ghrhr Asp60Gly mutációt igazoltak, míg a lit/+ egerekben heterozigóta ghrhr Asp60Gly mutációt igazoltak. Ezzel szemben a vad típusú (+/+) C57BL/6J egerek nem hordozták ezt a csíravonal-mutációt (1. ábra). Ezek az adatok megerősítették a jelen vizsgálatban használt három egérvonal genotípusát, illetve genotípusát: +/+, Asp60Asp; lit/+, Asp60Gly és lit/lit, Gly60Gly (1. ábra).

Bazális GH- és IGF-I-szintek normál és homozigóta egerekben

A 18 homozigóta lit/lit egér átlagos bazális mGH-szintje (1,16±0,97 ng/ml; tartomány, 0,28-4.0 ng/ml) szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a 46 vad típusú (+/+) kontrollban (5,36±2,60 ng/ml; tartomány, 1,05-14,0 ng/ml; p<0,001) vagy 12 heterozigóta (lit/+) lit-társukban (6,60±2,35 ng/ml; tartomány, 4,25-11,5 ng/ml; p<0,001) megfigyelt értékek. Továbbá a lit/+ és +/+ egereknél megfigyelt bazális GH-koncentrációk nem különböztek jelentősen.

A 8 lit/lit egérben a szérum IGF-I bazális értéke (231±103 ng/ml; tartomány, 120-420) egyértelműen alacsonyabb volt, mint a 8 +/+ kontrollban (473±104 ng/ml; tartomány, 330560 ng/ml; p<0,001).

A GH reakciója az akut GHRP-2 beadásra

Eredetileg kimutatták, hogy a C57BL vad típusú kontroll egerekben a GH növekedése 1 µg GHRP-2-re szignifikánsan kisebb volt (~kétszeres növekedés az alapszinthez képest), mint a 10 mg i.p. GHRp-2-re adott válaszként (24-szeres növekedés az alapértékekhez képest; p<0,05). Így a 10 µg GHRP-2 dózist választottuk a GH-válaszok értékeléséhez a három egércsoportban (+/+, lit/+ és lit/lit).

A kontrollcsoportban (+/+) a GH-válasz átlagos csúcsértéke 163 ng/ml volt, és 10 perccel a GHRP-2 beadása után következett be, a kiindulási szinthez képest 24-szeres növekedéssel (2. ábra). A lit/+ és lit/lit egerekben a GHRP-2-re adott GH-válasz 5-10 perc alatt szignifikáns volt. Húsz perccel a GHRP-2 beadása után a GH-szintek visszatértek a kiindulási értékekhez.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a homozigóta lit/lit egerekben megfigyelt 10 µg GHRP-2-re adott GH-válasz (9,3±1,5 ng/ml; tartomány 8-11 ng/ml) szignifikánsan magasabb volt, mint a sóoldattal injektált lit/lit egerekben (1,04±1,15 ng/ml; p<0,001). Továbbá, a GH válasza a GHRP-2-re a lit/lit egerekben szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a heterozigóta (lit/+) lit-társakban (9,3±1,5 ng/ml vs. 34,5±9,7 ng/ml; p<0,01) vagy a vad típusú ( +/+) egerekben (163±46 ng/ml; p<0,005). Így a GHRP-2-re adott GH-válasz a lit/+ egerekben köztes volt a lit/lit és +/+ egerekben megfigyeltekhez képest (2. ábra).

Az abszolút GH-növekedés a kiindulási értékhez képest a lit/lit, lit/+ és +/+ egerekben 8,3, 28,8, illetve 156 ng/ml volt, ami megerősíti a GH-szekréció jelentős különbségeit a három vizsgált egértörzs között. A GH-szint növekedése a kiindulási értékhez képest 10 µg GHRP-2 akut beadását követően nem különbözött szignifikánsan a lit/lit és a lit/+ egerek között (8,9-vs. 6,1-szeres; p>0,05). A GHRP-2-re adott GH-növekedés azonban szignifikánsan csökkent a lit/lit (p<0,005) és a lit/+ egerekben (p<0,01) a kontrollokhoz képest. A GHRP-2 akut beadására válaszul a szérum GH egyedi görbe alatti területei (AUC) tovább erősítették a GHRP-2- és a sóoldattal kezelt lit/lit egerek közötti jelentős különbségeket (3. ábra).

Válaszok a GHRP-2 kéthetes beadására

Amint az várható volt, a lit/lit egereknél a testsúly jelentős növekedése volt megfigyelhető, amikor két héten keresztül naponta egyszer 10 µg GHRP-2-t adtak be i.p. (49) a kontroll-vivőanyag beadásához képest (p<0,02; 4. ábra). A GH- és IGF-I-szintek azonban nem emelkedtek szignifikánsan a GHRP-2 kéthetes beadása során (az adatok nem láthatóak). Továbbá, a GHRP-2 kezelés 15. napján jelentősen emelkedett (p<0,005) leptinszintet figyeltünk meg a lit/lit egerekben.

Szérum ghrelin- és leptinszintek

A plazma acil ghrelin és a teljes (acil + deacil) ghrelin koncentrációit, amelyeknek független és egymással összefüggő biológiai hatásai lehetnek, valamint a szérum leptin koncentrációit a +/+, lit/+ és lit/lit egerekben éhező és táplált állapotban az 1. táblázat mutatja. Éhező állapotban a lit/lit egerek átlagos plazma acil ghrelin és teljes ghrelin szintje szignifikánsan alacsonyabb volt (78,9%-kal, illetve 37,6%-kal), mint a +/+ egereké. A heterozigóta lit/+ egereknél szintén szignifikánsan alacsonyabb volt az éhgyomri acil ghrelin és az összes ghrelin szintje (80,5%-kal, illetve 44,9%-kal) a kontrollokhoz képest. A lit/lit egerekben a plazma acil-ghrelin szintje táplált állapotban 93,8%-kal magasabb volt, mint éhgyomri állapotban. Ezzel szemben a vad típusú egerekben a plazma acil ghrelin 82,5%-kal (p<0,001), az összes ghrelin pedig 61%-kal (p<0,001) volt alacsonyabb a táplált állapotban, mint az éheztetett állapotban. Az etetett állapotú plazma acil-ghrelin szintjének különbsége a két csoport között (157±70 pg/ml a +/+ egereknél vs. 67±18 pg/ml a lit/lit egereknél) szignifikáns volt (p<0,05). Továbbá a lit/lit egereknél az összes ghrelinszint 23,4%-kal magasabb volt éhgyomri állapotban, mint táplált állapotban.

A szérum leptinszintje az éheztetett lit/lit egereknél 348%-kal magasabb volt, mint az éheztetett +/+ egereknél (p<0,005). Az éheztetett lit/+ egerek szintén különböztek a lit/lit (50%-kal alacsonyabb, p<0,02) és a +/+ egerektől (123%-kal magasabb, p<0,005). Továbbá a lit/lit egereknél a szérum leptinszintje táplált állapotban 35%-kal csökkent az éheztetett állapothoz képest (p>0,05). Ezenkívül a lit/+ és +/+ etetett egerekben a leptinszint 37%-kal, illetve 16%-kal magasabb volt, mint az éheztetett állatokban (p>0,05).

Megbeszélés

Egerekben számos spontán homozigóta csíravonal-mutációt dokumentáltak, amelyek az agyalapi mirigy hormonok hiányát és törpeséget eredményeznek (34). Így az Ames törpe egerek fenotípusa a Prop1 gén mutációjából ered, és több hipofízis-hormon, köztük a GH veleszületett hiányát mutatja (50). Ezenkívül a Pit gén mutációival rendelkező Snell törpe egereknél GH-hiányból eredő törpeség, hypothyreosis és meddőség fordul elő (51). Továbbá a kis egerek fenotípusa a ghrh-r gén homozigóta mutációjából ered (33). A PROP1, a PIT és a GHRH-R gének homozigóta csíravonal-mutációival egyenértékű, súlyos alacsony termetű emberekről számoltak be (37,52,53).

A GHRH-R mutációk kifejezetten a GHRP-2-re adott GH-válasz hiányát okozzák emberekben (54). Számos más vizsgálat azonban korlátozott, de statisztikailag szignifikáns GH-növekedést dokumentált a GHRP-2 beadása után ezeknek a betegeknek (28-30). Hasonlóképpen felvetették, hogy a kisegér rezisztens a GHRP-2 hatásával szemben, és nem mutat GH-növekedést e peptid beadása után (41). Így a jelen vizsgálat fő célja annak vizsgálata volt, hogy a kisegerek abszolút rezisztenciával rendelkeznek-e a GHRP-k hatásával szemben, ahogyan azt korábban leírták, vagy statisztikailag szignifikáns GH-választ mutatnak-e az egyik GHRP-re, azaz a GHRP-2-re, ahogyan azt emberekben megfigyelték. A szérumban lévő kisebb GH-változások kimutatására egy továbbfejlesztett mGH-módszert alkalmaztunk, hogy jobban megkülönböztessük a GHRP-2 adását követő esetleges GH-növekedést.

Tudomásunk szerint eddig egyetlen más közlemény sem vizsgálta újra kifejezetten ezt a kérdést kisegereken. Megjegyzendő, hogy ghrh-knockout egerekben teljes GH-rezisztenciát dokumentáltak a GHRP-2-vel szemben. A ghrh-knockout egerek és a kisegerek azonban különböző génekben mutálódtak, bár fenotípusuk hasonló. Továbbá a különböző GH-módszerek és kísérleti körülmények befolyásolhatták ezeket a látszólag ellentmondásos eredményeket.

GHRP-2-re adott GH-válaszok

A szomatotróf sejtek fejlődése és működése GHRH-függő (1), amint azt a ghrhr homozigóta mutációját hordozó lit/lit egerek akut GHRP-2 beadására adott korlátozott GH-válaszról szóló eredményeink is jelzik. Feltételezve, hogy a ghrhr teljesen inaktív a lit/lit egerekben (39), jelen eredményeink arra utalnak, hogy legalább némi GHRH-független GHS-GH felszabadulás a GHS-R aktiválásán keresztül történik.

Az érett GHRH-függő szomatotrófok mellett GH-termelő őssejteket találtunk lit/lit egerek hipofízisében és 60 napos felnőtt egerekben (26).

Nem ismert azonban, hogy a GHRP-2 és/vagy a ghrelin a GH-termelő őssejtek számára a GHRH hipofízis hatásától függetlenül trofikus faktorként hatnak-e.

A korábban közölt GH-válasz hiánya lit/lit egerekben egy másik típusú GHS-re, a GHRP-6-ra (41), összefügghet azzal, hogy kevésbé érzékeny GH-tesztet használtak (10 ng/ml vs. 0,25 ng/ml a mi tesztünkben). Továbbá a GHRP-2 nagyobb biológiai hatékonysággal rendelkezik (körülbelül hatszor nagyobb) a GH felszabadulásának kiváltásában, mint a GHRP-6 (14-16). A GHRP-6-ra adott GH-válaszok hiányát eredetileg Glu72Stop GHRH-R mutációval rendelkező embereknél is feltételezték (42). Több más vizsgálat is dokumentálta azonban a GHRP-2-re adott statisztikailag szignifikáns, bár csökkent GH-válasz jelenlétét olyan genetikai alacsony termetű betegeknél, akik súlyosan csonka GHRHRHR-gént hordoznak (28-30).

Továbbá sem akut, sem krónikus GH-emelkedést nem észleltek ghrh-knockout egerekben, és arra a következtetésre jutottak, hogy a GHRP-2 növekedést serkentő hatása fokozza a JI-38 által kiváltott választ (55,56). Fontos azonban megjegyezni, hogy a) a knockout egerek és a hasonló vagy akár egyenértékű spontán csíravonal-mutációkat hordozó állatok eltérő módon viselkedhetnek; b) a kisegerek és a knockout egerek vizsgálatához használt mGH-módszerek eltérőek lehetnek; és c) ezekben a vizsgálatokban eltérő kísérleti terveket alkalmaztak (28-30,55,56).

A lit/+ egerekben a GHRP-2-re adott köztes GH-válaszok a szomatotróf sejtek minőségi és/vagy mennyiségi különbségeinek következményei lehetnek, bár további kutatásokat kell végezni ebben a témában, hogy ezeket az eredményeket megerősítsük. Ezek az adatok genetikai dózishatásra utalhatnak a szomatotróf sejtek működésére, amely az életkor függvényében egyre romlik. Hasonlóan genetikai dózishatást javasoltak korábban a GHRHR gén mutációját hordozó esetek esetében (52).

Fontos, hogy GH RIA-módszerünk elfogadható pontossággal tudta kimutatni a nagyon alacsony GH-szintek (~0,25 ng/ml) jelenlétét kis egerekben; hasonló adatok ritkán állnak rendelkezésre az irodalomban. Mások alacsonyabb érzékenységű GH-készleteket használtak. Nem találtunk azonban más olyan beszámolót, amely lit/lit egerek specifikus homológ RIA-val kapott szérum GH-szintjeivel foglalkozott volna. Cheng és munkatársai 0,61±0,09 ng/ml szérum GH-szintet jelentettek hím és nőstény lit/lit egerekben, valamint 8,50±0,75 ng/ml és 2,85±0,33 ng/ml-t hím és nőstény lit/+ egerekben. Marmary és munkatársai 1,08±0,06 ng/ml és 20,35±22,9 ng/ml szérum GH-szintről számoltak be Snell törpe egerekben és kontroll litertársaikban (58). A heterológ patkány GH RIA segítségével meghatározott szérum GH abszolút szintjének magas becsléséről is beszámoltak (59,60).

Növekedés a GHRP-2 beadását követően

Ebben a vizsgálatban a kis egerek testtömegének határozott növekedését figyelték meg a GHRP-2 beadását követően.

Ezek az eredmények összhangban vannak más vizsgálatokkal, amelyek jelentős testsúlynövekedést dokumentáltak a GHRP-2-vel kezelt ghrh-knockout egereknél és a ghrelin adását követő egereknél, ami azt mutatja, hogy mindkét peptid elhízást indukál ezekben az állatokban (61). Megjegyzendő, hogy Alba és munkatársai nem figyeltek meg növekedést a ghrh-knockout egerek hosszanti növekedésében a napi kétszer 10 µg-os dózisban szubkután (s.c.) beadott GH RP-2 hathetes kezelése során, ami megerősítette a GHRH kulcsfontosságú szerepét a GH szekrécióban és az azt követő testnövekedésben (48). Ezenkívül a krónikus hathetes kezelés 10 µg s.c. GHRP-2-vel nem növelte az akut GH-választ (30 perc). Ez az ap szülő eltérés a mi eredményeinktől a vérvétel idejében vagy a GH-mérés érzékenységében mutatkozó különbségekből, a gyógyszer beadásának különböző módszereiből (s.c. vs. i.p.) vagy e tényezők kombinációjából adódhatott.

Leptin- és ghrelinszintek a lit/lit egerekben

Megvizsgáltuk azt is, hogy a GHRP-2 befolyásolja-e a leptin- és ghrelinszinteket.

A vad típusú +/+ egerekben magasabb volt az acil-ghrelin és az összes ghrelin éhomi szintje, mint a táplált egerekben (61-63). A plazma ghrelin fiziológiai szabályozása (azaz növekedése és csökkenése éhgyomri, illetve táplált állapotban) eltérő volt a lit/lit egerekben. Ez a megállapítás a GHRH és az inaktív GHRH-R hatásának hiányából adódhat, bár ezt a hipotézist tovább kell vizsgálni.

Az ipamorelinnel kezelt egereknél is megfigyeltek magas alapszintű szérum leptinszintet és további emelkedést a GHRP-2 hosszan tartó adását követően lit/lit egerekben (34). Ezek az eredmények a GH-hiányos egerekben megnövekedett zsírszöveti tömeget és a GHRP-2 és a ghrelin adipogén hatását tükrözik (61-63).

Az egerekben e peptidek lipogén hatásának vizsgálatához a jelen vizsgálatban használt GHRP-2 dózisok hasonlóak voltak a Tschop és munkatársai által használtakhoz, valamint a Jansson és munkatársai és Lall és munkatársai által használt GHRP-6 dózisokhoz (38,49,61). A testtömeg alapján azonban ezek a dózisok arányosan sokkal magasabbak voltak, mint a GHRH-R mutációval rendelkező embereken vizsgáltak, ami a GHRH-R-re való érzékenység fajközi különbségeit tükrözheti (61).

A táplált vs. éheztetett (17 h) vad típusú (+/+) és lit/lit egerek (-/-) octanoil ghrelin (ghrelin) és szérum leptin szintjére vonatkozó korlátozott adataink e két metabolikus hormon közötti diszfunkcionális kapcsolatra utalhatnak. A várakozásoknak megfelelően a plazma ghrelin szintje normális volt az etetett vad típusú egerekben és emelkedett az éheztetett vad típusú egerekben, bár az ellenkező hatást is megfigyeltük, mivel a ghrelin és a leptin emelkedett az etetett állapotban és nem emelkedett tovább az éheztetett állapotban. Emellett a lit (+/-) egerek eredményei részben párhuzamosak voltak a lit (-/-) egerek eredményeivel, mivel a plazma ghrelinszintje nem emelkedett koplalással, és koplalás alatt a szérum leptinszintje emelkedett maradt a táplált és koplalt lit (+/és -/-) egerekben. A vizsgált állatok korlátozott száma azonban megakadályozta további következtetések levonását. Végül, a teljes ghrelin mérése, mint az oktanoil-ghrelin szintjének indikátora problematikus lehet. Bár a teljes és az oktanoilált ghrelin szintje részben párhuzamos lehet egymással, ez az egyezés patofiziológiai körülmények között, mint például a jelen egérvizsgálatban, kevésbé nyilvánvalóvá válik. Egyre több bizonyíték támasztja alá a desoktanoil ghrelin molekula biológiai aktivitását, és így viszont támogatja a plazma desoktanoilált ghrelin szintjének mérését olyan specifikus teszttel, mint amilyen az Akamizu és munkatársai által publikált (64).

Végeredményben a mi eredményeink az elsők, amelyek statisztikailag szignifikáns GH-növekedés jelenlétét dokumentálják a GHRP-2 beadását követően kis egerekben. Az adatok további alátámasztják a GHRP-2 közvetlen hatását a kisegerek agyalapi mirigyében. Továbbá a heterozigóta lit/+ egereknél a GHRH/GHRH-R/GH tengelyükben finom zavarok lehetnek, ami genetikai dózishatásra utal, bár további adatokra van szükség e következtetés megerősítéséhez.

HÁTTALÁLLÍTÁSOK

Megköszönjük Cristina T. Kanamura, B.S., és Venâncio A. F. Alves, M.D., a São Pauló-i Adolfo Lutz Intézet patológiai osztályáról, a technikai támogatásért. Szeretnénk köszönetet mondani Dr. Heitor F. Andrade Jr-nak, aki a C57BL wt/wt állatokat biztosította. Ezt a kutatást részben a FAPESP (01/11091-0) támogatta. S.P.A.T. és P.B. a Nemzeti Kutatási Tanács (CNPq) kutatói. RAT a FAPESP posztdoktori ösztöndíjasa (2009/15386-6). SPAT a CNPq ösztöndíjának és támogatásának (401990/2010-9) kedvezményezettje.

AUTORI SZERZŐDÉSEK

Peroni CN, Nascimento N és Bartolini P végezték a kísérleteket és közreműködtek a kézirat elkészítésében. Hayashida CY közreműködött a kézirat megírásában. Toledo RA és Longuini VC végezte a genetikai elemzéseket. Bowers CY közreműködött a terméktesztelésben (ghrp-2), a ghrelin és leptin mérésekben és a kézirat elkészítésében. Toledo SP írta és koordinálta a kutatási projektet, és ő volt a kézirat elkészítéséért felelős vezető kutató.

1. Mayo KE, Miller TL, De Almeida V, Zheng J, Godfrey PA. A növekedési hormon-felszabadító hormon receptor: jelátvitel, génexpresszió és fiziológiai funkció a növekedés szabályozásában. Ann N Y Acad Sci. 1996;805:184-203, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.1996.tb17483.x.

2. Kojima M, Hosada H, Date Y, Nakazato M, Matsui H, Kangawa K. Ghrelin egy növekedési hormon-felszabadító acilált peptid a gyomorból. Nature. 1999;402:656-60, http://dx.doi.org/10.1038/45230.

3. Nass R, Gaylinn BD, Thorner MO. A ghrelin szerepe a GH-szekrécióban és a GH-rendellenességekben. Mol Cell Endocrinol. 2011;340:10-4, http://dx.doi.org/10.1016/j.mce.2011.03.021.

4. Gahete MD, Durán-Prado M, Luque RM, Martínez-Fuentes AJ, Quintero A, Gutiérrez-Pascual E, et al. Understanding the multifactorial control of growth hormone release by somatotropes: lessons from comparative endocrinology. Ann N Y Acad Sci. 2009;1163:137-53, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.2008.03660.x.

5. Kamenicky P, Lombès M, Chanson P. Új ismeretek a növekedési hormon fiziológiájáról és patofiziológiájáról. Ann Endocrinol (Paris). 2010;71(Suppl 1):S25-32, http://dx.doi.org/10.1016/S0003-4266(10)70004-4.

6. Cannata D, Vijayakumar A, Fierz Y, LeRoith D. The GH/IGF-1 axis in growth and development: new insights derived from animal models. Adv Pediatr. 2010;57:331-51, http://dx.doi.org/10.1016/j.yapd.2010.

7. Veldhuis JD, Bowers CY. A GH-felszabadító hormon és a GH-felszabadító peptid szinergiájának meghatározói férfiaknál. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009;296:E1085-92, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.91001.2008.

9. Frohman LA, Kineman RD, Kamegai J, Park S, Teixeira LT, Coschigano KT, et al. Secretagogues and the somatotrope: signaling and proliferation. Rec. Prog Horm Res. 2000;55:269-91.

10. De Almeida VI, Mayo KE. A növekedési hormon-felszabadító hormon receptor. Vitam Horm. 2001;63:233-76, http://dx.doi.org/10.1016/S0083-6729(01)63008-5.

11. Olsen LE, Rosenfeld MG. Perspektíva: genetikai és genomikai megközelítések az agyalapi mirigy fejlődési mechanizmusainak felderítésében. Endokrinológia. 2002;143:2007-11, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.6.2007.

12. Howard AD, Feighner SD, Cully DF, Arena JP, Liberator PA, Rosenblum CI, et al. A növekedési hormon felszabadításában szerepet játszó receptor az agyalapi mirigyben és a hipotalamuszban. Science. 1996;273:974-77, http://dx.doi.org/10.1126/science.273.5277.974.

13. Horvath TL, Diano S, Sotonyi P, Heiman M, Tschop M. Minireview: ghrelin and the regulation of energy balance-a hypothalamic perspective. Endokrinológia. 2001;142:4163-9, http://dx.doi.org/10.1210/en.142.10.4163.

14. Bowers CY. Növekedési hormont felszabadító peptid (GHRP). Cell Mol Life Sci. 1998;54:1316-29, http://dx.doi.org/10.1007/s000180050257.

15. Bowers CY. GH felszabadító peptidek (GHRP-k). In: Kostyo J, Goodman H eds. Az élettan kézikönyve. New York: Oxford University Press. 1999;267-97.

16. Bowers CY. A nem természetes növekedési hormont felszabadító peptid természetes ghrelint nemz. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:1464-69, http://dx.doi.org/ 10.1210/jc.86.4.1464.

17. Laferrere B, Hart AB, Bowers CY. Elhízott személyek reagálnak a ghrelin agonista növekedési hormon-felszabadító peptid-2 növekedési hormon-felszabadító peptid-2 táplálékfelvételt serkentő hatására. Obesity (Elhízás). 2006;14:1056-63, http://dx.doi.org/10.1038/oby.2006.121.

18. Dickson SL, Doutrelant-Viltart O, Leng G. GH-hiányos dw/dw patkányok és lit/lit egerek fokozott Fos expressziót mutatnak a hypothalamus arcuate nucleusban a GH-felszabadító peptid-6 szisztémás injekcióját követően. J Endocrinol. 1995;146:519-26, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1460519.

19. Yokote R, Sato M, Matsubara S, Ohye H, Niimi M, Murao K, et al. A növekedési hormon-felszabadító peptid receptor molekuláris klónozása és génexpressziója patkányszövetekben. Peptides. 1998;19:15-20, http://dx.doi.org/10.1016/S0196-9781(97)00263-5.

20. Ribeiro AC, LeSauter J, Dupré C, Pfaff DW. Az arousal és a cirkadián anticipációs viselkedés kapcsolata: ventromedialis hipotalamusz: az éhség-arousal hálózat egyik csomópontja. Eur J Neurosci. 2009;30(9):1730-8, http://dx.doi.org/10.1111/j.1460-9568.2009.06969.x.

21. Tamura H, Kamegai J, Shimizu T, Ishii S, Sugihara H, Oikawa S. A ghrelin stimulálja a GH-t, de nem az élelmiszerfelvételt az arcuate nucleus ablated patkányokban. Endokrinológia. 2002;143:3268-75, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220268.

22. Bowers CY, Reynolds GA, Durham D, Barrera CM, Pezzoli SS, Thorner MO. A növekedési hormon (GH)-felszabadító peptid serkenti a GH felszabadulását normál férfiaknál és szinergikusan a GH-felszabadító hormonnal. J Clin Endocrinol Metab. 1990;70:975-82, http://dx.doi.org/10.1210/jcem-70-4-975.

23. Pandya N, DeMott-Friberg R, Bowers CY, Barkan AL, Jaffe CA. A növekedési hormont (GH) felszabadító peptid-6-nak szüksége van endogén hipotalamikus GH-felszabadító hormonra a maximális GH-stimulációhoz. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:1186-89, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.4.1186.

24. Horikawa R, Tachibana T, Katsumata M, Ishikawa H, Tanaka T. A hipofízis növekedési hormon-szekretagóg és növekedési hormon-felszabadító hormon receptor RNS expressziójának szabályozása fiatal törpepatkányokban. Endocr J. 2000;47:S53-S56, http://dx.doi.org/10.1507/endocrj.47.SupplMarch_S53.

25. Cunha SR, Mayo KE. A ghrelin és a növekedési hormon (GH) szekretagógok potenciálják a GH-felszabadító hormon (GHRH) által kiváltott ciklikus adenóz 39,59monofoszfát termelést transzfektált GHRH és GH szekretagóg receptorokat expresszáló sejtekben. Endokrinológia. 2002;143:4570-82, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220670.

26. Dickson SL, leng G, Dyball RE, Smith RG. Peptid és nem peptid növekedési hormon szekretagógok központi hatásai patkányban. Neuroend okrinológia. 1995;61:36-43, http://dx.doi.org/10.1159/000126825.

27. Popovic V, Damjanovic S, Micic D, Djurovic M, Diegez C, Casanueva FF. A növekedési hormon-felszabadító peptid (GHRP-6) által kiváltott GH-szekréció blokkolása és a GHRP-6 plusz GH-felszabadító hormon szinergikus hatásának hiánya hypothalamopituitary disconnectionban szenvedő betegeknél: bizonyíték arra, hogy a GHRP-6 fő hatása a hypothalamus szintjén érvényesül. J Clin Endocrinol Metab. 1995;80:942-47, http://dx.doi.org/10.1210/jc.80.3.942.

28. Gondo RG, Aguiar-Oliveira MH, Hayashida CY, Toledo SP, Abelin N, Levine MA, et al. Growth hormone-releasing peptide-2 stimulálja a GH-szekréciót GH-hiányos, mutált GH-releasing hormon receptorral rendelkező betegeknél. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:3279-83, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.7.3279.

29. Maheshwari HG, Pezzoli SS, Rahim A, Shalet SM, Thorner MO, Baumann G. A pulzáló növekedési hormon szekréció genetikai növekedési hormon-felszabadító hormon rezisztencia esetén is fennáll. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002;282:E943-E951.

30. Roelfsema F, Biermasz NR, Veldman RG, Veldhuis JD, Frölich M, Stokvis-Brantsma WH, et al. Growth hormone (GH) secretion inactivating defect of the GH-releasing hormone (GHRH) receptor inactivating defect in patients is pulsatile: evidence for a role for a non-GHRH inputs in the generation of GH pulses. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:2459-64, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.6.2459.

31. Mayo KE. A növekedési hormon-felszabadító hormon hipofízis-specifikus receptorának molekuláris klónozása és expressziója. Mol Endocrinol. 1992;6:1734-44, http://dx.doi.org/10.1210/me.6.10.1734.

32. Godfrey P, Rahal JO, Beamer WG, Copeland NG, Jenkins NA, Mayo KE. A kisegerek GHRH receptora egy missense mutációt tartalmaz az extracelluláris doménben, amely megzavarja a receptorfunkciót. Nat Genet. 1993;4:227-32, http://dx.doi.org/10.1038/ng0793-227.

33. Lin SC, Lin CR, Gukovsky I, Lusis AJ, Sawchenko PE, Rosenfeld MG. A kisegér fenotípus molekuláris alapjai és a sejttípus-specifikus növekedés következményei. Nature. 1993;364:208-13, http://dx.doi.org/10.1038/364208a0.

34. Beck JA, Lloyd S, Hafezparast M, Lennon-Pierce M, Eppig JT, Festing MFW, et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 2000;24:235, http://dx.doi.org/10.1038/71641.

35. Wajnrajch MP, Gertner JM, Harbison MD, Chua SC Jr, Leibel RL. Nonsense mutáció a humán növekedési hormon-felszabadító hormon receptorban a kis (lit) egérrel analóg növekedési elégtelenséget okoz. Nat Genet. 1996;12:88-90, http://dx.doi.org/10.1038/ng0196-88.

36. Netchine I, Talon P, Dastot F, Vitaux F, Goossens M, Amselem S. A GH-releasing hormon receptor gén mutációja által okozott növekedési hormon (GH) hiányban szenvedő család kiterjedt fenotípusos elemzése. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:432-36, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.2.432.

37. Salvatori R, Hayashida CY, Aguiar-Oliveira MH, Phillips JA 3rd, Souza AH, Gondo RG, et al. Familial dwarfism due to a novel mutation of the growth hormone-releasing hormone receptor gene. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:917-23, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.917.

38. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG, Frohman LA. Receptor-asszociált rezisztencia a növekedési hormon -felszabadító faktorral szemben törpe ”kis” egerekben. Science. 1986;232:511-2.

39. Gaylinn BD, De Almeida VI, Lyons CE Jr, Wu KC, Mayo KE, Thorner MO. A kisegér mutáns növekedési hormon-felszabadító hormon (GHRH) receptora nem köti a GHRH-t. Endokrinológia. 1999;140:5066-74, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.11.5066.

40. Clark RG, Robinson ICAF. A humán növekedési hormon-felszabadító faktor egy fragmentumának hatásai normál és kis egerekben. J Endocrinol. 1985;106:1-5, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1060001.

41. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG & Frohman LA. A törpe kis (lit/lit) egér rezisztens a növekedési hormon (GH)-felszabadító peptiddel (GHRP-6), valamint a GH-felszabadító hormonnal (GRH) szemben. Program of the 68th Annual Meeting of the Endocrine Society, Anaheim, CA, 1986; p.130 (abstract).

42. Roh SG, Chen C, Choi KC, Shrestha Y, Sasaki S. A GHRH receptor nélkülözhetetlen a GHRP-2-indukált GH-szekrécióhoz primer tenyésztett patkány hipofízis sejtekben? Endocrinology. 2002;143:1964-47, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.5.1964.

43. Bellini MH, Bartolini P. In vivo bioteszt a humán növekedési hormon hatékonyságának meghatározására törpe ”kis egerekben”. Endocrinology. 1993;132:2051-55, http://dx.doi.org/10.1210/en.132.5.2051.

44. Lourenço DM Jr, Toledo RA, Coutinho FL, Margarido LC, Siqueira SA, dos Santos MA, et al. A klinikai és genetikai szűrések hatása az 1-es típusú multiplex endokrin neoplázia kezelésére. Clinics. 2007;62:465-76, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322007000400014.

45. Toledo RA, Mendonça BB, Fragoso MCBV, Soares IC, Almeida MQ, Moraes MB, et al. Izolált familiáris szomatotropinóma: 11q13-loh és gén/fehérje-expressziós elemzés az aip lehetséges részvételére utal a nem hipofízis tumorigenezisben is. Clinics. 2010;65:40715, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322010000400010.

46. Rodbard D. A minimálisan kimutatható koncentráció (érzékenység) statisztikai becslése radioligandumvizsgálatokhoz. Anal Biochem. 1978;90:1-12, http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(78)90002-7.

47. Bellini MH, Mathor MB, De Luca M, Cancedda R, Bartolini P. Ultraszenzitív in vivo bioassay kimutatja a bioaktív humán növekedési hormont transzdukált primer humán keratinocitákban. J Endocrinol Invest. 1998;21:1-6, http://dx.doi.org/10.3109/07435809809031865.

48. Ghigo E, Arvat E, Muccioli G, Camanni F. Növekedési hormont felszabadító peptidek. Eur J Endocrinol. 1997;136:445-60, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1360445.

49. Lall S, Tung LYC, Ohlsson C, Jansson JO, Dickson SL. A növekedési hormon(GH)-független adipozitás stimulálása GH-szekretagógok által. Biochem Biophys Res Commun. 2001;280:132-38, http://dx.doi.org/10.1006/bbrc.2000.4065.

50. Sornson MW, Sornson MW, Wu W, Dasen JS, Flynn SE, Norman DJ, O’Connell SM, et al. Pituitary lineage determination by the Prophet of Pit-1 homeodomain factor defective in Ames dwarfism. Nature. 1996; 384:327-33, http://dx.doi.org/10.1038/384327a0.

51. Li S, Crenshaw EB 3rd, Rawson EJ, Simmons DM, Swanson LW, Rosenfeld MG, Dwarf locus mutants lacking three hypuitary cell types result from mutations in the POU-domain gene pit-1. Nature. 1990;347:528-33, http://dx.doi.org/10.1038/347528a0.

52. Hayashida CY, Gondo RG, Ferrari C, Toledo SP, Salvatori R, Levine MA, et al. Familial growth hormone deficiency with mutated GHRH receptor gene: clinical and hormonal findings in homozygous and heterozygous individuals from Itabaianinha. Eur J Endocrinol. 2000;142:557-63, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1420557.

53. Pernasetti F, Toledo SP, Vasilyev VV, Hayashida CY, Cogan JD, Ferrari C, et al. Impaired adrenocorticotropin-adrenal axis in combined hypophysis hormone deficiency caused by a two-base pair deletion (301-302delAG) in the prophet of Pit-1 gene. J Clin Endocrinol Metab. 2000;85:390-7, http://dx.doi.org/10.1210/jc.85.1.390.

54. Maheshwari HG, Rahim A, Shalet SM, Baumann G. A GH-felszabadító peptid hexarelinre adott növekedési hormon (GH) válasz szelektív hiánya GH-felszabadító hormon receptor hiányban szenvedő betegeknél. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:956-59, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.956.

55. Fintini D, Alba M, Schally AV, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. Egy növekedési hormon-felszabadító hormon analóggal és egy növekedési hormon szekretagóggal történő kombinált hosszú távú kezelés hatásai a növekedési hormon-felszabadító hormon knock out egérben. Neuroen dokrinology. 2005;82:198-207, http://dx.doi.org/10.1159/000092520.

56. Alba M, Fintini D, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. A növekedési hormont felszabadító peptid-2-vel történő hosszú távú kezelés hatásai a GHRH knockout egérben. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005;289:E762-E767, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.00203.2005.

57. Cheng TC, Beamer WG, Phillips JA, Bartke A, Mallonee RL, Dowling C. A növekedési hormonhiány etiológiája Little, Ames és Snell törpe egerekben. Endokrinológia. 1983;113:1669-78, http://dx.doi.org/10.1210/endo-113-5-1669.

58. Marmary Y, Parlow AF, Goldsmith CM, He X, Wellner RB, Satomura K, et al. Construction and in vivo efficacy of a replication-deficient recombinant adenovirus encoding murine growth hormone. Endokrinológia. 1999;140:260-65, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.1.260.

59. Hammer RE, Palmiter RD, Brinster RL. Egér örökletes növekedési rendellenesség részleges korrekciója egy új gén csíravonalba történő beépítésével. Nature. 1984;311:65-7, http://dx.doi.org/10.1038/311065a0.

60. Hahn TM, Copeland KC, Woo SLC. A törpeség fenotípusos korrekciója a növekedési hormon konstitutív expressziójával. Endocrinology. 1996;137:4988-93, http://dx.doi.org/10.1210/en.137.11.4988.

61. Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. A ghrelin adipozitást indukál rágcsálókban. Nature. 2000;407:908-13, http://dx.doi.org/10.1038/35038090.

62. Toshinai K, Mondal MS, Nakazato M, Date Y, Murakami N, Kojima M, et al. Upregulation of ghrelin expression in the stomach upon fasting, insulin-induced hypoglycemia, and leptin administration. Biochem Biophys Res Commun. 2001;281:1220-25, http://dx.doi.org/10.1006/ bbrc.2001.4518.

63. Tschop M, Statnich MA, Suter TM, Heiman ML. A GH-felszabadító peptid-2 növeli a zsírtömeget az NPY-t hiányoló egerekben: a hipotalamusz aguti-related protein döntő közvetítő szerepére utaló jel. Endocrinology. 2002;143:558-68, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.2.558.

64. Akamizu T, Shinomiya T, Irako T, Fukunaga M, Nakai Y, Nakai Y, et al. Az acilált és desacil ghrelin plazmaszintjének elkülönített mérése egészséges személyeknél egy új direkt ELISA assay segítségével. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90:6-9, http://dx.doi.org/10.1210/jc.2004-1640.