Baktérium izolálása és RdFucI azonosítása

Egy Dél-Koreában gyűjtött abalone bélből izoláltunk egy kolóniát, amely a Laminaria Japonicából (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) származó l-fucoidánt tartalmazó táptalajon nőtt ki egyedüli szénforrásként (Additional file 1: S1 ábra). A 16S riboszómális RNS-en alapuló szekvenciaazonosság NCBI-adatbázissal való összehasonlítása kimutatta, hogy az izolátum filogenetikai szempontból közel áll a Raoultella nemzetség tagjaihoz (Additional file 1: S1. ábra). Így az izolált törzset Raoultella sp. KDH14 néven azonosítottuk. A teljes genomszekvenálás elvégzése után az RdFucI-t a génszekvencia azonossága alapján a Raoultella sp. KDH14-ből azonosították.

A RdFucI 595 aminosavból áll, molekulatömege 65,5 kDa, izoelektromos pontja 5,5. A BLAST (basic local alignment search tool) eredményei azt mutatták, hogy az RdFucI szekvenciaazonossága nagy (> 90%) a Raoultella, Klebsiella és Citrobacter családokba tartozó különböző baktériumokból származó más l-FucI-kkal.

Az azonosított RdFucI-t E. coli BL21(DE3)-ban N-terminális hexa-hisztidin taggel túltermeltük és his-tag affinitás kromatográfiával tisztítottuk. Nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemezve az egyetlen sáv 65 kDa körül jelent meg, ami összhangban van a monomer alegység számított molekulatömegével.

Az RdFucI által katalizált reakció az l-fukóz képződésének kedvez

Az RdFucI izomeráz aktivitásának vizsgálatához az enzimreakciót l-fukózzal vagy l-fukulózzal mint szubsztráttal végeztük (2. ábra). Meghatároztuk az enzim aktivitását az előremenő (l-fukózból l-fukulózzá) és a fordított (l-fukulózból l-fukózzá) reakciókhoz. Az l-fukulóz előállítását l-fukózból vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) és gázkromatográfiás/tömegspektrometriai elemzéssel (GC/MS) igazoltuk (Additional file 2: S2. ábra). Az l-fukóz és az l-fukulóz közötti konverzióban nem volt megfigyelhető melléktermék, ami azt jelenti, hogy egy szubsztrátból egy termék keletkezik (Additional file 2: S2. ábra). Így indokoltnak tartjuk, hogy az l-fukulóz koncentrációjának kísérleti mérésével számított l-fukulóz mennyiségét használjuk. 2. ábra

Az RdFucI által végzett enzimatikus átalakítás a l-fukóz l-fukulózzá (előremenő reakció) és b l-fukulóz l-fukózzá (fordított reakció). Az enzimatikus reakciót 3 µg RdFucI 3 µg RdFucI és 10 mM a l-fukóz vagy b l-fukulóz mint kiindulási szubsztrát között végeztük 30 °C-on 10 percig 20 mM nátrium-foszfátban (pH 7,0), 1 mM Mn2+ jelenlétében. Az l-fukóz koncentrációt kísérletileg mértük, az l-fukulóz koncentrációt pedig úgy számoltuk ki, hogy a kísérletileg meghatározott l-fukóz koncentrációt kivontuk az összes cukor koncentrációjából (10 mM). A kísérleti adatok három ismétlés átlagai ± standard eltérések

A fordított reakció 6,6-szor gyorsabb volt, mint az előremenő reakció, és az l-fukulóz specifikus aktivitása (63,9 U/mg) nagyobb volt, mint az l-fukózé (9,6 U/mg). Mindkét reakcióban az l-fukóz és az l-fukulóz közötti egyensúlyi arány, amelyet kísérletileg határoztunk meg, körülbelül 9:1 volt, így az egyensúlyi állandó (Keq) 0,11 volt. A Keq értékét elméletileg is 0,23-ban határoztuk meg, a reakció standard Gibbs-féle szabad energiaváltozásának és az egyensúlyi Keq-nek a termodinamikai összefüggése alapján, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{\text{eq}}\), ahol R és T a gázállandó (8,314 J/mol K), illetve a hőmérséklet (K). \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }\) a BioCyc adatbázisban (https://biocyc.org) szereplő standard Gibbs-féle szabad energiaváltozás az l-fukóz l-fukulózzá történő reakciójára (0,859993 kcal/mol). A Keq kísérleti és elméleti értékei között némi eltérés volt. A Keq < 1 azt jelzi, hogy a fordított reakció előnyös. Az RdFucI-katalizált izomerizáció a fordított reakciót részesítette előnyben, 30 °C-on és 7-es pH-n l-fukulózból l-fukózt állított elő körülbelül 90%-os hozammal.

A hőmérséklet és a pH hatása az RdFucI aktivitására és az egyensúlyra

Az enzimatikus reakciókat különböző, 10 és 80 °C közötti hőmérsékleten és 4 és 11 közötti pH-n végeztük el, l-fukulózzal mint szubsztráttal (3. ábra). Az l-fukulóz l-fukózzá történő izomerizációja az RdFucI által erősen függött a hőmérséklettől, és a maximális vagy közel maximális aktivitás (> a maximum 80%-a) 30 és 50 °C közötti hőmérsékleten mutatkozott (3a. ábra). A hőmérsékletnek az l-fukózból l-fukulózzá történő izomerizáció egyensúlyára gyakorolt hatásának vizsgálatához megvizsgáltuk az egyensúlyi arányt 30, 40 és 50 °C-on, amelyeken maximális vagy közel maximális aktivitás (> a maximum 80%-a) mutatkozott. Ennek eredményeként nem volt szignifikáns különbség az egyensúlyi arányban a három hőmérséklet között (l-fukóz/l-fukulóz = 9:1; p > 0,05). Más szóval az l-fukóz minden vizsgált hőmérsékleten körülbelül 90%-os hozammal szintetizálódott l-fukulózból (Additional file 3: S3a ábra).

a hőmérséklet és b pH hatása az RdFucI relatív aktivitására az l-fukulózzal szemben. Az enzimatikus reakciókat a 10 és 80 °C közötti különböző hőmérsékleteken és b 4 és 11 közötti különböző pH-értékeken végeztük. A felhasznált pufferek 50 mM nátrium-acetát (pH 4, 5 és 6), 50 mM nátrium-foszfát (pH 6, 7 és 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8 és 9) és 50 mM glicin-NaOH (9, 10 és 11) voltak. A kísérleti adatok három ismétlés átlagai ± standard eltérések

A pH hatását vizsgáltuk. Az RdFucI magas aktivitását (> a maximum 70%-a) lúgos és közel semleges pH-n (pH 9, 10 és 11, illetve pH 6, 7 és 8) figyeltük meg. A pH 6 alatt az enzim aktivitása meredeken csökkent, pH 4-nél kevés aktivitást figyeltünk meg. A lúgos körülmények közötti magas specifikus aktivitás ellenére az l-fukóz hozam egyensúlyi állapotban (60 perces inkubáció) sokkal alacsonyabb volt pH 10-nél (54%), mint pH 7-nél (88%) (Additional file 3: S3b ábra). A 7, 8 és 9-es pH-n mért relatív aktivitások sokkal alacsonyabbak voltak Tris-HCl pufferben, mint a nátrium-acetát vagy glicin-NaOH pufferben mért aktivitások, ami arra utal, hogy a Tris erősen gátolta az RdFucI enzimaktivitását. Az előző enzimatikus kísérleteket ebben a tanulmányban 1 mM Tris-t tartalmazó reakcióelegyekben végeztük, ami az enzim tisztítása utáni puffercsere lépésből származott. Annak vizsgálatára, hogy a reakcióelegyben lévő Tris gátolhatja-e az RdFucI-t, összehasonlítottuk az 1 mM Tris hiányában és jelenlétében lejátszódó reakciókból származó izomerizációs aktivitásokat (Additional file 4: S4 ábra). A két reakcióból származó enzimaktivitásokban nem volt szignifikáns különbség, ami azt jelzi, hogy 1 mM Tris nem gátolja az RdFucI aktivitását.

Fémionok hatása az RdFucI aktivitására

A cukorizomerázok, köztük az l-fukóz izomerázok, kétértékű kationokat, mint például Mn2+ és Co2+, igényelnek kofaktorként az izomerizációs aktivitásukhoz . A kétértékű kationoknak az RdFucI l-fukulózzal szembeni katalitikus aktivitására gyakorolt hatásának vizsgálatához az enzimaktivitást 1 mM különböző fémionok vagy etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA) hiányában és jelenlétében vizsgáltuk (1. táblázat). A fémionoknak vagy EDTA-nak nem kitett natív RdFucI enzim alacsony aktivitást mutatott, és a fémek EDTA-val történő kelátképzése csökkentette az enzim aktivitását. A vizsgált fémionok közül a Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ és Zn2+ az enzimaktivitás kifejezett növekedését eredményezte. Különösen a Mn2+ hozzáadása növelte maximálisan, körülbelül 7,4-szeresére az RdFucI aktivitását. Ezzel szemben a Ca2+, Cu2+ és Fe3+ inkább gátolta az RdFucI aktivitását.

Az RdFucI szubsztrátspecificitása és kinetikai paraméterei

A cukor- és cukor-foszfát izomerázok általában széles specificitást mutatnak a különböző szubsztrátok iránt . Annak felmérésére, hogy az RdFucI l-fukulózzal kimutatott ketózkedvelő aktivitása más szubsztrátokkal is nyilvánvaló-e, az RdFucI szubsztrátspecificitását különböző aldózcukrokkal (l-fukóz, d-arabinóz, d-altróz, d-galaktóz, d-mannóz és d-glükóz) és a megfelelő ketózcukrokkal (l-fukulóz, d-ribulóz, d-psicóz, d-tagatóz és d-fruktóz) szemben vizsgáltuk (4. ábra). Mindezen szubsztrátok közül, beleértve az aldóz- és ketózcukrokat is, a legmagasabb aktivitást az l-fukulóz (115,3 U/mg) és a d-ribulóz (127,3 U/mg) esetében figyeltük meg, amelyek mindkettő ketózcukor. Az RdFucI aktivitása az l-fukulóz és a d-ribulóz esetében sokkal magasabb volt, mint a többi szubsztrát esetében. Az aldózcukrok közül az l-fukóz aktivitása volt a legmagasabb (21,0 U/mg), a többi szubsztrát esetében a fajlagos aktivitás 4,7 és 7,9 U/mg között mozgott. Az l-fukulóz és a d-ribulóz kivételével a ketózcukrok fajlagos aktivitása 0,0 és 10,8 U/mg között volt. Így az RdFucI számára az l-fukulóz és a d-ribulóz voltak a preferált szubsztrátok, és az RdFucI ketózkedvelő aktivitása csak l-fukulóz és d-ribulóz esetén mutatkozott.

A RdFucI szubsztrátspecificitása. Az enzimreakciókat 10 mM különböző aldóz és ketóz szubsztrátokkal szemben végeztük 40 °C-on és pH 10-en. Aldóz szubsztrátként l-fukózt, d-arabinózt, d-altrózt, d-galaktózt, d-mannózt és d-glükózt használtunk. Ketóz szubsztrátként l-fukulóz, d-ribulóz, d-pszikóz, d-tagatóz és d-fruktóz került felhasználásra. A kísérleti adatok három ismétlés átlagai ± standard eltérések

A kinetikai paramétereket l-fukulóz és d-ribulóz szubsztrátokkal határoztuk meg (Additional file 5: S1 táblázat). A Km (Michaelis-állandó) és a kcat (a szubsztrát forgalmi száma) értékei az l-fukulóz esetében 1,9-, illetve 1,2-szer alacsonyabbak voltak, mint a d-ribulóz esetében. Az RdFucI katalitikus hatékonysága, amelyet kcat/Km-ben reprezentáltunk, az l-fukulóz esetében 1,5-szer nagyobb volt, mint a d-ribulóz esetében, ami azt jelzi, hogy az RdFucI szubsztrátjaként az l-fukulóz előnyben részesül.

A RdFucI kristályszerkezete

A molekuláris funkció jobb megértése érdekében meghatároztuk az RdFucI kristályszerkezetét (Additional file 6: S2 táblázat). Az RdFucI elektronsűrűség-térképét az aszimmetrikus egység hat alegységének Ser5-Arg591 maradékától jól definiáltuk. A monomer RdFucI 19 α-hélixből és 23 β-szálból áll, amelyek az N1, N2 és C doménekből állnak (5a. ábra). Az N1 domén (Ser5-Met172) α/β-hajtást vesz fel, és részt vesz az RdFucI hexamer képződésének szubsztrátfelismerésében. Az N2 (Lys173-Leu352) és C (Thr353-Arg591) domének tartalmazzák a katalitikus aktivitásban részt vevő fémkötő maradékokat (5a. ábra). Az aszimmetrikus egységben az RdFucI alegységek a D3h pszeudoszimmetriájú trimerek dimereként elrendeződő hexamer alakzatot alkotnak (5b. ábra). Ez összhangban van az analitikus méret-kiválasztó kromatográfia eredményével, amelyben az RdFucI oldatban homohexamer formájában mutatkozott (Additional file 7: Fig. S5).

Overall structure of RdFucI. a Az RdFucI monomer rajzos ábrázolása. Az RdFucI monomer N1- (sárga), N2- (rózsaszín) és C-(zöld) doménekből áll. b Az RdFucI hexamer felületi ábrázolása. Az A, B, C, D, E és F alegységeket sárga, rózsaszín, ciánkék, lila, zöld és narancssárga színnel jelöltük. A szubsztrátkötő zseb helyén lévő fémkötő helyet piros pont

A hexamer alakzatban az A alegység (teljes felület: 23011.7 Å2) négy különböző alegységgel lép kölcsönhatásba: B (határfelületi maradékok: 47/felület: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2) és E (34/1086,2 Å2). Az A alegység nem lép kölcsönhatásba a fennmaradó F alegységgel (5b. ábra). Az RdFucI A alegységének teljes eltemetett felülete 2569,1 Å2 , ami a teljes felület 27,45%-át teszi ki. Ezt az eltemetett felületet 59 hidrogénkötést és 26 sóhidat tartalmazó kölcsönhatás stabilizálja más alegységekből (Additional file 8: S3 táblázat, Additional file 9: S4 táblázat, Additional file 10: S5 táblázat, Additional file 11: S6 táblázat).

A RdFucI szubsztrátkötő helye és aktív helye

A szubsztrátkötő zsebet az A alegység N2 és C doménje és a B alegység N1 doménje alkotja (6a-c. ábra), és összesen hat szubsztrátkötő hely található a homohexamer RdFucI-ban. A szubsztrátkötő zseb bejárata, ahol a szubsztrát megközelíti, körülbelül 11 × 12,5 Å (6a. ábra). A szubsztrátkötő zseb, ahol a fémkötő hely kialakul, körülbelül 4 × 5 Å negatív töltésű felülettel rendelkezik (6b. ábra). A fémkötőhely és a szubsztrátkötő zseb felülete közötti távolság körülbelül 16,7 Å (6d. ábra), ami arra utal, hogy az aktív központ mélyen egy zsebben helyezkedik el. Ez azt jelzi, hogy a szubsztrát nyílt láncú és gyűrűs formája egyaránt hozzáférhető az aktív centrum számára, és fordítva, egy ömlesztett szacharid nem lenne hozzáférhető a szubsztrátkötő zseb belsejében létező aktív centrum számára.

A RdFucI szubsztrátkötő zseb és aktív centrum. a A szubsztrátkötő zseb az A és C alegységek összeszerelésével jön létre. b A szubsztrátkötő zseb elektrosztatikus felülete. c A szubsztrátkötő felület B-faktoros bemutatása. d A szubsztrátkötő zseb metszeti felületi nézete. e Az RdFucI 10 mM Mn2+-t tartalmazó oldatba áztatott fémkötőhelyeinek 2Fo-F elektronsűrűség-térképe (szürke háló, 1,0 σ-nál kontúrozva). f Az RdFucI

RdFucI Mn2+ -kötőhelyeinek geometriai elemzése Az RdFucI katalitikus aktivitásához kétértékű fémionokra van szükség az ene-diol mechanizmust alkalmazó izomerizációs reakcióhoz . Az RdFucI fémkötő helyét a konzervált Glu337, Asp359 és His528 maradékoknak kell koordinálniuk a Mn2+ -val (Additional file 12: S6 ábra). Nincs azonban olyan Fo-Fc elektronsűrűség-térkép (> 5σ-nél számolva), amely feltételezhetően a Mn2+-hoz, mint a szubsztrátkötéshez nélkülözhetetlen fémhez kötődik (Additional file 13: Fig. S7a). A B-faktor elemzés kimutatta, hogy a Mn2+ hőmérsékleti tényezője (70,53 Å2) magasabb, mint a fehérje átlagos hőmérsékleti tényezője (36.22 Å2), ami azt jelzi, hogy a Mn2+ alacsony foglaltsággal van jelen az RdFucI-n. Ez a megállapítás összhangban volt a biokémiai elemzés eredményével, amelyben a natív enzim alacsony aktivitást mutatott. Másrészt a Mn2+ hozzáadása jelentősen növelte az RdFucI katalitikus aktivitását (1. táblázat). Ezért feltételeztük, hogy a Mn2+ hozzáadása az RdFucI kristályhoz növeli a Mn2+ kötési foglaltságát. Miután az RdFucI kristályokat 10 mM Mn2+ oldatban áztattuk, megbízható Fo-Fc elektronsűrűséget (> 6σ) figyeltünk meg a fémkötőhelyen, ahol az Mn2+ pozíciója minden alegységben tisztázódott (6e. ábra és Additional file 13: S7b ábra). A Mn2+ hőmérsékleti B-tényezője (76,56 Å2) azonban magasabb volt, mint a teljes fehérjeé (60,69 Å2), ami arra utal, hogy az Mn2+ ion még mindig nem teljesen foglalt a fémkötőhelyen. A Mn2+-t a Glu337 OE1 (átlagos távolság: 2,62 Å) és OE2 (2,65 Å) atomjai, az Asp361 OD1 (2,72 Å) és OD2 (2,72 Å) atomjai, a His528 NE2 (2,52 Å) atomja és a vízmolekula (2,79 Å) koordinálta (6e. ábra). A Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2) és Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) átlagos kötésszöge 127,32°, 86,25° és 73,96° volt. A ligandumok és a Mn2+ közötti kötésszög torzult oktaéderes koordinációt mutatott.

Szerkezeti összehasonlítás más l-FucI-kkal

A DALI szervert használtuk szerkezeti homológok keresésére. Ez a keresés kimutatta, hogy az RdFucI hasonló az E. coli (EcFucI, PDB kód: 1FUI, Z score: 60,6, rmsd: 0,3 587 Cαs atomra), az Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z score: 56.6, rmsd: 0,7 580 Cαs atomra) és Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, Z score: 55,9, rmsd: 0,7 585 Cαs atomra). A szubsztrátkötő zseb szuperpozíciója azt mutatta, hogy a fémkötő maradékok Glu337, Asp361 és His528 (RdFucI-ban számozva) pozíciójukban megegyeznek a többi fehérjével, míg a szubsztrátfelismerő maradékok (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 és Asn524) oldalláncukban enyhe konformációs különbséget mutatnak (7a. ábra). Különösen az egyes l-FucI-k α7-α8 hurokja, amely a szubsztrátkötő zseb felszínén fekszik, eltérő konformációval rendelkezik. Az l-FucI-k szekvenciaillesztése nagyfokú hasonlóságot mutatott, de az egyes l-FucI-k α7-α8 hurokjának szekvenciája nagyon változó volt (7b. ábra). Mivel az α7-α8 hurok részt vesz a szubsztrátkötő zseb architektúrájának kialakításában, minden l-FucI egyedi szubsztrátkötő zsebet képez (7c. ábra). Az l-FucI-k általában negatív töltésű felülettel rendelkeznek a fémkötőhely körül, de a szubsztrátkötő zseb felülete különböző töltési állapotokat mutat (7c. ábra). Ennek eredményeként az α7-α8 hurok szerkezeti különbségei különbséget okoznak az l-FucI-k szubsztrátspecifitásában.

A RdFucI és más l-FucI-k szerkezeti összehasonlítása. Az RdFucI és az EcFucI (PDB-kód: 1FUI), az ApFucI (3A9R) és az SpFucI (4C20) aktív centrumának és szubsztrátkötő felületének egymásra helyezése. Közelkép az α8-α9 hurok nagy konformációs különbségéről az l-FucI-októl (balra). c Részleges szekvenciaillesztés az α8-α9 hurok régiójára az RdFucI és az EcFucI, ApFucI és SpFucI esetében. d Az RdFucI, EcFucI, ApFucI és SpFucI elektrosztatikus felületének ábrázolása. A mély szubsztrátkötő zsebet és az α8-α9 hurok régióit narancssárga, illetve fekete pontvonalak jelzik. A fémkötőhelyet sárga csillag

jelzi.