3.4 Inozin-módosítás és mRNS-forgalom
Az mRNS-ek adenozin-inozin (A-I) módosítását az RNS-enzimeken (ADAR) működő adenozin-deaminázok katalizálják. Ezek az enzimek előnyben részesítik a kettős szálú RNS-régiókat, és az A-I átalakítása (amelyet ebben a fejezetben szerkesztésnek is nevezünk) megváltoztatja a módosított bázisok bázispárosodási tulajdonságait, mivel most már a guaninhoz hasonlóan bázispárosodnak. A korábbiakhoz hasonlóan az inozinnak az mRNS stabilitására gyakorolt közvetlen hatásait elkülönítjük az indirekt hatásokból eredő hatásoktól. Az inozin bevezetése az RNS kettősszálú régióiba az inozin-tartalmú RNS-ekre specifikus ribonukleázok toborzása révén degradációt indíthat el. Az első enzim, amelyet e hatás közvetítésére javasoltak, a Tudor-staphylococcus nukleáz (SN), amelyről kimutatták, hogy extraktumokban elősegíti a hipereditált kettős szálú RNS-ek hasítását . Az ebben a tanulmányban leírt eredmények többsége a Tudor-SN biokémiai aktivitását bizonyítja a hipereditált szubsztrátokon in vitro. Ezekből a vizsgálatokból azonban nem világos, hogy az inozint tartalmazó mRNS-ek mekkora hányadát hasítja in vivo a Tudor-SN, és hogy a Tudor-SN volt-e a közvetlen endonukleáz. A Tudor-SN a citoplazmatikus stresszgranulátumokban lokalizálódott , így lehetséges, hogy egyes céltranszkriptumai stresszhelyzetben preferenciálisan szabályozódnak. A második nukleáz, amelyről ismert, hogy specifikus az inozin-tartalmú RNS-ekre, a humán endonukleáz V (hEndoV), amely számos inozin-tartalmú RNS-szubsztrátot képes in vitro hasítani . Egy tanulmány szerint a hEndoV a tényleges inozin-endonukleáz, a Tudor-SN pedig stimuláló aktivitást biztosít a hEndoV számára . Érdekes módon a hEndoV a citoplazmatikus stresszgranulumokhoz is lokalizálódik , ami a Tudor-SN-hez hasonló funkcióra utal az inozin-tartalmú mRNS-ek szintjének stressz alatti potenciális szabályozásában. Összességében, bár egyértelmű, hogy az eukarióta sejtekben léteznek inozin-specifikus nukleáz aktivitások (5. ábra), az mRNS hasításhoz és turnoverhez való hozzájárulásuk továbbra is kevéssé ismert. Ezért alaposabban fel kell tárni a Tudor-SN és/vagy hEndoV által a hipereditált dsRNS hasításának fiziológiai hatását.
Az ADAR enzimek az mRNS stabilitásában is jelentős szerepet játszhatnak azáltal, hogy szabályozzák az mRNS-bomlást befolyásoló RNS-kötő fehérjék kötődését. Az ADAR-ok hatását célmRNS-ük szintjére globálisan mértük, és általában az mRNS-szintre gyakorolt hatásuk nem korrelál jól azzal a képességükkel, hogy elősegítik az inozin képződését ezekben az mRNS-ekben . Inkább úgy tűnik, hogy az ADAR-oknak az mRNS stabilitására gyakorolt fő hatása az RNS-kötő fehérje HuR (ELAVL1) toborzásán keresztül érvényesül, amely az mRNS-bomlás egyik fő szabályozója. Az ADAR1 RNS-függő módon lép kölcsönhatásba a HuR-rel, és a legtöbb ADAR1 hiányában downregulált mRNS tartalmaz HuR-kötőhelyeket . Úgy tűnik tehát, hogy az ADAR1 befolyásolja mRNS-célpontjainak stabilitását azáltal, hogy a HuR-t a közelben található célpontokhoz toborozza. Az ADAR-ok számos mRNS és ncRNS szintjét is szabályozhatják azáltal, hogy megakadályozzák a PARN bomlási faktor, a poli(A)-specifikus nukleáz kötődését . Úgy tűnik, hogy ez a funkció független a szerkesztéstől is, mivel egy katalitikusan inaktív ADAR mutáns képes betölteni az enzim bomlásszabályozó funkcióit. Úgy tűnik tehát, hogy az ADAR-ok hatása mRNS-célpontjaik stabilitására többnyire független attól a képességüktől, hogy elősegítik az inozin képződését.
Az inozin-módosításnak az mRNS-forgalomra gyakorolt jelentős következménye az inozinnak a mikroRNS-mediált génszabályozásra gyakorolt hatása. Az inozin jelenléte ennek az útvonalnak két fő lépését befolyásolhatja: (i) a mikroRNS-ek biogenezisét és (ii) az mRNS-ek mikroRNS-ek általi célzásának specificitását. Az inozinnak a mikroRNS-ek biogenezisére gyakorolt hatását illetően kimutatták, hogy a mikroRNS-ek elsődleges prekurzorai szerkeszthetők az ADAR1 vagy ADAR2 által. Az inozin jelenléte ezekben a prekurzorokban két káros hatással van az érett mikroRNS-ek termelésére . Először is, az inozin csökkenti az elsődleges prekurzorok Drosha általi feldolgozásának hatékonyságát; másodszor, az inozintartalmú prekurzorok most az inozin-specifikus ribonukleázok, például a Tudor-SN és/vagy a hEndoV célpontjává válnak. Az inozin-módosításnak a mikroRNS-ek elsődleges prekurzoraira gyakorolt ezen kombinált hatásai az ezekből a prekurzorokból előállított mikroRNS-ek szintjének csökkenését eredményezik, a célmRNS-ek egyidejű növekedésével. Ez a folyamat szabályozható, mivel kimutatták, hogy a miR-151 mikroRNS prekurzorai a korai fejlődés során szerkesztésre kerülnek, ami a Tudor-SN prekurzorok lebontását eredményezi. Általánosabban, az inozint tartalmazó mikroRNS-ek prekurzorai lebomlanak a postzygotikus szakaszok során egerekben . Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a mikroRNS-prekurzorok A-I szerkesztése szabályozhatja biogenezisüket a fejlődés során, ami viszont közvetlenül befolyásolja mRNS-célpontjaik expresszióját. Az ADAR-ok mikroRNS-biogenezisre gyakorolt hatása azonban összetett, mivel az ADAR1-ről azt is kimutatták, hogy heterodimerizálódik a Dicer RNáz III enzimmel a mikroRNS-feldolgozás hatékonyságának növelése érdekében , így pozitív szerepet játszik a mikroRNS-biogenezisben. Az ADAR-ok kis RNS biogenezisre gyakorolt közvetlen és közvetett hatásainak komplexitását a Caenorhabditis elegansban is kimutatták genom-szerte. Végül az ADAR1 az emlőssejtekben az RNS-szerkesztéstől függetlenül is képes siRNS-eket kötni, ami korlátozza a siRNS-kezelés hatékonyságát . Ezért úgy tűnik, hogy az ADAR-ok kétélű kardot jelentenek a mikroRNS- és kis RNS-mediált géncsendítés számára, mivel az inozin-módosítás mikroRNS-prekurzorok feldolgozására és stabilitására gyakorolt szuppresszív hatását ellensúlyozhatja az ADAR-ok azon képessége, hogy a Dicerrel való társulásuk révén elősegítik a mikroRNS-feldolgozást, valamint az siRNS elérhetőségére gyakorolt hatásuk. Mindazonáltal ezek az enzimek a mikroRNS-prekurzorok szerkesztésén keresztül kulcsfontosságú szerepet játszanak a sejtdifferenciálódás szabályozásában. Például kimutatták, hogy a Let-7 mikroRNS prekurzor ADAR1 általi hipereditálása leukémiában elősegíti a leukémiás őssejtek megújulását , kiemelve a mikroRNS prekurzorok szerkesztésének finomhangolásának fontosságát a sejtdifferenciáció során.
Az inozin szintén befolyásolja a mikroRNS által közvetített mRNS szabályozást az RNS duplex képződés befolyásolásával, ami kritikus fontosságú a mikroRNS-mRNS kölcsönhatások specifitásának meghatározásában (5. ábra). Ezt először azzal mutattuk ki, hogy az inozin bevezetése a miR-376 mikroRNS-be az mRNS-ek egy másik csoportjának elnyomását eredményezte a nem módosított miR-376 által elnyomottakhoz képest. Ha a szerkesztett hely a mikroRNS magszekvenciájában található, a módosítás a mikroRNS-ek specifitásának megváltozását eredményezi, mivel az inozin előnyösen bázispárosodik a C-vel. Fordítva, az mRNS-ek 3′-UTR szekvenciáinak A-I szerkesztése megváltoztatja ezen UTR-ek mikroRNS-ek általi potenciális célpontjait, és új mikroRNS-kötőhelyeket hozhat létre . A szabályozott szerkesztésről kimutatták, hogy potenciálisan fontos lehet az onkogének és tumorszupresszor gének mikroRNS-eken keresztül történő szabályozásában a sejtek átalakulása során .
Végezetül az inozin közvetett hatásokon keresztül befolyásolhatja az mRNS stabilitását. Kiderült, hogy az inozin-tartalmú mRNS-ek az LPS-stimulált immunsejtekben a sejtmagra korlátozódnak , megakadályozva a citoplazmatikus mRNS-bomlási gépezetnek való kitettségüket. Ezeknek az mRNS-eknek a nukleáris visszatartása azonban a nukleáris degradációs útvonalak, például a nukleáris exoszóma általi preferenciális lebontásnak tenné ki őket. Ez a stabilitás növekedését vagy csökkenését eredményezheti, attól függően, hogy az egyes lebontási utak milyen relatív hatékonysággal hatnak az egyes mRNS-ekre. Az inozin hatással van az alternatív splicingre is, ami viszont eltérő stabilitású mRNS-izoformákat eredményezhet. Ez különösen akkor igaz, ha az alternatív módon spilézett fajok különböző RNS-kötő fehérjék kötőhelyeit tartalmazzák, amelyek módosítják stabilitásukat. Ezért az inozin és az ADAR-ok sokféleképpen befolyásolhatják az mRNS stabilitását és expresszióját közvetlen és közvetett hatások kombinációján keresztül.