Growth and ethanol production of S. cerevisiae NCYC 2826 búzaszalma-hidrolizátumon
Az 1A. ábra az S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 növekedését mutatja, amelyet 30°C-on 36 órán keresztül növesztettek a “Módszerek” részben leírtak szerint készített 123 mM glükózkoncentrációjú hidrolizátumot tartalmazó kultúrában. A S. cerevisiae törzset az ipari fermentációkban tapasztalt magas etanoltoleranciája és robusztussága miatt választottuk. Az 1A. ábra azt mutatja, hogy amikor az S. cerevisiae NCYC 2826-ot kizárólag búzaszalma-hidrolizátumon termesztették, a növekedési sebesség μ 0,036 h-1 volt, és a végső optikai sűrűség (OD) 0,8 volt. Élesztő tápanyagbázis (YNB) hozzáadása a táptalajhoz a μ 0,135 h-1-re és 1,5 végső OD-ra nőtt, míg 2,3 mg ml-1 karbamid hozzáadása a búzaszalma-hidrolizátumhoz 0,99 h-1 μ-et és 1,3 végső OD-t eredményezett. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a karbamid-kiegészítők növelhetik az etanoltermelést az élesztőfermentációban, és hogy maga a karbamid a legminimálisabb élesztőnövesztő közegek alapvető összetevője . Eredményeink alátámasztják ezeket a korábbi megállapításokat, megerősítve a karbamid szükségességét az élesztő közel optimális növekedéséhez. 36 óra elteltével megmértük a kultúrák etanolkoncentrációját, és a 123 mM glükózból nyert etanolhozam minden kultúra esetében a teljes elméleti hozam kb. 90%-a volt. Bár a három tenyésztési körülmények között hasonló hozamú etanol keletkezett, a növekedés lassabb volt, és a végső optikai sűrűség kisebb volt a búzaszalma-hidrolizátumon, mint amikor karbamidot vagy YNB-t adtak a kultúrához. Ez arra utal, hogy bár a glükóz rendelkezésre állt a fermentációhoz, a hidrolizátum nem tartalmazott elegendő tápelemet ahhoz, hogy a kultúra maximális sebességgel osztódjon és elérje az optimális sűrűséget.
A búzaszalma-hidrolizátumon való csökkent sejtnövekedés okának vizsgálatához a S. cerevisiae NCYC 2826-ot 5%, 10%, 15% és 20% kiindulási szalma koncentrációval készült hidrolizátumon termesztettük, amelyet 2,3 mg ml-1 karbamiddal egészítettünk ki. Az 1B. ábra azt mutatja, hogy a kiindulási szalmakoncentráció növekedésével a növekedés lag-fázisa is növekedett, 20%-os kiindulási szalmakoncentráció esetén 20 órára. A végső OD szintén nőtt a szalmakoncentráció növekedésével, a felszabaduló glükóz koncentrációjának növekedése miatt. A megnövekedett lag-fázis a szalmahidrolizátumokban gyakran jelen lévő furánvegyületek által okozott növekedési gátlásra jellemző. A hidrolizátum furántartalmának elemzése azt mutatta, hogy a HMF-tartalom elhanyagolható volt (adat nem látható), de a jelen lévő furfurol koncentrációja a szalma kezdeti koncentrációjával nőtt, elérve a 0,5 mg ml-1 értéket 20%-os kezdeti szalmatartalomnál (2. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a S. cerevisiae NCYC 2826 növekedését a búzaszalma-hidrolizátumon a hidrolizátumban jelen lévő furfurol koncentrációja korlátozza.
A ‘ Módszerek ‘ fejezetben leírtak szerint készített búzaszalma-hidrolizátumokban jelen lévő glükóz (négyzetek) és furfurol (háromszögek) koncentrációja a kiindulási szalma növekvő koncentrációjával.
Az SGRP törzskészlet furfurolra történő növekedésének elemzése
A szennyező furfurollal szemben esetleg rezisztens élesztőtörzsek azonosítása érdekében a módszerekben leírt SGRP törzskészletet YNB-ben, 100 mM glükózban és 1,5 mg ml-1 furfurol jelenlétében növesztettük. Az 1. táblázat az SGRP-törzskészlet 1,5 mg ml-1 furfurollal szembeni toleranciájának elemzését mutatja a “Módszerek” részben leírt pontozási rendszer segítségével. Az átlagos késleltetési idők helyett pontozási rendszerre volt szükség, mivel azok a törzsismétlések, amelyek nem növekedtek, nem rendelkeztek mérhető késleltetési fázissal, mégis szerepelniük kellett az adatkészletben.
Korábban megfigyeltük, hogy a furfurolt tartalmazó kultúrákban az inokulum növelése a lag-fázis csökkenéséhez vezetett, feltehetően azáltal, hogy maximalizálta a közegbe juttatott életképes élesztősejtek mennyiségét, ami a növekedés exponenciális fázisának gyorsabb kialakulásához vezetett (az adat nem látható). Ezért ezekhez a kísérletekhez 5%-os beoltási térfogatú éjszakai kultúrát használtunk. Az 1. táblázat adatai azt mutatják, hogy a replika lemezeken a növekedés rendkívül változó volt, és törzsfüggő is, ami azt bizonyítja, hogy 1,5 mg ml-1 furfurol koncentráció elegendő a S. cerevisiae és a S. paradoxus törzsek furfuroltoleranciájának megkülönböztetéséhez. Amikor a törzsek növekedését 100 mM glükózt és 2,0 vagy 3,0 mg ml-1 furfurol-t tartalmazó YNB-ben vizsgálták, a vizsgált törzsek egyikénél sem volt megfigyelhető nagyon csekély növekedés. Ezért úgy döntöttünk, hogy a törzseket az 1,5 mg ml-1 adatok alapján választjuk ki, és részletesebb furfurol-szűrésnek vetjük alá őket. Az 1. táblázatban bemutatott adatok elemzése azt mutatja, hogy a S. cerevisiae törzsek összességében jobban növekedtek, mint a S. paradoxus törzsek 1,5 mg ml-1 furfurolon. A vizsgált S. paradoxus törzsek közel 20%-a nem kapta meg a legjobb pontszámot a pontozási rendszerben, míg a S. cerevisiae esetében ez kevesebb mint 10% volt, és ez tükröződik az S. cerevisiae magasabb, 2,5 ± 1,4-es átlagos összpontszámában is, szemben a S. paradoxus 2,1 ± 1,4-es értékével. Az egyes törzscsoportokon belül azonban jelentős eltérések mutatkoztak, a pontszámok az S. cerevisiae esetében 1,7 és 3,7, az S. paradoxus esetében pedig 0,3 és 3,0 között mozogtak. Azok a törzsek, amelyek 2,9 feletti pontszámot értek el 1,5-nél kisebb szórással, jelentős furfuroltoleranciát mutattak. Következésképpen a S. cerevisiae NCYC 3284 (ex soil, USA), NCYC 3290 (ex bili bor, Nyugat-Afrika), NCYC 3312 (ex soil, Hollandia) és NCYC 3451 (ex wort, Írország) törzseket, valamint a S. paradoxus NCYC 3277 (ex oak kéreg, Egyesült Királyság) törzseket részletesebb furfurol szűrés keretében tovább vizsgálták.
A növekvő furfurol-koncentrációk hatása a növekedésre és az etanoltermelésre
A 3. ábra a S. cerevisiae NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 és NCYC 3451 törzsek (0,1-4,0 mg ml-1) és a S. paradoxus NCYC 3277 törzs növekedését mutatja különböző mennyiségű furfurol jelenlétében, amelyet az 1. táblázatban az SGRP törzskészletből a furfurollal szembeni fokozott ellenálló képességgel azonosítottak. Kiegészítő fájl 1: Az S1. ábra a megfelelő növekedési adatokat mutatja logaritmikus skálán ábrázolva. Az összehasonlítás érdekében a kontroll S. cerevisiae NCYC 2826 törzset is felvettük. Mind a hat törzs esetében a furfurol-koncentráció növekedésével a növekedési görbék a lag-fázis növekedését mutatják, ahogyan az korábban a furfurolt tartalmazó növekedéseknél megfigyelhető volt. Minden vizsgált törzs képes volt 100 mM glükózzal és 0,1-1,5 mg ml-1 furfurollal kiegészített YNB-n növekedni. A kontrolltörzsünk, a S. cerevisiae NCYC 2826 csak 1,5 mg ml-1-ig volt képes növekedni, ami a végső OD 30%-os csökkenéséhez vezetett a 0,1 mg ml-1 furfurálon történő növekedéshez képest. A 2. táblázat azt mutatja, hogy az NCYC 2826 etanoltermelése ilyen körülmények között jelentősen csökkent a YNB-n és glükózon vagy búzaszalma-hidrolizátumon történő kizárólagos termesztéskor megfigyelt kb. 90%-os hozamhoz képest. A S. cerevisiae NCYC 2826-ot szőlőmustból izolálták, így nem valószínű, hogy a furfurolnak való kitettség során fejlődött ki a növekedés és az erjedés képessége.
Liti et al. öt jól körülhatárolt, földrajzilag izolált S. cerevisiae-vonal (maláj, észak-amerikai, szaké, nyugat-afrikai és “bor/európai”), valamint e vonalak számos különböző rekombináns (mozaikos) törzsét azonosították. A jelen vizsgálat eredményeiből nyilvánvaló, hogy a furfurol-rezisztencia nem egy adott S. cerevisiae vonalra jellemző fenotípusos tulajdonság. Az azonosított négy furfurol-rezisztens SGRP S. cerevisiae törzs közül az NCYC 3284 (YPS128) az észak-amerikai, az NCYC 3290 (DBVPG 6044) a nyugat-afrikai, az NCYC 3312 (DBVPG 1373) a “bor/európai” törzsbe tartozik, míg az NCYC 3451 (az NCYC 361 egyspórás származéka) rekombináns törzs.
A S. cerevisiae NCYC 3451 mutatta a legnagyobb furfurol-rezisztenciát (3F ábra, Additional file 1: S1F ábra), és akár 3,0 mg ml-1 furfurol jelenlétében is képes volt növekedni. Továbbá úgy tűnt, hogy ebben a törzsben az etanoltermelést nem gátolja a furfurol, a legnagyobb etanolhozamot (95 ± 15%; 2. táblázat) 3,0 mg ml-1 (furfurol) koncentráció mellett érte el. Amint már említettük, az NCYC 3451 egy rekombináns törzs, és kimutatták, hogy mozaikszerű genommal rendelkezik, amely legalább három különböző törzsből származik, nevezetesen a Saké, a nyugat-afrikai és a “Wine/European” törzsből (Liti et al. ). Bár a feljegyzések szerint sörből izolálták, mint sörrontó élesztőt, e törzs rendkívül összetett genomszerkezete erősen arra utal, bár nem bizonyított, hogy ipari eredetű (például sütő- vagy sörfőző törzs). A fennmaradó négy vizsgált SGRP-törzs közül a S. cerevisiae NCYC 3290 és NCYC 3312 törzsek egyaránt képesek voltak 2,5 mg ml-1 furfurolon növekedni (3D,C ábra, kiegészítő fájl 1: S1D és S1C ábra), míg a S. cerevisiae NCYC 3284 (3E ábra, kiegészítő fájl 1: S1E ábra) és a S. paradoxus NCYC 3277 (3B ábra, kiegészítő fájl 1: S1B ábra) csak 2,0 mg ml-1 furfurolon tudtak növekedni. Összességében az öt SGRP-törzs etanoltermelését nem befolyásolta jelentősen a furfurol jelenléte. Sőt, az NCYC 3312 esetében a 0,5 mg ml-1 furfurol jelenléte az etanolhozam jelentős növekedéséhez vezetett, a várt 41 ± 8%-os hozamról 75 ± 5%-ra (2. táblázat). Ez a sörrontó NCYC 3451 törzs esetében is megfigyelhető volt, de kisebb mértékben (csak 14%-os hozamnövekedés; 2. táblázat). Valójában nemrégiben kimutatták, hogy kis mennyiségű furfuril-alkohol, a furfurol dehidratálásának terméke az élesztőben, valóban az etanoltermelés növekedéséhez vezethet .
.