MUCUS HYPERSECRETION AND CHRONIC RESPIRATORY DISEASE

Hypersecretion of mucus into the airways is an important contributor to morbidity and mortality in many patients with severe chronic tüdőbetegségek, such as chronic pulmonary obructive disease (COPD), asthma, and cystic fibrosis.35 A légutakban lévő túlzott mennyiségű nyálka korlátozhatja a légáramlást; jelenléte pedig különösen nagy kockázati tényező a mellkasi fertőzésekre hajlamos COPD-s betegek esetében. A COPD a légutak súlyos, krónikus gyulladásos betegsége, amely három állapotot foglal magában, nevezetesen a krónikus bronchitist (tartósan fennálló légúti nyálkatúltengés), a kis légutak betegségét és az emphysemát.36 Világszerte egyre nagyobb a gyakorisága és a gazdasági terhe.37,38 COPD-ben a krónikus nyálkatúltengésben szenvedő betegeknél jelentősen megnő a kórházi kezelés és a halálozás kockázata a kifejezett bronchitikus komponens nélküli betegekhez képest.39,40 A COPD jelenlegi kezelései palliatív jellegűek és nem állítják meg a betegség progresszióját,41 és nincs specifikus kezelés a nyálkahiperszekrécióra.42 A COPD patofiziológiájának bármely aspektusára hatékony terápia hiányában indokolt a nyálkahiperszekréció kezelésére szolgáló kezelések kifejlesztése. A nyálka tüdőből való kiürítésének képessége a légúti csillók mozgása révén annak viszkozitásától és rugalmasságától függ. Ezeket a tulajdonságokat a nyálka által tartalmazott mucin glikoproteinek tömegarányos aránya határozza meg.43 A MUC5AC és a MUC5B a fő mucinok mind a normális, mind a kóros emberi légúti váladékban.44 COPD-s betegeknél a MUC5AC és a MUC5B mucinok szintje megnövekszik a légúti nyálkában, bár arányosan több MUC5B választódik ki.45 A mucint a légutakba a hámban lévő goblet sejtek és a submucosa szeromucosus mirigyei választják ki.43 A nyálkaszekréció gátlásának egyik lehetősége a klostridiumok neurotoxin endopeptidázainak a vezikulafúzióra gyakorolt gátló hatásának kihasználása, a légutak mucinszekretáló sejtjeire célzottan, megfelelő célzott ligandummal.

Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy egy megfelelően célzott clostridium endopeptidáz hasítja-e a SNARE fehérjéket a humán légúti hámsejtekben, és ezáltal gátolja-e a nyálkaszekréciót, a BoNT/C és az EGF LHN doménjét kódoló, EGF-LHN/C-nek nevezett rekombináns génből fúziós fehérjét hoztak létre, amely a mucinszekretáló sejtek EGF-receptorait célozza meg.34 Az EGF-et választották prototípus ligandnak egy ilyen fúziós fehérje létrehozásához, mivel az EGF-receptorok jelen vannak az emberi légúti epitélsejteken46,47 és felszabályozottak az asztmás és COPD-s betegek,48 valamint a dohányosok légúti epitéliumában49. A rekombináns fúziós fehérje EGF-LHN/C koncentrációfüggő módon hasította a releváns SNARE-fehérjét, a szintaxint egy humán mucoepidermoid metasztatikus sejtvonalban, a H292 sejtekben in vitro.34 A H292 sejtek EGF-LHN/C-vel történő előkezelése koncentrációfüggő módon gátolja a stimulált mucinfelszabadulást az EGF és a tumor nekrózis faktor-α (TNFα) kombinált stimulusára adott válaszként, az IC50 körülbelül 0,4 nM (28-1. ábra). Ez nagyon jól összehasonlítható az EGF-LHN/C-nek egy másik légúti epitélsejtvonal, az A549 humán II. típusú alveoláris sejtvonal ugyanerre az ingerre adott stimulált mucinfelszabadulást gátló hatásával.34 Mindkét sejttípusban nem volt kimutatható az EGF-LHN/C hatása a mucinszekréció alapszintjére. A mucinszekréció EGF-LHN/C általi gátlása az EGF-LHN/C endopeptidáz-aktivitásának az EGF-receptoron keresztül történő célzott átadásának köszönhető, és nem a sejtek citotoxicitásának vagy a receptor antagonizmusának vagy downregulációjának eredménye34. Az EGF-LHN/C képes gátolni az A549 sejtek stimulált mucinfelszabadulását is egy citokinekből álló, 1 ng/ml interferon (IFN)-γ, TNFα és interleukin (IL)-1β kombinációja, az úgynevezett citomix hatására (28-2. ábra). Így az EGF-LHN/C hatása a légúti hámsejtek stimulált mucinfelszabadulására független az alkalmazott stimulus pontos jellegétől. A szövettani vizsgálat azt mutatja, hogy a mucin megmarad a kezelt sejtek belsejében (28-3. ábra). A kontroll sejtek festett intracelluláris mucint tartalmaznak, míg a stimulált sejtek jelentősen csökkent festődést mutatnak, ami mucinszekrécióra utal. Az EGF-LHN/C-vel előkezelt stimulált sejtek intracelluláris festődést mutatnak, ami az EGF-LHN/C általi szekréció gátlására utal. A sejtek ilyen intracelluláris mucin-visszatartásra adott válaszának értékeléséhez megmértük az EGF-LHN/C előkezelés hatását a MUC5AC mRNS-szintre, mint a mucinszintézis indikátorára. Az EGF-LHN/C előkezelés az EGF-TNFα által kiváltott MUC5AC mRNS-expresszió koncentrációfüggő gátlásával jár, az IC50 érték ∼0,1 nM (28-4. ábra). A sejtekből történő stimulált mucinfelszabadulás gátlásához hasonlóan az EGF-LHN/C e hatása is az endopeptidáz-aktivitásának az EGF-receptoron keresztül történő célzott átadásának köszönhető, mivel sem az EGF-receptorra irányuló EGF-ligandumot nélkülöző LHN/C, sem a fúziós fehérje mutáns formája, amelyben az endopeptidáz-domént a katalitikus régió három maradékának megváltoztatásával inaktiválták (EGF-TE-LHN/C) nem gátolja a MUC5AC mRNS expresszióját. Az EGF-LHN/C-nek a MUC5AC mRNS-expresszióra gyakorolt hatása egy lehetséges negatív visszacsatolási mechanizmus létezésére utal a légúti epitélsejtekben a mucinfelszabadulás és a mucinszintézis között, valamint arra, hogy a génexpresszió a rekombináns klostridium endopeptidáz általi szekréciógátlásra reagálva szabályozódik le.

A nyálkaszekréciót gátolni képes rekombináns klostridium-endopeptidáz fúziós fehérjék, mint például az EGF-LHN/C, terápiás fehérjeként fejleszthetők a COPD, a krónikus bronchitis, a cisztás fibrózis és más, túlzott légúti nyálkatermeléssel járó krónikus légúti betegségek kezelésére. A fehérje aktivitásának hosszú élettartama azt jelentené, hogy a terméket csak ritkán kellene belélegezni, így jól alkalmazható lenne az ilyen típusú krónikus légzőszervi betegségek kezelésére.