Junction Melting

A 3SPN.2 modell alkalmazhatóságának értékelésének első lépéseként a Holliday átmenet ömlesztett termodinamikai tulajdonságainak előrejelzésére a 3SPN.2 modell szimulációiból származó átmenet olvadási tulajdonságait értékeljük, és összehasonlítjuk az abszorpciós kísérleteinkkel. Az elágazás olvadását replikacsere-molekuladinamikával (REMD, lásd a módszereket) szimuláljuk, hogy javítsuk a részlegesen olvadt állapotok mintavételezését. Az ép, megolvadt és részben megolvadt csomóponti konfigurációk relatív arányának pontos mintavétele jelenleg nem lehetséges az összes atomot tartalmazó ábrázolással.

A 2. ábra az α egyszálas frakciót mutatja a T függvényében a sókoncentrációk tartományában a 3SPN.2 modell és az abszorpciós mérések esetében egyaránt. Az α szimulációkban történő meghatározását lásd a módszereknél. A szimulációk és a kísérletek közötti hasonlóság feltűnő. Mind a szimulációk, mind a kísérletek azt mutatják, hogy az olvadási hőmérséklet a sókoncentráció növekedésével nő, és az átmenet egyre élesebbé, azaz “kooperatívvá” válik. Az adatok jól leírhatók a tömeghatás törvényével, vagy van’t Hoff-relációval46,

A J34 átmenet olvadási tulajdonságai.

Az α egyszálas frakció összehasonlítása (a) szimulációkból és (b) kísérletekből. Az adatokat a van’t Hoff-egyenlet (1. egyenlet) segítségével illesztettük az adatokhoz, amit a folytonos vonalak jeleznek. A konvenciót követve a TM-et úgy határozzuk meg, mint azt a hőmérsékletet, amelynél α = 0,5.

ahol K az elágazás olvadásának egyensúlyi állandója, ΔH és ΔS az olvadt és ép elágazás közötti entalpia és entrópia különbség, amelyekről feltételezzük, hogy ebben a hőmérséklettartományban állandóak, C pedig az összes szál koncentrációja (az egyes szálak koncentrációja C/4). Megjegyzendő, hogy ΔS szabályozza az olvadási átmenet élességét. A továbbiakban a ΔH és ΔS viselkedését tárgyaljuk, amelyeket a 0,1<α<0,9 tartományban lévő illesztési adatokból határozunk meg.

A TM olvadási hőmérséklet a csomópont stabilitásának hasznos termodinamikai mérőszáma, és általában úgy határozzák meg, hogy az a hőmérséklet, amelyen α = 1/2. A 3. ábra a kísérleti és szimulált TM értékeket mutatja a sókoncentráció függvényében. Ahogy az olvadási görbék alapján várható volt, a szimulációk szorosan tükrözik a TM kísérleti függését. A mennyiségi hasonlóság is figyelemre méltó. A szimulációs eredmények következetesen magasabb T felé tolódnak el 5-8 K értékkel, ami kevesebb mint 3%-os különbség. Mind a kísérletek, mind a szimulációk esetében az olvadási hőmérséklet szinte független a sókoncentrációtól ≥ 200 mM esetén. Ez a függetlenség az elektrosztatikus kölcsönhatások szűrésével függ össze magas sókoncentrációknál; ennek megfelelően a 3. ábra a 3SPN.2 modellben az elektrosztatikus kölcsönhatások Debye-Hückel közelítéséhez használt Debye-szűrési hosszat is mutatja. Az árnyékolási hossz <6 Å magas sókoncentráció esetén, ami az elektrosztatikus taszítást jelentéktelenné teszi. A kísérlet és a szimuláció TM értékei közötti megfelelés igazolja az elektrosztatika közelítő kezelését a 3SPN.2 modellben. Tekintettel arra, hogy a 3SPN.2 modellt csak a duplex B-DNS olvadásának utánzására paraméterezték, a csomópontok olvadási adatai arra utalnak, hogy a 3SPN.2 modell átvihető a bonyolultabb DNS-szerkezetek termodinamikájára. Ugyanakkor ez a megállapítás nem teljesen váratlan, mivel az egyes karok olvadásának nagyon hasonlónak kell lennie a közönséges duplex DNS olvadásához.

A csomópont olvadási hőmérsékletének TM függése a sókoncentrációtól.

Minden koncentrációnál a TM <3%-kal különbözik a 3SPN.2 között. szimulációk (zöld körök) és az abszorpciós kísérletek (piros rombuszok) között. A vonalak csak szemléltetésül szolgálnak. Az ábrán látható a 3SPN.2 modell által az elektrosztatikus kölcsönhatások Debye-Hückel közelítésében használt Debye-szűrési hossz is. Az olvadási hőmérséklet platója egybeesik az elektrosztatikus kölcsönhatások erős árnyékolásával.

Az adatoknak a van’t Hoff-függvény (1. egyenlet) segítségével történő illesztése az olvadás entalpiájának és entrópiájának becslését adja. Az ebből az illesztésből származó ΔH és ΔS értékek megfelelnek a SantaLucia és munkatársai47,48 által meghatározott termodinamikai paraméterek alapján várható nagyságrendnek. A 4. ábra betétje azt mutatja, hogy a szimulációk a kísérletekhez képest szerényen túlbecsülik a ΔH és a ΔS értékeket, és hogy a ΔH közel lineárisan változik a ΔS értékével. Ezt a lineáris összefüggést néha “kompenzációs” összefüggésnek nevezik. Valójában a van’t Hoff-egyenlet egy sajátos kapcsolatot feltételez a ΔH és a ΔS között

Thermodynamics of junction melting.

A kísérletek (piros rombuszok) és a szimulációk (zöld körök) van’t Hoff-egyenletre (1. egyenlet) való illesztésével kapott olvadási entrópia ΔS és entalpia ΔH. A betoldás egy közelítő lineáris entrópia-entalpia kompenzációs összefüggést mutat. Mind a kísérleti, mind a szimulált adatok jobb egyezést mutatnak a TM-nél kiértékelt van’t Hoff-egyenlettel (2. egyenlet, kék vonal).

amely az 1. egyenletből következik, ha a TM-nél α = 1/2-t állítunk. A 4. ábra mutatja az összhangot ezzel az összefüggéssel, és egyértelművé teszi, hogy a ΔH és a ΔS közötti lineáris kiegyenlítés csak közelítő; ha a TM értékek a koncentrációval jelentősebben változnának, a ΔH és a ΔS közötti linearitástól való eltérések sokkal nyilvánvalóbbak lennének, miközben a 2. egyenletnek érvényesnek kellene maradnia. Gyakorlati szempontból fontosabb, hogy ezek az eredmények bizonyítják a 3SPN.2 modell hatékonyságát a csomópontok energetikai és termodinamikai jellemzőinek a kísérleti adatokkal szoros összhangban lévő reprodukálásában.

Konformációs abundanciák és szerkezet

A 3SPN.2 modell kísérleti csomóponti tulajdonságok előrejelzésére való képességének további vizsgálatához a csomóponti konformációk relatív populációját vizsgáljuk. Kísérleti úton ismert, hogy alacsony sókoncentráció esetén a nyitott síkbeli forma dominál, magasabb sókoncentráció esetén pedig a csomópontok egymásra rakott konformációt vesznek fel (1. ábra). Viszonylag magas koncentráció = 50 mM és T = 298 K esetén a kísérletek az I/II halmozott izoformák 23/77%-os relatív gyakoriságát jelzik15. Itt a 3SPN.2 modellt használjuk a sókoncentrációk széles tartományának vizsgálatára T = 300 K hőmérsékleten, hogy validáljuk a modellt, és előrejelzést adjunk a csomópontpopulációk általános sókoncentráció-függésére. Megjegyezzük, hogy nem Mg2+, hanem Na+ hatását vizsgáljuk, ami hasonló eredményeket ad16,45.

Amint azt Thirumalai és munkatársai hangsúlyozták26 , a négyirányú csomópontok esetében az időátlag és az együttes átlag (ergodicitás) közötti megfelelés meglehetősen nagy megfigyelési időskálákon megszakadhat a csomóponti konformációk közötti átalakulás sebessége miatt. Így az egymásra épülő konformerek relatív populációinak becsléséhez jelentős szimulációs együttesre van szükségünk. Ennek megfelelően minden sókoncentrációhoz 100 független szimulációt végzünk, mindegyik a nyitott konfigurációból kiindulva, mivel ez a konformáció gyorsan és véletlenszerűen alakul át izo-I vagy izo-II állapotba. Minden szimulációt 2 μs-ig futtatunk, így minden sókoncentrációra összesen 200 μs trajektóriaadatot kapunk, amely 100 független minta között oszlik meg. Ez egy kezdeti becslést ad az egyes konformációk relatív populációjára. E becslés alapján további 100 szimulációt futtatunk le a nyitott, az izo-I vagy az izo-II kezdeti konfigurációk arányával, amelyek megfelelnek az előzetes populációbecslésnek, hogy lássuk, érzékenyek-e az eredményeink a nyitott állapotból való kiindulásra. Azt találjuk, hogy a populációbecslések stabilak maradnak a statisztikai bizonytalanságunkon belül, így nem találunk jelentős hatást a nyitott állapotból való indulásnak köszönhetően. Eredményeinket befolyásolja, ha vagy az összes izo-I vagy az összes izo-II kezdeti konfigurációt használjuk, ezen állapotok viszonylag lassú egymás közötti átalakulása miatt.

A csomóponti populációk kiértékeléséhez olyan metrikát kell azonosítanunk, amely pontosan megkülönbözteti a három elsődleges csomóponti konformációt. Kísérleti úton a FRET-vizsgálatok általában a kiválasztott karok végei közötti távolságot (amely meghatározza a duplexek közötti szöget) használják a konformációs állapotok megkülönböztetésére. Kezdetben az inter-duplex szöget vizsgáltuk, de azt találtuk (amint azt később tárgyaljuk), hogy az IDA jelentősen ingadozik az egyes izoformákban, ami megnehezíti a konformációk egyértelmű megkülönböztetését. Ehelyett azt találtuk, hogy a csomópont szívéhez közeli bázisok közötti elválasztások megbízhatóbb indikátora a csomóponti konformációnak. Ezeket a távolságokat kísérletileg is hozzáférhetővé kell tenni egy pár fluoreszcens nukleotid bázisanalóggal, például 6-metil-izoxanthopterinnel (6-MI) vagy 2-aminopurinnal, amelyeket okosan a csomópont központjához közel helyezünk el. Az 1. ábra alsó paneljei a csomópont magjában lévő nyolc bázist mutatják az izo-I és izo-II konformerekben, valamint a nyitott formában. Az izo-I konformerben a T bázisok dTT távolsága (az X és H szálakon) és a C bázisok dCC távolsága (szintén az X és H szálakon) sokkal kisebb, mint az A és G bázisok dAG távolsága (a B és R szálakon); az izo-II konformerben a fordított halmozódás a relatív távolságok ellentétes viselkedéséhez vezet. A nyitott formában mindezek a távolságok hasonlóak, de nagyobbak, mint a halmozott izo-I és II konformerek távolságai.

Ezért az izo-I és II között egyszerűen ezen bázisok közötti távolságok alapján kellene tudnunk különbséget tenni. Ennek megerősítésére az 5. ábrán a bázisok közötti P(dTT ∪ dCC) és P(dAG) távolságok normalizált gyakorisági eloszlását ábrázoljuk, ami két külön csúcs jelenlétét mutatja minden ≥50 mM koncentráció esetén. A P(dAG) esetében (5a. ábra) a kis távolságnál lévő csúcs az izo-II konformer állapotokat jelzi, a nagyobb távolságnál lévő csúcs pedig vagy az izo-I vagy a nyitott konformációknak köszönhető. A P(dTT ∪ dCC) (5b. ábra) esetében a kis távolságoknál lévő csúcs az izo-I állapotokat jelzi, a nagyobb távolságoknál lévő csúcs pedig vagy izo-II vagy nyitott konformációkra utal. Az eloszlások minimumának hozzávetőleges helyét jelentő 12 Å szeparációnál vettük fel a határértéket, hogy megkülönböztessük a csomópontokat akár a halmazállapotú izo-I, akár az izo-II konformernek. Azokat a konfigurációkat, amelyeket sem izo-I-ként, sem II-ként nem azonosítunk, nyílt konformernek minősítjük. Összhangban azzal az elvárással, hogy alacsony sókoncentrációnál a nyílt konformáció dominál, egyik eloszlásnak sincs csúcsa kis szeparáció esetén, így alacsony sókoncentrációnál szinte minden konfigurációt a nyílt konformációval azonosítunk.

Kritérium az elágazási konformációk megkülönböztetéséhez.

A bázisok közötti szeparáció eloszlása a csomópont közepén (a) az AG bázisok esetében, ahol a kis szeparáció az izo-II konformert azonosítja, és (b) a TT vagy CC párok esetében, ahol a kis szeparáció az izo-I konformert azonosítja. A hosszabb távolsági csúcs alacsony sókoncentrációnál a nyitott konformációknak köszönhető; magasabb sókoncentrációnál elsősorban a komplementer halmozott formából ered. A függőleges szaggatott vonal jelzi azt a határkritériumot, amelyet az egyes konfigurációk konformációs állapotainak későbbi azonosítására használunk.

A konformerek megkülönböztetésére szolgáló ezen kritériumokat alkalmazva azonosítjuk az egyes konfigurációkat a három izomer valamelyikével, és a 6a. ábrán a kapcsolódási konformációk reprezentatív idősorát mutatjuk be öt szimulációra = 300 mM-on. A 7a. ábra e konformerek reprezentatív konfigurációit mutatja. Az idősoros adatok minőségileg azt mutatják, hogy a nyitott konformáció rendkívül rövid életű, és átmeneti állapotként működik a hosszú életű izo-I és izo-II konformerek között. Erre már korábban is következtettek egymolekulás kísérletekből8,15,16,50 , és ebben a tanulmányban kifejezetten megfigyeltük és megerősítettük az egyensúlyi konformerállapotok közötti átmenet mechanizmusát. Kvantitatív módon bizonyítjuk a nyitott konformáció köztes állapotként betöltött szerepét a három konformer közötti kilenc átmenet valószínűségének (beleértve az azonos konformációba való átmeneteket is) kiértékelésével. A 6b. ábrán látható, hogy az Iso I→II és II→I átmenet valószínűségei e grafikonok skáláján eltűnően kicsik (nulla, a számításunk bizonytalanságán belül). Következésképpen az egyetlen út az egymásra rakott konformerek között a nyitott konformeren keresztül vezet, ami megállapítja, hogy ez az átmeneti állapot. A 6c. ábra azt mutatja, hogyan változnak az átmenet valószínűségei a halmozott és a nyitott konformerek között a sókoncentráció függvényében, alacsony sókoncentráció esetén a nyitott állapotba való átmenet dominál. A 6a. ábrán látható öt idősor azt is mutatja, hogy az adatok időátlaga mintánként változik. Nyilvánvaló, hogy 2 μs nem elegendő a konformációs gyakoriságok ergodikus mintavételezéséhez, és szükségessé teszi a szimulációk együttesének felhasználását. Ez a megközelítés lehetséges a durva szemcséjű modell esetében, de meghaladja a jelenlegi számítási erőforrásokat egy minden atomra kiterjedő modell esetében. Ez a “megtört ergodicitás” hasonló ahhoz a kísérleti eredményhez, hogy a konformációs mintavételezés nagy időskálákon nem ergodikus26. Azonban óvatosan kell rámutatnunk, hogy a megtört ergodicitás itt teljes egészében a konformációs mintavételezés sztochasztikus természetének köszönhető, míg a hivatkozás 26 kísérleteiben az ionok egyes csomópontokhoz való kötődésének változásai is szerepet játszanak.

A konformációs mintavételezés és a konformációs átmenet valószínűségeinek molekuláról-molekulára történő változása.

(a) A csomóponti konformációk példa idősorai a 100 ensemble-tag közül ötre vonatkozóan = 300 mM-nál. A nyitott izoforma rövid életű, és az izo-I és izo-II közötti átmeneti állapotként viselkedik. (b) Az adott kiindulási állapotból a végső állapotba való átmenet valószínűségeinek mátrixa = 300 mM-nál. Az azonos állapotba való átmenet valószínűségeit (diagonális elemek) nem mutatjuk, mivel az aktuális állapotban maradás tendenciája dominálja a többi átmenet valószínűségének skáláját49. Megjegyzendő, hogy az iso I→II (és fordítva) átmenet valószínűségei közel nulla. (c) A négy kulcsfontosságú átmenet valószínűségének sókoncentráció-függése.

Junction konformációk, abundancia és szerkezet.

(a) A szimulációinkban megfigyelt reprezentatív konformációk; az egyszerűség kedvéért csak a DNS gerincét mutatjuk. (b) Az elsődleges izoformák relatív gyakorisága a sókoncentráció függvényében. Az izoformák azonosságát a szövegben leírtak szerint a csomópont belsejében lévő bázisszeparációk határozzák meg. (c) Inter-duplex szög (IDA) az egyes konformációkhoz. Megjegyezzük, hogy a nyitott síkbeli konformáció csak alacsony sószint mellett dominál. Magasabb sónál a mintavételezett nyílt konformációk kis hányada (átlagosan) tetraéderes konformációt vesz fel.

A csomóponti konformációra vonatkozó idősoros adatok alapján közvetlenül értékeljük a nyílt, izo-I vagy izo-II konformációjú konfigurációk hányadát a sókoncentráció függvényében (7b. ábra). Ahogyan vártuk, alacsony sókoncentrációknál (= 10 mM) lényegében csak a nyitott síkbeli, négyzetes geometriájú állapotot figyelhetjük meg. Minden magasabb sókoncentrációnál a halmozott konformerek előnyben vannak, átlagosan ≈58%-ban az izo-II és 36%-ban az izo-I (≥200 mM esetén). Szimulációink előre jelzik, hogy a meglehetősen alacsony sókoncentrációk kivételével a konformerek relatív frakciója nem függ jelentősen a sótól. Az egymásra rakott konformációk dominanciája magas sókoncentráció esetén az elektrosztatikus kölcsönhatások erős szűrése miatt várható, hasonlóan az olvadási hőmérséklet só koncentrációtól való függéséhez. Ez a szűrés azonban nem magyarázza a halmozott izo-II konformáció felé való eltolódást. Az izomerpopulációban mutatkozó különbségnek az elágazási mag közelében lévő bázissorozat hatásai miatt kell kialakulnia, ahogyan azt kísérletileg megfigyelték16,17 . Az a tény, hogy a modell reprodukálja a kísérletileg ismert eltérést az izo-II felé, azt jelzi, hogy a durva szemcséjű modell mennyire sikeres a szekvenciafüggő szerkezet megragadásában. A csomópontkonfigurációk kis hányadát, 6%-át találjuk nyitott állapotban magas sótartalomnál. Amint azt fentebb tárgyaltuk, ezek a konformációk rövid életűek és megkönnyítik az egymásra épülő konformációk közötti átalakulásokat. Ha és munkatársai15 kísérleteivel összehasonlítva viszonylag magas sókoncentráció esetén a 3SPN.2 modell mintegy 15%-kal alulbecsüli az izo-II irányába való eltolódást. A különbség részben az izoformák meghatározásához használt kísérleti és számítási kritériumok különbségéből adódhat; konkrétan, mi az elágazás belsejében lévő bázisszeparációkat vizsgáljuk, míg a FRET-kísérletek olyan címkéket használnak, amelyek érzékenyek az elágazás R és X karjainak végei (gyakorlatilag az IDA) szétválasztására. A nyitott csomópont-középponttal rendelkező H-szerű konformációk esetében (amelyeket kísérletileg endonukleázok jelenlétében figyeltek meg12 ) ezek az alternatív megközelítések szisztematikusan eltérnének az osztályozásban: (i) a csomóponti végek alapján a H-konformációkat az izo-I vagy II kategóriába sorolnánk; (ii) fordítva, a csomóponti magban lévő elválasztás alapján a H-konformációkat nyitottnak minősítenénk, így a mi kritériumaink mindig egy kisebb halmozott frakciót fognak eredményezni.

Mivel a kritériumaink lehetővé teszik számunkra az egyes csomóponti konfigurációk konformációinak kategorizálását, közvetlenül is ki tudjuk értékelni az egyes konformációk átlagos szerkezetét. A csomópont szerkezetét az inter-duplex szöggel (IDA) jellemezzük, amelyet az XR és RH karok által a csomópont csúcsával bezárt szöggel határozunk meg51. Ennek megfelelően az IDA-nak az izo-II esetében lényegesen kisebbnek kell lennie, mint az izo-I esetében. A 7c. ábra megerősíti ezt a várakozást: az izo-II IDA értéke magas sókoncentráció esetén megközelíti a 90°-ot, míg az izo-I IDA értéke 140° közelében van. Az izo-II 90°-os értéke nagy a kísérleti becslésekhez képest, amelyek az egyensúlyi FRET-mérések41,44,45 alapján 40-60°-os nagyságrendűek, és erre még visszatérünk. Azt is tisztáznunk kell, hogy a 90° az izo-II esetében nem jelent síkbeli konfigurációt, ami vizuálisan nyilvánvaló a 7a. ábrán látható reprezentatív konfigurációkban; a háromdimenziós szerkezetnek köszönhetően még egy egymásra épített szerkezet is felvehet egy 90°-hoz közeli szöget. A legalacsonyabb sókoncentrációknál nem tudjuk megbecsülni a szöget a halmozott konformációk esetében, mivel ezek lényegében nem kerülnek mintavételezésre. = 10 mM-nál azt találjuk, hogy a nyitott csomópont IDA értéke 95°, ami egy közel síkbeli csomópontnak felel meg, ami vizuálisan is látható a 7a. ábrán. Nagyobb sókoncentrációknál a nyitott konfigurációk kis hányada valamivel nagyobb, ≈105°-os szöget vesz fel. Ez a nagyobb szög összhangban van egy közel tetraéderes konfigurációval (7a. ábra), amelyet talán az alacsony sókoncentrációjú síkbeli nyitott konfigurációtól megkülönböztethetőnek kell tekinteni. Eredményeink tehát arra utalnak, hogy az egymásra rétegzett konformerek közötti átmeneti állapotok túlnyomórészt nyílt tetraéderes konformációk, nem pedig síkbeli. Ilyen tetraéderes típusú köztes állapotokat már korábban is megfigyeltek szimulációkban23. Valójában az egymolekulás adatok elemzéséből már következtettek az elágazási konformációk sokaságának lehetőségére26.

Elágazási szerkezetek összehasonlítása

Az utolsó összehasonlítási pontként megvizsgáljuk, hogy a 3SPN.2 modellből kiértékelt IDA hogyan viszonyul a kísérleti mérésekhez és az általunk az összes atomot tartalmazó AMBER-szimulációból becsült IDA-hoz. A FRET-mérések becslése szerint az izo-II IDA értéke 43 ± 8° T = 283 K és 200 mM sókoncentráció mellett45. Ennek megfelelően az AMBER és a 3SPN.2 modellt is szimuláltuk megfelelő körülmények között, egy 43°-os IDA-val rendelkező kezdeti izo-II konfigurációból kiindulva (lásd az 1b. ábrát). Mind a 3SPN.2, mind az AMBER modell esetében az átmenet nagyobb IDA-ra nyílik, és ≈50 ns után állandósul (8. ábra mellékelve). A 8. ábra főpaneljén az egyes modellek által az állandósult állapotban mintavételezett IDA-értékek láthatók. A 3SPN.2 modell az IDA szélesebb fluktuációját mutatja, mint az AMBER modell, bár az átlagos IDA hasonló a két modellben. Mennyiségi szempontból az AMBER esetében az átlagos IDA 85,3°, 12,3° szórással; a 3SPN.2 esetében, az átlagos IDA 95,7°, 24,1°-os szórással.

Az összatomos és a durva szemcsés modellek közötti elágazásszerkezeti összehasonlítás.

Az összatomos AMBER modell (fekete) és a 3SPN.2 IDA-ja durva szemcsés modell (piros) T= 283 K és = 200 mM esetén. A fő panel a mintavételezett IDA-értékek eloszlását mutatja; a folytonos vonalak a számított gyakoriságot, a szaggatott vonalak pedig az adatokkal megegyező átlaggal és szórással rendelkező normális eloszlást jelentik. A betét az egyes modellek eredeti idősorát mutatja, amelyből az eloszlásokat meghatároztuk. Megjegyezzük, hogy a 3SPN.2 modell esetében 2 μs adat áll rendelkezésünkre, amelyek közül nem mindegyik látható a betétben.

A szimulációk mindkét esetben lényegesen nagyobb IDA-t mutatnak, mint amit a FRET-mérések és a kristályográfiai vizsgálatok alapján vártunk45,52 . Ez arra utalhat, hogy egyik modell sem ad pontos becslést az IDA-ra, vagy hogy a közelítések, amelyeket az IDA becsléséhez a FRET-adatokból kell elvégezni, alulbecsülik az IDA-t. Az biztos, hogy az ömlesztett FRET-kísérletekben a külső festékek jelenléte, a hozzájuk kapcsolódó linkerek és azok relatív orientációja jelentős hibát vihet be a távolság meghatározásába. A jelenlegi IDA-meghatározások és a kristályográfiával mért értékek közötti különbségek talán a kristályrács bizonyos korlátaiból adódhatnak. Az összesatomos és a durva szemcsés modellek összehasonlításakor a standard eltérés közel megduplázódása egyértelműen azt mutatja, hogy a kapcsolódási karok rugalmasabbak a durva szemcsés modellben. Ez részben az explicit oldószer hiányának is betudható, mivel az all-atom ábrázolásban a szolváló víz szükségszerűen akadályozza a kapcsolódási karok rugalmasságát.