Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) is an genously heterogeneous disorder caused by germline mutations in one of several MMR genes (Jiricny, 1998a,b), bár a jelenlegi bizonyítékok arra utalnak, hogy a HNPCC-esetek többségét a hMSH2 és a hMLH1 csíravonal-mutációi okozzák (Peltomäki és Vasen, 1997). A HNPCC génhordozók az MMR-gént kódoló egyik allél mutációját öröklik, és a második példány a tumor kialakulásának korai eseményeként mutálódik vagy elvész. Ez a második esemény a sejtek DNS-eltérésjavítási (MMR) hiányosságát okozza, ami feltehetően a mutációk gyors felhalmozódásához vezet, ami a tumor kialakulásának mozgatórugója. Hogy a HNPCC egyénekben pontosan mi okozza a kolorektális rákra való hajlamot, még nem tisztázott. Kimutatták, hogy a humán MMR-komplexek pontos összeállítása elengedhetetlen a hatékony MMR-hez a genomi integritás fenntartása érdekében (Drummond és mtsai., 1997). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az MMR-gének mutációjának jellegétől és ezek expressziójától függően a DNS-javító komplexek összetétele és ezzel együtt aktivitása is változik a HNPCC egyének között. Emellett a hMLH1 és hMSH2 gének mutációi befolyásolhatják legalább a hMLH1 és hMSH2 részvételét más, a genom stabilitását szabályozó sejtes útvonalakban, például a DNS-rekombinációban és a sejtciklus ellenőrzőpontjának szabályozásában (Jiricny, 1998a,b). Ezért a tumor kialakulása és a betegség lefolyása eltérhet a HNPCC családok között (Jäger és mtsai., 1997). A fehérje-fehérje kölcsönhatások jelentőségét a javító komplexekben alátámasztják azok a megállapítások, hogy a hMSH2 a hMSH6 (hMutSα) vagy a hMSH3 (hMutSβ), a hMLH1 fehérje pedig a hPMS2 (hMutLα), a hPMS1 (hMutLβ) vagy a hMLH3 komplexben létezik (Drummond et al., 1995; Li és Modrich, 1995; Lipkin et al., 2000; Palombo et al., 1995; Papadopoulos et al., 1995; Räschle et al., 1999). A hMSH2 fehérjéről azt is kimutatták, hogy kölcsönhatásba lép a humán exonukleáz 1 (hEXO1) fehérjével (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Bár nem ismert, hogy a hEXO1 részt vesz-e az MMR-ben, az exonukleáz 1 aktivitásában hiányos élesztőtörzsek megnövekedett spontán mutációs rátát és a rekombináció kis mértékű növekedését mutatják, ha a heteroduplex intermedier bázis-bázis eltéréseket vagy kis hurkokat tartalmaz (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Ismert, hogy mind az exonukleáz 1 (EXO1), mind az MMR fehérjék részt vesznek a homológ rekombinációban (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al., 1997), és hogy az élesztő EXO1 szerepet játszik a kettősszálú törések javításában és a meiotikus kereszteződésben (Tsubouchi és Ogawa, 2000).
A HNPCC-vel kapcsolatos számos vizsgálat a hMLH1 és hMSH2 gének mutációinak azonosítására összpontosított. E gének mutációs elemzése azonban nem határozza meg a betegség hátterében álló molekuláris és biokémiai hibákat. A hMLH1 gén funkcióvesztése és a HNPCC közötti kapcsolat jobb megértése érdekében jellemeztük a hMutLα és a hMLH1-hEXO1 komplexek specifikus fehérje-fehérje kölcsönhatásait, a HNPCC betegeknél talált hMLH1 mutáns formáinak felhasználásával. Az ilyen fehérje-fehérje kölcsönhatások in vivo, illetve in vitro tanulmányozására az élesztő két-hibrid rendszert, valamint glutation S-transzferáz (GST)-fúziós kölcsönhatás (pull-down) próbát alkalmaztunk.
A hMLH1 fehérje túlnyomórészt a hPMS2-vel, más néven hMutLα heterodimer komplexben létezik (Li és Modrich, 1995). A hMutLα komplex kialakulása elengedhetetlen az MMR aktivitáshoz (Baker és mtsai., 1995, 1996; Edelmann és mtsai., 1996), és így a HNPCC-hMLH1 fehérjéknek a hPMS2-vel való komplexképzésre való képtelensége a HNPCC egyénekben nem hatékony MMR aktivitást eredményezhet. A HNPCC hátterében álló lehetséges ok feltárása érdekében megvizsgáltuk, hogy a dán HNPCC-betegekben azonosított három hMLH1 mutáns (1. ábra) képes-e kölcsönhatásba lépni a hPMS2-vel. A mutációk közé tartozott a hMLH1 117-es kodonjánál (T117M) egy treoninból metioninná történő miszense mutáció, valamint két új HNPCC-mutáció, egy nonszensz mutáció (CAG-ból TAG-be) a 426-os kodonnál (Q426X) és egy frame-shift mutáció (A beillesztése az 1813-as nukleotidnál), amely a 609-es kodonnál (1813insA) korai leállást eredményez (1. ábra). A rekombináns GST-címkézett HNPCC fehérjékkel és az in vitro átírt és transzlált (IVTT) hPMS2-vel végzett pull-down vizsgálat a várakozásoknak megfelelően kimutatta a hMLH1 és a hPMS2 közötti komplex kialakulását (2a. ábra, 5. és 10. sáv). Továbbá kimutattuk a HNPCC-hMLH1 (T117M) és a hPMS2 közötti komplex képződését (2a. ábra, 11. sáv). Bár azt találtuk, hogy a HNPCC-hMLH1 (T117M) fehérje eukarióta NIH3T3 sejtekben expresszálódik (adat nem látható), nem tudtuk reprodukálni a hPMS2-vel való kölcsönhatást az élesztő két-hibrid tesztben (3a. ábra). Ennek az eltérésnek az egyik magyarázata az lehet, hogy a hPMS2 és a HNPCC-hMLH1 (T117M) mutáns fehérje közötti komplexképződés háromszorosan csökkent a hPMS2 és a hMLH1 fehérjékhez képest, ahogyan azt foszfoimagerrel kvantitáltuk (adat nem látható) (2a. ábra, 10. és 11. sáv). Ezzel szemben a hMLH1 fehérje csonkok, a HNPCC-hMLH1 (Q426X) és a HNPCC-hMLH1 (1813insA) és a hPMS2 közötti komplexképződést egyik vizsgálatban sem észleltük (2a. ábra, 12. és 13. sáv és 3a. ábra). A HNPCC-hMLH1 (1813insA) és hPMS2-t tartalmazó pull-down reakcióban egy halvány sáv volt látható (2a. ábra, 13. sáv), de az intenzitása hasonló volt a csak hPMS2 fehérjét tartalmazó reakcióban kapott sávhoz (2a. ábra, 3. sáv), ezért nem valószínű, hogy ez a HNPCC-hMLH1 (1813insA) és hPMS2 közötti valódi komplexet jelent.
(a) A MutL család szekvenciaillesztése. hMLH1: humán MutL homológ hMLH1, yMLH1: Saccharomyces cerevisiae MutL homológ MLH1, MutL: Escherichia coli MutL. A konzervált maradékok félkövér betűvel vannak jelölve. A szekvenciaillesztést a ClustalW Multiple Sequence Alignment segítségével végeztük. (b) A hPMS2, hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminális, hEXO1a/HEX1-C-terminális és hEXO1b-C-terminális (Y5) fehérjék szerkezete. Három HNPCC-vel diagnosztizált dán családot azonosítottak a dán HNPCC-regiszteren keresztül. Az amszterdami kritériumoknak megfelelő családokban két új HNPCC-mutációt azonosítottak, egy nonszensz mutációt (CAG-ból TAG-be) a 426-os kodonnál (Q426X) és egy frame-shift mutációt (A beillesztése az 1813-as nukleotidnál), amely a hMLH1 609-es kodonnál korai leállást eredményez (1813insA). A harmadik mutációt, a hMLH1 117-es kodonjánál (T117M) bekövetkező, treoninból metioninná váló missense mutációt már korábban leírták (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm). A hMLH1 kódoló régióját a pcDNA3 EcoRI-helyére klónoztuk, és primer-közvetített mutagenezishez használtuk templátként a hMLH1 három különböző HNPCC-mutációjának – T117M, Q426X és 1813insA – létrehozásához. Az összes szintetikus mutáció és a PCR-amplifikált fragmentumok DNS-szekvenciáját DNS-szekvenálással igazoltuk. A vizsgálatban használt további konstrukciók a következők: hPMS2 (teljes hosszúságú cDNS), HEX1-N (a HEX1/hEXO1a 1355 bp hosszúságú N-terminális régiója), HEX1-C (a HEX1/hEXO1a 1182 bp hosszúságú C-terminális régiója) és hEXO1b-C (Y5) (a hEXO1b 1952 bp hosszúságú C-terminális régiója). Az összes hEXO1-konstrukciót részletesen leírja Rasmussen és mtsai., 2000)
GST fúziós fehérje teszt a hMLH1 fehérjék és a hEXO1b vagy hPMS2 közötti kölcsönhatás vizsgálatára. (a) 1. sáv, jelölt IVTT hPMS2 fehérje; 2. sáv, +GST gyöngyök; 3. sáv, +BL21 lizátum; 4. sáv, +tisztított GST fehérje; 5. sáv, +tisztított GST-hMLH1 fehérje; 6. sáv, tisztított GST-hMLH1 fehérje és jelölt IVTT vektor; 7. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) fehérje és jelölt IVTT vektor; 8. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) fehérje és jelölt IVTT vektor; 9. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) fehérje és jelölt IVTT vektor; 10. sáv, tisztított GST-hMLH1 fehérje és jelölt IVTT hPMS2 fehérje; 11. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) fehérje és jelölt IVTT hPMS2 fehérje; 12. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) fehérje és jelölt IVTT hPMS2 fehérje; és 13. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) fehérje és jelölt IVTT hPMS2 fehérje. (b) 1. sáv, IVTT hEXO1b fehérje; 2. sáv, +GST gyöngyök; 3. sáv, +BL21 lizátum; 4. sáv, +tisztított GST fehérje; 5. sáv, +tisztított GST-hMLH1 fehérje; 6. sáv, tisztított GST-hMLH1 fehérje és jelölt IVTT vektor; 7. sáv, tisztított GST-hMSH2 fehérje és jelölt IVTT hEXO1b fehérje; 8. sáv, tisztított GST-hMLH1 fehérje és jelölt IVTT hEXO1b fehérje; 9. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) fehérje és jelölt IVTT hEXO1b fehérje; sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) fehérje és jelölt IVTT hEXO1b fehérje; és 11. sáv, tisztított GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) fehérje és jelölt IVTT hEXO1b fehérje. Minden in vitro transzkripciós transzlációs reakciót a TNT kapcsolt retikulocita lizátum rendszerrel (Promega) végeztünk. Röviden, a lizátumokat 1 μg DNS-sel, ciszteinhiányos aminosavkeverékkel, 35S-ciszteinnel és T9 RNS-polimerázzal inkubáltuk 90 percig 30°C-on, a gyártó utasításai szerint. A pGEX vektort (Pharmacia-Amersham) használtuk a GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA) és GST-hMSH2 konstruálásához. Valamennyi pGEX-konstrukció N-terminális GST-fúziós fehérje. A teljes kódoló régió DNS-szekvenálása minden konstrukciót megerősített. A fúziós fehérjéket a Guerrette és munkatársai (1998) által leírt módon tisztítottuk, kivéve, hogy nem indukált E. coli kultúrákat használtunk. A pull-down vizsgálatokat a Guerrette és munkatársai által leírtak szerint végeztük. (1998), kivéve, hogy a fehérjéket 2 órán át inkubáltuk 30°C-on, mielőtt a reakcióelegyeket a gélekre töltöttük
Interakció a hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) és HNPCC-hMLH1 (1813insA) és hPMS2 vagy hEXO1 között az élesztő kéthibrid rendszerben. (a) A Miller-egységben megadott β-galaktozidáz aktivitást a Rasmussen és munkatársai (2000) által leírtak szerint határoztuk meg. (b) és (c) A különböző plazmidokat tartalmazó törzseket SD-LEU-TRP+X-gal lemezeken csíkoztuk. Az egyes vizsgált törzsekben található plazmidok minden oszlop tetején és minden sor bal oldalán fel vannak tüntetve. AD: aktivációs domén, BD: kötő domén. A pAS2-1, pBRIDGE és pACT2 (CLONTECH) élesztő kéthibrid vektorokat használtuk a GAL4 fúziós fehérjék konstruálásához. Az élesztő-kéthibrid próbákat a korábban leírtak szerint végeztük (Rasmussen és mtsai., 2000). Röviden, a hMLH1 vagy a HNPCC-hMLH1 kódoló régióit PCR-rel amplifikáltuk és klónoztuk a pBRIDGE EcoRI és BamHI helyére vagy a pACT2 NcoI és BamHI helyére. A hPMS2-t PCR-rel amplifikáltuk a pREP4-hPMS2 (Risinger et al., 1998) mint templát felhasználásával és klónoztuk a pAS2-1 NdeI és BamHI helyére és a pACT2 SmaI és EcoRI helyére. Az összes többi plazmidot Rasmussen és munkatársai (2000) írják le. Egyik plazmid sem mutatott kölcsönhatást a kéthibrid vektorokkal inzert nélkül
Együtthatóan korábban deléciós mutagenezissel kimutatták, hogy a hMLH1 és a hPMS2 kölcsönhatását a hMLH1 C-terminális része (506-756 aminosavak) és a hPMS2 C-terminális része (675-850 aminosavak) közvetíti (1b ábra) (Guerrette et al, 1999). A HNPCC-hMLH1 (T117M) mutációt kilenc nem rokon HNPCC családban jelentették a világ különböző részeiről (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm és az adatok nem láthatóak), ami arra utal, ahogyan azt már élesztőben is kimutatták (Shcherbakova és Kunkel, 1999; Shimodaira és mtsai., 1998), hogy a mutáció nem kapcsolt polimorfizmus. A HNPCC-hMLH1 (T117M) mutáció egy konzervált szekvenciára térképeződik (1. ábra), amely feltehetően közvetlenül részt vesz az ATP megkötésében és/vagy hidrolízisében (Ban és mtsai., 1999). Így a HNPCC-hMLH1 (T117M) miszense mutáció inaktiválhatja az MMR-aktivitást azáltal, hogy megváltoztatja e mutáns fehérje ATP-kötő és/vagy hidrolizáló képességét, és ezzel együtt a más MMR-fehérjékkel való komplexképzést. E hipotézissel összhangban azt mutatjuk, hogy a HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) és HNPCC-hMLH1 (1813insA) mutációkat hordozó HNPCC egyéneknél károsodik a hMutLα heterodimer-képződés, ami az MMR-aktivitás hibájához vezet, ha a második hMLH1 allél elveszik vagy inaktiválódik.
A szövetspecifikus MMR-hez kapcsolódó faktorok azonosítására tett kísérlet során mi és mások nemrégiben azonosítottunk egy humán exonukleázt, amely kölcsönhatásba lép a hMSH2-vel (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Kimutattuk, hogy a hMSH2 kölcsönhatásba lép a hEXO1 mindkét formájával, a hEXO1b-vel és a hEXO1a/HEX1-gyel, és hogy ezt a kölcsönhatást a C-terminális domének közvetítik. Ezzel szemben a hMSH6 és a hEXO1 között nem észleltünk kölcsönhatást a kéthibrid rendszerben (Rasmussen és mtsai., 2000). Nem ismert, hogy a hEXO1 szerepet játszik-e az MMR-ben, vagy a hMSH2-vel való kölcsönhatása fontos a rekombináció szempontjából. Megmutattuk, hogy a hMLH1 fehérje a hMSH2-hez hasonlóan kölcsönhatásba lép a hEXO1 mindkét formájával (hEXO1b és hEXO1a/HEX1), és hogy ezt a kölcsönhatást az exonukleázok C-terminális doménjei közvetítik (2b. ábra, 5. és 8. sáv és 3. ábra). A hPMS2 és a hEXO1 között nem észleltünk kölcsönhatást (3a,c ábra). Előzetes adataink arra utalnak, hogy mind a hMLH1, mind a hPMS2 fehérjék jelenléte nem akadályozta meg a hEXO1 kötődését a hMLH1-hez (adat nem látható). Ezért nem gondoljuk, hogy a hMutLα-képződés feltétlenül blokkolja a hEXO1 hMLH1-hez való kötődését. A hMLH1-hEXO1 kölcsönhatás további jellemzésére mind a hMLH1, mind a hEXO1 fluoreszcens fehérje fúziókat konstruáltunk és NIH3T3 sejtekbe juttattuk be (4. ábra). Eredményeink azt mutatják, hogy a CFP-hMLH1 elsősorban a sejtmagban van jelen, de a fehérje egy részét a citoplazmában is kimutattuk (4. ábra, 1. panel). Ezzel szemben a YFP-hEXO1-et csak a sejtmagban detektáljuk (4. ábra, 2. panel). YFP-hEXO1-gyel történő kotranszfekció esetén azonban a CFP-hMLH1 teljes egészében nukleárisan helyezkedett el (4. ábra, 3. és 4. panel).
A CFP-hMLH1 és YFP-hEXO1b fúziós fehérjék nukleáris lokalizációja. A kezelés napján egér NIH3T3 sejteket tranziens módon transzfektáltunk 3,5 μg CFP-hMLH1 (1. panel) vagy YFP-hEXO1b (2. panel) vagy mindkét konstrukcióval (3. és 4. panel). A sejteket egy éjszakán át inkubáltuk, majd másnap konfokális lézerpásztázó mikroszkópiával vizsgáltuk a fúziós fehérjék szubcelluláris lokalizációját. A transzfektált sejtek továbbá a megfelelő Nomarski-képen láthatóak. A hMLH1 cDNS-t a pECFP-C2 vektor (CLONTECH) EcoRI és BamHI helyére, a hEXO1b cDNS-t pedig a pEYFP-C1 vektor (CLONTECH) BamHI és SalI helyére klónoztuk. Mindkét fluoreszcens fehérje-konstrukció N-terminális fúzió
Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy legalább két MMR fehérje, nevezetesen a hMSH2 és a hMLH1 kölcsönhatásba lép a humán exonukleáz 1-gyel, míg két másik MMR fehérje, a hPMS2 és a hMSH6 nem vesz részt közvetlenül a hEXO1 kölcsönhatásában, amikor in vivo two-hybrid assay-ben értékelték.
Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a hMLH1 és a hEXO1 kölcsönhatásai befolyásolva lehetnek-e HNPCC betegeknél, a fent leírt három hMLH1 mutáns fehérje hEXO1-hez való társulását jellemeztük. Pozitív kölcsönhatás csak a HNPCC-hMLH1 (T117M) és a teljes hosszúságú hEXO1b fehérje között mutatkozott az in vitro pull-down assay segítségével (2b. ábra, 9. sáv). Az in vivo two-hybrid assay segítségével azonban a HNPCC-hMLH1 fehérjék és a vizsgált exonukleáz 1 konstrukciók között nem volt kimutatható fehérje-fehérje kölcsönhatás (3. ábra). A GAL4 aktivációs doménhez fuzionált teljes hosszúságú hEXO1 és a hMLH1 fehérjék közötti kölcsönhatást nem tudtuk vizsgálni, mivel ezek a konstrukciók nem funkcionálisak az élesztő two-hybrid assayben (Rasmussen et al., 2000). Hasonlóképpen azt találtuk, hogy a GAL4 aktivációs doménhez fuzionált hMLH1 és hMLH1 származékok olyan fúziós fehérjéket eredményeztek, amelyek nem funkcionálisak a two-hybrid assayben (3. ábra és az adatok nem láthatóak).
Végeredményeink azt mutatják, hogy három új HNPCC-hMLH1 mutáció, amelyekről ismert, hogy kozegregálódnak a HNPCC betegek rákérzékenységével, a hMutLα heterodimer összeállásának hibáját eredményezik, ami csökkent MMR aktivitáshoz vezethet. Hasonlóképpen, a HNPCC-hMLH1 mutáns fehérjék nem képesek kölcsönhatásba lépni az újonnan azonosított hEXO1 fehérjével, amely fehérje most úgy tűnik, hogy kölcsönhatásba lép a hMLH1-gyel és a hMSH2-vel, de nem a hMSH6-tal és a hPMS2-vel. Jelenleg e dokumentált kölcsönhatások pontos biológiai útvonalai és általános hozzájárulása továbbra is tisztázatlanok, főként azért, mert a hMLH1-ről kiderült, hogy mind az MMR-ben, mind a rekombinációban szerepet játszik. A HNPCC molekuláris hibáinak feltárása a patogén MMR-fehérjéknek a fehérjekomplexekben lévő kölcsönhatások mennyiségi meghatározására tervezett funkcionális próbákban történő vizsgálatával a mutációs szűréssel, immunhisztokémiával és mikroszatellita-analízissel együtt segíthet a HNPCC-hordozók diagnosztizálására és kezelésére irányuló stratégiák kidolgozásában.