Eredmények

Klinikai minták elemzése.

2006 szeptemberében az A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) influenzavírust több 5-6 hetes, multifokális bronchopneumóniás sertésből izolálták egy több forrásból származó kereskedelmi sertéstelepen. A tüdőelváltozások közé tartozott a közepesen súlyos, szubakut vagy krónikus, gennyes bronchopneumonia és intersticiális tüdőgyulladás bronchiolitissel és peribronchitisszel. A tüdőszövet negatív volt a sertések reproduktív és légzőszervi szindróma vírusára (PRRSV), a sertések 2. típusú cirkovírusára (PCV2) és a Mycoplasma hyopneumoniae-re, de pozitív volt a Streptococcus suis-ra. A jellegzetes influenzaszerű elváltozások és a tüdőgyulladás klinikai tünetei miatt a tüdőszövet homogenátumát Madin-Darby kutyavese (MDCK) sejtekre oltották. A citopátiás hatásokat az inokulációt követő 3. napon (p.i.) észlelték. Az influenzavírus nukleoprotein (NP) génjét RT-PCR segítségével mutatták ki a fertőzött sejtekben. A vírus nem reagált a referencia sertés antiszérával (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) hemagglutinációgátlási (HI) próbákban, és a multiplex RT-PCR nem mutatott ki H1N1 vagy H3N2 gént (14). A vírust 2007 februárjában benyújtották a Nemzeti Állatjárványügyi Központnak (NADC) altípusmeghatározás és szekvenálás céljából.

A szeptemberi izolátum altípusmeghatározása és szekvenálása után (lásd alább) az esetek nyilvántartásában végzett keresés során kiderült, hogy 2006 áprilisában egy másik “nem tipizálható” influenzaizolátumot nyújtottak be. Az A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) izolátumot egy 12 hetes, légzőszervi megbetegedésben szenvedő sertésből izolálták egy másik sertéstenyésztő-finomító gazdaságban. A tüdőelváltozások szövettanilag a sertésinfluenzára jellemzőek voltak (az alveolusok és a hörgők súlyos, szubakut gyulladása, hörgőhámsejt-nekrózissal és metapláziával). A tüdő negatív volt PRRSV-re, PCV2-re és M. hyopneumonia-ra, de pozitív volt az influenza A vírusra RT-PCR (az NP génre specifikus) és S. suis-ra. A vírust 2007 márciusában benyújtották az NADC-hez altípus-meghatározás és szekvenálás céljából.

Alttípus-meghatározás és filogenetikai elemzés.

A két influenzavírus azonosítása és jellemzése érdekében nukleinsav-szekvenálást, valamint molekuláris és filogenetikai elemzést végeztek. Mindkét vírust közvetlenül szekvenáltuk alacsony átjárhatóságú izolátumokból MDCK sejtek felhasználásával, majd a szekvenciákat plakk-tisztítás és újraszekvenálás után megerősítettük. A nukleotidszekvencia és az Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov) BLAST keresése alapján H2N3 vírusként azonosították őket. A Sw/4296424 HA génszegmense hasonlított leginkább az Észak-Amerikában vadkacsákból izolált H2-vírusokéhoz. NA szegmense szoros rokonságban állt egy kékszárnyú récéből izolált H4N3 madárinfluenza-víruséval (AIV) (98,3%-os azonosság). A polimeráz savas (PA) gén kivételével belső génjei a jelenleg az Egyesült Államokban előforduló, háromszorosan fontos sertésinfluenza-vírusoktól származtak. Ezek a vírusok emberi (PB1), madár (PB2, PA) és sertésinfluenza-vírus eredetű belső géneket hordoznak (SI 4. táblázat). PA szegmense 99,2%-ban megegyezett a tőkés récéből izolált H6N5 AIV-éval (SI 4. táblázat). A Sw/2124514 és Sw/4296424 vírusok 99,3-99,9%-os teljes nukleotidszekvencia-azonosságot mutattak (SI 5. táblázat). Mindkét izolátumot ismételten plakk-klónozták, újratesztelték és szekvenálással megerősítették, hogy a H2N3 altípushoz tartoznak. A H2N3 altípust szerológiailag megerősítették hemagglutináció-gátlási és neuraminidáz-gátlási vizsgálatokkal. A HA- és NA-géneken alapuló filogenetikai elemzés kimutatta, hogy ez a két vírus az amerikai madárvonalhoz tartozik, amely különbözik az eurázsiai madártörzsektől és az 1957-es influenzajárvány után emberből izolált H2N2-vírusoktól (1. ábra).

A kiválasztott influenzavírus H2 (a) és N3 (b) gének filogenetikai fái az ORF-ek nukleotidszekvenciái alapján. A vízszintes távolság a genetikai távolsággal arányos. A fák gyökere az A/duck/Singapore/97 H5N3 (a) és az A/tern/Astrakan/775/83 H3N3 (b). A csomópontok alatti számok 200 ismétlésből származó bootstrap értékeket jelentenek.

A HA és NA felszíni fehérjék molekuláris elemzése.

Az influenza A vírusok két felszíni fehérjét tartalmaznak: a HA a receptor-kötő és membránfúziós glikoprotein, a NA pedig egy receptor-romboló enzim. A vírus HA az influenzavírusok gazdafajspecificitásának kritikus tényezője (15). A HA-n belüli olyan maradékok jellemzésére, amelyek összefüggésbe hozhatók egy madárvírusnak az emlős gazdához való alkalmazkodásával, összehasonlítottuk a sertés HA-k aminosav-szekvenciáit a feltételezett referencia madárvírusokéval. A két sertés H2N3 izolátum HA-molekuláinak molekuláris összehasonlítása kimutatta, hogy azok hat közös aminosav-helyettesítésben (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I és L506V) különböznek a vadkacsából izolált feltételezett referencia H2N3 vírustól (SI 6. táblázat). A Q226L szubsztitúció mindkét sertés H2N3 izolátumban megtalálható volt, míg a 228. pozíció G-t tartalmazott, ami megegyezik a madárkonszenzus szekvenciával (1. táblázat) (16). Ezzel szemben a H2 altípusú humán HA-molekulák 226L és 228S-t tartalmaznak, míg a korai humán H2 izolátumok 226L-t és 228G-t (1. táblázat), hasonlóan a sertés izolátumokhoz. A 36N, 274I, 316I és 419I pozíciók egyediek a két sertés H2N3 izolátumban (SI 6. táblázat), míg az 1. a. ábrán bemutatott humán és madár izolátumokban a 36D, 274T, 316V és 419L pozíciók a megfelelőek. Az 1. a. ábrán bemutatott influenzaizolátumok esetében az 506V pozíció konzerválódik az ember, a két sertés H2N3 izolátum és a madár izolátumok között, kivéve az A/mallard/Alberta/2004 (H2N3) esetében, amint azt az SI 6. táblázat mutatja. Két közös aminosavváltozást találtunk a két sertésizolátum NA-aminosav-szekvenciájában, amikor a kékszárnyú récéből izolált H4N3-referenciavírussal hasonlítottuk össze: H47Y és H253Y (SI 7. táblázat). A 47Y pozíció mindkét sertés H2N3 izolátumban megegyezik az 1. b. ábrán bemutatott eurázsiai madárizolátumok megfelelő aminosavával; ezzel szemben az észak-amerikai madárizolátumok 47H pozíciója. A 253Y pozíció egyedi a sertés H2N3 izolátumokban, a 253H pozíció pedig konzervált az 1. b. ábrán ábrázolt eurázsiai és észak-amerikai madárizolátumokban. Érdekes módon a Sw/4296424 (H2N3), amelyet 5 hónappal később izoláltak, mint a Sw/2124514 (H2N3), a HA molekulában két további szubsztitúciót (P162S és L321V), a NA molekulában pedig három további szubsztitúciót (V30I, I49T és A135T) mutatott ki a Sw/2124514 HA és NA molekulájához képest (SI 6. és 7. táblázat). A 30I pozíció (Sw/4296424) a NA molekulában hasonló az eurázsiai izolátumokhoz, míg a 30V pozíció (Sw/2124514) konzerválódott az észak-amerikai madárizolátumokban.

H2N3 sertés influenzavírusok patogenitása és átvihetősége sertésben.

A H2N3 vírus sertés adaptációjának mértékét vizsgálva, 20 4 hetes sertés beoltásával vizsgáltuk a vírus patogenitását ebben a gazdaszervezetben az Sw/4296424 vírus 2 × 106 50%-os szövettenyésztési fertőző dózisával (TCID50). A két izolátum közötti nagyfokú azonosság miatt csak egy H2N3 vírust választottunk. Tizenkét kontrollsertést nem fertőző sejttenyésztési felülúszóval oltottak be. Az átvihetőséget úgy vizsgáltuk, hogy a beoltott sertésekkel 10 korban megegyező korú kontaktsertést tartottunk együtt a 3. napon kezdődően. A vizsgálathoz használt összes sertés szeronegatív volt a 0. napon a H1N1, H1N2, H2N3 és H3N2 sertésinfluenza-vírus elleni antitestek tekintetében a HI-vizsgálat alapján. Öt beoltott sertést és három kontrollsertést elaltattak boncolás céljából a 3., 5. és 7. napon. A 10 kontakt sertést és 5 vírusfertőzött sertést szerológiai vizsgálatnak vetették alá HI-vizsgálattal H2N3 vírussal a kontaktust követő 24. napon, illetve a 27. napon. Akut légzőszervi tüneteket nem észleltek. A boncolás súlyos makroszkópos tüdőelváltozásokat (szilvaszínű, konszolidált területek) mutatott ki a beoltott sertésekben, de a kontrollsertésekben nem (2. táblázat). A tüdőszerkezet károsodásának mértékét kifejező szövettani pontszám (0-3) >2 volt a beoltott sertésekben (2. táblázat). Az i.e. 3., 5. vagy 7. napon elaltatott beoltott sertések tüdeje enyhe vagy közepesen súlyos intersticiális tüdőgyulladást és akut vagy szubakut nekrotizáló bronchiolitiszt mutatott, a bronchiolák és erek enyhe limfocita-mancsosodásával (2. ábra). A vírust a bronchoalveoláris mosófolyadékból (BALF) titrálták és orrtamponmintából izolálták. A vírustiterek a tüdőben 104,3 és 106,5 TCID50/ml között mozogtak a 3. és 5. napon (SI 8. táblázat), és negatívak voltak a 7. napon. A beoltott H2N3 csoportban a sertések 25%-ában (20-ból 5) a 3. napon, 67%-ában (15-ből 10) az 5. napon és 20%-ában (10-ből 2) a 7. napon orrtamponmintából izolálták a vírust; a kontakt csoportban a minták 10%-a (10-ből 1) volt pozitív a kontaktust követő 5. és 7. napon. Ezzel szemben a kontakt sertések 100%-a (10-ből 10) szeropozitív volt a beoltott sertésekkel való kontaktus után 24 nappal (SI 9. táblázat). Néhány kontrollsertésnél alkalmanként enyhe intersticiális tüdőgyulladás kis fókuszát észlelték (2. táblázat), de ezek a sertésinfluenza-vírusfertőzésre negatívak voltak. Minden sertés negatív volt a PRRSV-re és a M. hyopneumoniae-re a PCR segítségével. Eredményeink azt jelzik, hogy a H2N3 vírus patogén a sertésekben és átvihető a sertések között.

H2N3 sertésinfluenza-vírusok patogenitása egerekben.

A H2N3 Sw/4296424 vírus egerekben való szaporodási képességének vizsgálatához 6-7 hetes BALB/c egereket intranazálisan beoltottunk 102-106 TCID50-vel. A 104 TCID50 vagy annál nagyobb mennyiségben beoltott egerek a betegség jeleit mutatták (pl. nehézkes légzés, érdes szőrzet, súlyvesztés és letargia) (SI 10. táblázat). A 106 TCID50-et kapott egerek 75 százaléka elpusztult, de alacsonyabb dózisoknál nem volt halálozás. A vírus RNS-t valós idejű RT-PCR-rel (17) mutatták ki az egerek tüdejében 106 vagy 105 TCID50 beoltást követően (SI 10. táblázat). Histopatológiailag a H2N3 vírus többszörös vagy összenövő interstitialis tüdőgyulladást és proliferatív alveolitiszt idézett elő, amelyet markáns pneumocita hipertrófia és az alveoláris falak makrofágok, limfociták és neutrofilek vegyes populációjának infiltrációja jellemzett (SI 3. ábra). Néhány alveoláris lumen fibrinrögöket és könnyű, kevert leukocitás exsudátumot tartalmazott. Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a H2N3 kórokozó egerekben, előzetes adaptáció nélkül.

A H2N3 sertésinfluenza-vírus átvihetősége görényekben.

A pandémiához egy új influenza A vírusnak meg kell fertőznie az embert, és hatékonyan kell terjednie az emberek között. A reasszortáns H2N3 vírus emlősökben való terjedési potenciáljának vizsgálatához a vadászgörény-kontaktmodellt használtuk (18). Három 18 hetes, külön ketrecben tartott görényt 102,5 TCID50 Sw/2124514 H2N3 vírussal oltottunk be. 24 óra elteltével mindkét ketrecbe egy-egy kontaktállatot helyeztünk. Az 1., 4. és 7. napon orrmosást végeztek, és a vírust embrionált tojókban titrálták. A vírust minden beoltott és kontakt görényben kimutatták, de egyikük sem mutatott nyilvánvaló klinikai tüneteket (3. táblázat). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a H2N3 influenzavírus hatékonyan fertőzte meg a vadászgörényeket, és a kontaktus útján terjedt.