Plazmidkonstrukció

Az ebben a tanulmányban vizsgált minden egyes kiméra anti-HA scFv-t úgy állítottunk elő, hogy a 12CA5 anti-HA antitest hat CDR-hurkát oltottunk be minden egyes kiválasztott scFv-állványra. A \(\chi _{15{\mathrm{{{F}}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) plazmidot két lépésben konstruáltuk: (1) egy CDR-hurokkal oltott scFv gblokkot és egy EcoRI restrikciós helyekkel linearizált H4K20me1 mentbody 15F11 vektort38 ligáltunk Gibson assembly segítségével (House készítette master mix); (2) az scFv-t és az EGFP-t összekötő linkert, valamint az EGFP-t egy flexibilis (G4S) × 5 linkert kódoló gblokkal és a mEGFP-vel helyettesítettük Gibson assembly segítségével NotI restrikciós helyeken keresztül. A másik négy kiméra scFv plazmid esetében minden CDR-hurokkal oltott scFv gblokkot az EcoRI restrikciós helyekkel linearizált \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) vektorba ligáltunk Gibson assembly segítségével.

A célplazmid 1 × HA-mCh-H2B úgy készült, hogy az Addgene plazmid sfGFP sfGFP-H2B (Plazmid # 56367) sfGFP-jét egy 1 × HA epitóppal jelölt mCherry gblokkal helyettesítettük, amelyben az 1 × HA epitóp és az mCherry közé egy NotI restrikciós helyet illesztettünk be a következő klónozáshoz. A 4 × HA-mCh-H2B konstrukciót az 1 × HA-mCh-H2B konstrukció 1 × HA tag-jének AgeI és NotI restrikciós helyeken keresztül 4 × HA-epitóp gblokkal való helyettesítésével állítottuk elő. A 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) úgy készült, hogy az 1 × HA-mCh-H2B konstrukció 1 × HA tag-jét az Addgene plazmid smHA-KDM5B-MS2 (Plazmid # 81085) plazmidról (NZ-098 és 099 primerek használatával) amplifikált smHA-val helyettesítettük (az összes primer szekvencia az 1. kiegészítő táblázatban látható). Az smHA-H2B úgy készült, hogy az 1 × HA-mCh-H2B konstrukció 1 × HA-mCh-H2B 1 × HA-mCh-jét az smHA-KDM5B-MS2 plazmidból amplifikált smHA-val helyettesítettük az NZ-098 és 100 primerek használatával.

A másik célplazmid 4 × HA-mCh-β-aktin úgy készült, hogy a 4 × HA-mCh-H2B H2B-jét β-aktin amplikonnal helyettesítettük a BglII és BamHI restrikciós helyeken keresztül. A β-aktin amplikont az Addgene plazmid smFlag-ActinB-MS2 (Plasmid # 81083) plazmidból amplifikáltuk az NZ-073 és NZ-074 primerek segítségével.

A 4 × HA-mRuby-Kv2.1 plazmidot úgy hoztuk létre, hogy először a 4 × HA tag-et amplifikáltuk a 4 × HA-mCh-H2B-ből az NZ-105 és 106 primerek segítségével. Ezután a 4 × HA amplikont egy publikált pCMV-mRuby2-Kv2.161 plazmidba (Dr. Michael Tamkun ajándéka) vittük be, amelyet AgeI restrikciós emésztéssel linearizáltunk Gibson assembly segítségével. Az smHA-Kv2.1 plazmidot a patkány Kv2.1 kódoló szekvencia pBK-Kv2.140-ből történő PCR-amplifikációjával, majd az ezt követő ligálással az smHA-KDM5B-MS2 plazmid AsiSI és PmeI restrikciós helyeibe Kv2.1-1 és 2.

A H2B-mCh-1 × HA két lépésben készült: (1) az 1 × HA-mCh-H2B 1 × HA-tagját H2B-vel helyettesítettük AgeI és NotI helyeken keresztül, amelyben a H2B-t az 1 × HA-mCh-H2B-ból amplifikáltuk az NZ-092 és 093 primerek segítségével; (2) az mCherry C-terminusán lévő H2B-t 1 × HA-taggal helyettesítettük BglII és BamHI helyeken keresztül, amelyben az 1 × HA-tagot átfedő PCR segítségével szintetizáltuk az NZ-094 és 095 primerekkel. A Mito-mCh-1 × HA-t úgy állítottuk elő, hogy a H2B-mCh-1 × HA-ban a H2B H2B-t AgeI és NotI helyeken keresztül Mito gblock23-ra cseréltük. A Mito-mCh-smHA-t a Mito-mCh-1 × HA 1 × HA tag-jének az smHA-KDM5B-MS2-ből amplifikált smHA-val való helyettesítésével állítottuk elő az NZ-096 és 097 primerek segítségével. Az mCh-H2B-t úgy hoztuk létre, hogy az sfGFP-H2B plazmid sfGFP gblokkját Gibson assembly segítségével mCherry gblokkal helyettesítettük.

A FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP plazmidokat az \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{{HA}}}}\) mEGFP-jének mCherry, HaloTag, illetve SNAP-tag gblokkokkal való helyettesítésével állítottuk elő.

A rekombináns frankenbody expressziójához és tisztításához használt plazmidot, a pET23b-FB-GFP-t Gibson által összeállítottuk egy FB-GFP amplikonnal és egy publikált, NdeI és NotI restrikciós helyekkel linearizált pET23b-Sso7d62,63 plazmiddal. Az FB-GFP amplikont az \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{{HA}}}}\) PCR segítségével amplifikáltuk az NZ-075 és 077 primerekkel.

A transzlációs vizsgálathoz az smHA-KDM5B-MS2 és a SunTag-kif18b riporterkonstrukciót az Addgene-től szereztük be (Plazmid # 81085 és # 74928), a SunTag scFv plazmidot (Plazmid # 60907) pedig a linkerben kódolt HA epitóp eltávolításával módosítottuk. A HA epitópot a QuikChange Lightning (Agilent Technologies) segítségével helyhez kötött mutagenezissel távolítottuk el a gyártó utasítása szerint a HAout-1 és 2 primerek használatával.

A g-blokkokat az Integrated DNA Technologies szintetizálta, a rekombináns plazmidokat pedig a Quintara Biosciences szekvenciaellenőrzéssel ellenőrizte. A primerek szekvenciáit az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. A képalkotó transzlációhoz használt összes plazmidot a NucleoBond Xtra Midi EF kit (Macherey-Nagel) segítségével állítottuk elő, kb. 1 mg mL-1 végkoncentrációval.

U2OS sejttenyésztés

U2OS sejteket (ATCC HTB-96) 37 °C-os inkubátorban, párásított, 5% CO2 -os hőmérsékleten DMEM táptalajban (Thermo Scientific), 10% (v/v) magzati szarvasmarha szérummal (Altas Biologicals), 1 mM l-glutaminnal (Gibco) és 1% (v/v) penicillin-streptomicinnel (Gibco vagy Invitrogen) kiegészítve tenyésztettük.

Transzfekció és gyöngybetöltés

A fehérje lokalizáció követéséhez a sejteket 2 nappal a képalkotás előtt 35 mm-es MatTek kamrába (MatTek) ültettük, és 18-24 órával a képalkotás előtt a gyártó utasítása szerint LipofectamineTM LTX reagenssel PLUS reagenssel (Invitrogen) tranziens módon transzfektáltuk.

Az MCP-Halo fehérjével jelölt mRNS-sel történő transzláció képalkotásához a sejteket 35 mm-es MatTek kamrába (MatTek) ültettük a képalkotás előtti napon. A képalkotás napján, a gyöngyök betöltése előtt a MatTek kamrában lévő tápfolyadékot Opti-MEM-re (Thermo Scientific) cseréltük 10% magzati szarvasmarha-szérummal. A plazmidok (smHA-KDM5B-MS2/FB) és a tisztított MCP-HaloTag fehérje17 keverékét a korábban leírtak szerint töltöttük be a gyöngyökbe6,17,26. Röviden, miután eltávolítottuk az Opti-mediumot a MatTek kamrából, 4 µl plazmidok (egyenként 1 µg) és MCP-HaloTag (130 ng) PBS-ben lévő keverékét pipettáztuk a sejtek tetejére, majd ~106 µm-es üveggyöngyöket (Sigma Aldrich) egyenletesen elosztottunk rajta. Ezután a kamrát hétszer erősen megkocogtattuk, majd Opti-mediumot adtunk vissza a sejtekhez. A gyöngyök betöltése után 3 órával a sejteket 1 ml 0,2 nM JF646-HaloTag ligandummal48 festettük meg, amelyet fenolvörös-mentes teljes DMEM-ben hígítottunk. A 20 perces inkubációt követően a sejteket háromszor mostuk fenolvörös-mentes teljes DMEM-ben, hogy eltávolítsuk az üveggyöngyöket és a nem ligált festékeket. Ezután a sejtek készen álltak a képalkotásra.

A mRNS jelölés nélküli képalkotó transzlációhoz a MatTek kamrára telepített sejteket tranziens módon transzfektáltuk a szükséges plazmidokkal, smHA-KDM5B-MS2/FB SunTag-kif18b/Sun-val vagy anélkül (a HA epitóp eltávolításával), LipofectamineTM LTX reagenssel a PLUS reagenssel (Invitrogen) a gyártó utasítása szerint a képalkotás napján. A transzfekciót követően 3 órával a tápfolyadékot fenolvörös-mentes teljes DMEM-re cseréltük. A sejtek ezután készen álltak a képalkotásra.

A FB-GFP tisztítása

A pET23b-FB-GFP-vel transzformált E. coli BL21 (DE3) pLysS sejteket 37 °C-on 0,6 OD600-as sűrűségűre növesztettük 2xYT médiumban, amely Ampicillint (100 mg L-1) és Chloramphenicolt (25 mg L-1) tartalmazott, rázás mellett. A fehérjeexpresszió indukálásához 0,4 mM végkoncentrációban izopropil-β-d-tiogalaktozidot (IPTG) adtunk, majd a hőmérsékletet 18 °C-ra csökkentettük. A sejteket 16 óra elteltével centrifugálással szüreteltük, majd 300 mM NaCl-lal, proteáz inhibitorokkal (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF-fel (20 mL L-1 kultúra) kiegészített PBS pufferben reszuszpendáltuk és szonikációval lizáltuk. A lizátumot centrifugálással tisztítottuk. A felülúszót két összekapcsolt HisTrap HP 5 ml-es oszlopra (GE Healthcare) töltöttük, mostuk és 0-500 mM imidazol lineáris gradiensével eluáltuk. A POI-t tartalmazó frakciókat összevontuk, Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO centrifugális szűrőegységgel (EMD Millipore) koncentráltuk, és HEPES alapú pufferben (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glicerin és 1 mM DTT) méretkizáró HiLoad Superdex 200 PG oszlopra (GE healthcare) töltöttük. Az FB-GFP fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, koncentráltuk és folyékony nitrogénnel történő gyorsfagyasztás után -80 °C-on tároltuk.

Immunfestés

U2OS sejteket tranziens módon transzfektáltuk 4 × HA-mCh-H2B vagy 4 × HA-mCh-β-aktin sejtekkel LipofectamineTM LTX reagenssel PLUS reagenssel (Invitrogen). A transzfekciót követően 26 órával a sejteket 4%-os paraformaldehiddel (Electron Microscopy Sciences) fixáltuk 10 percig szobahőmérsékleten, permeabilizáltuk 1% Triton 100-ban PBS-ben, pH 7,4-ben 20 percig, blokkoltuk 20 percig Blocking One-P-ben (Nacalai Tesque), majd 4 °C-on egy éjszakán át tisztított FB-GFP fehérjével (0,5 µg ml-1 10%-os blokkoló pufferben) festettük. Másnap reggel a sejteket PBS-szel mostuk, és a POI-t Olympus IX81 forgó lemezes konfokális mikroszkóppal (CSU22 fej) képeztük le ×100-as olajimmersziós objektívvel (NA 1,40) a következő körülmények között: 488 nm (0,77 mW; az objektív hátsó fókuszsíkjánál mérve; a továbbiakban minden lézerteljesítmény-mérés az objektív hátsó fókuszsíkjának felel meg) és 561 nm (0,42 mW) szekvenciális képalkotás 50 időponttal, késleltetés nélkül, 2 × 2 pörgési sebességgel, 100 ms expozíciós idővel. A képeket Photometrics Cascade II CCD-kamerával, SlideBook szoftverrel (Intelligent Imaging Innovations) készítettük. Az immunfestési képeket az egyes csatornák 50 időponti képének átlagolásával készítettük Fiji64 segítségével.

Western blotok

U2OS sejteket tranziens módon transzfektáltuk 4 × HA-mCh-H2B vagy 4 × HA-mCh-β-aktinnal LipofectamineTM LTX reagenssel a PLUS reagenssel. A transzfekciót követően 10 órával a sejteket learattuk és 120 µl cOmplete proteáz inhibitorral (Roche) ellátott RIPA pufferben lizáltuk. Minden sejtlizátumból 6,5 µl-t NuPAGETM 4-12%-os Bis-Tris fehérje gélre (Invitrogen) töltöttünk, és 60 percig 100 V-on és 25 percig 200 V-on futtattuk. A fehérjéket PVDF-membránra (Invitrogen) vittük át, 1 órán át blokkoló pufferben (5% tejpor 0,05% TBS-Tween 20-ban) blokkoltuk, majd egy éjszakán át festettük tisztított FB-GFP fehérjével (0,5 µg ml-1 blokkoló pufferben) vagy anti-HA 12CA5 szülői antitesttel (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; 2000-szeres hígítás, végső koncentráció 0,5 µg ml-1 blokkoló pufferben). A 12CA5 primer antitest esetében további 1 órás inkubációt végeztünk anti-egér antitesttel/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000-szeres hígítás blokkoló pufferben). A POI-t FB-GFP esetében a GFP fluoreszcenciájából, illetve anti-HA antitest esetében az Alexa 488-ból detektáltuk Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) segítségével, a következő feltételek mellett: 473 nm gerjesztési hullámhossz, LPB szűrő (≥510 nm), 300 V-os fotomultiplier cső és 10 µm pixelméret. A vágatlan és feldolgozatlan western blotokat a 3. kiegészítő ábra tartalmazza.

Fluoreszcencia helyreállítás fotobleaching után

A FB HA epitópokhoz való kötődési affinitásának tanulmányozására élő sejtekben FRAP kísérleteket végeztünk 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) és FB-GFP (1,25 µg) transzfektált sejteken 24 órával a FRAP előtt. A képeket egy Olympus IX81 forgó lemezes konfokális mikroszkóppal (CSU22 fej) készítettük, amelyhez egy Phasor fotomanipulációs egységet (Intelligent Imaging Innovations) kapcsoltunk ×100-as olajimmersziós objektívvel (NA 1,40). A fotobleaching előtt 20 vagy 10 képkockát rögzítettünk 1 vagy 5 s időintervallummal. A képeket 488 nm-es (0,77 mW) lézerrel készítettük 100 ms expozíciós idővel, majd 561 nm-es (0,42 mW) lézerrel 15 ms expozíciós idővel. A forgó lemezt 1 × 1 pörgési sebességre állítottuk be. A pre-FRAP képek készítése után a p488 nm-es lézerrel (a Phasor egységből a fotobleacheléshez) 17 mW-on, 100 ms expozíciós idővel, vagy 4 mW-on, 500 ms expozíciós idővel a magban lévő kör alakú régió fotobleachelésére használtuk. A fotobleaching után 30 képet készítettünk késleltetés nélkül vagy 500 ms késleltetéssel, majd 100 képet 1 s késleltetéssel és 100 képet 5 s késleltetéssel, ugyanazokkal a képalkotási beállításokkal, mint a FRAP előtti képeket. A Slidebook szoftver segítségével exportáltuk a fotobleached folt fluoreszcens intenzitását az idő függvényében. A sejtmag és a háttér fluoreszcens intenzitását a Fiji64 segítségével kaptuk meg, miután a StackReg Fiji plugin65 segítségével korrigáltuk a sejtek mozgását. A FRAP-görbét és a thalfát az easyFRAP-web66 segítségével kaptuk meg, a weboldal utasításainak megfelelően. A 4b, d ábrát a Mathematica (Wolfram Research) segítségével generáltuk.

MCP tisztítás

AzMCP-HaloTag tisztítása immobilizált fémaffinitás kromatográfiával történt17. Röviden, a His-taggal jelölt MCP-HaloTagot egy Ni-NTA-agarózzal (Qiagen) töltött oszlopon keresztül tisztítottuk a gyártó utasításai szerint, kisebb módosításokkal. Az érdekelt fehérjét expresszáló E. coli-t PBS pufferben lizáltuk, amely proteáz inhibitorok teljes készletét (Roche) és 10 mM imidazolt tartalmazott. A gyantát 20 és 50 mM imidazolt tartalmazó PBS alapú pufferrel mostuk. A fehérjét ezután 300 mM imidazolt tartalmazó PBS pufferben eluáltuk. Az eluált His-taggal jelölt MCP-t HEPES-alapú pufferben (10% glicerin, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP-40 detergens és 1 mM DTT) dializáltuk, folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk, majd -80 °C-on tároltuk.

Csejtelőkészítés a naszcens láncok követéséhez

A riporter plazmid smHA-KDM5B-MS2 (Addgene plazmid #81085) és az FB konstrukciót vagy tranziens módon transzfektáltuk MCP-HaloTag fehérje nélkül, vagy MCP-HaloTag fehérjével gyöngyöztük be az U2OS sejteket, amelyeket 35 mm-es MatTek kamrákra telepítettünk 4-6 órával a képalkotás előtt. 3 órával később, ha az MCP-HaloTag fehérjét gyöngyökkel töltöttük fel, a sejteket JF646-HaloTag ligandummal festettük meg, majd fenolvörös-mentes teljes DMEM-közeggel mostuk. Ha nem volt szükség MCP-HaloTag fehérjére, a sejtek közegét 3 órával a transzfekció után fenolvörös-mentes teljes DMEM-közegre cseréltük. A sejtek ezután készen álltak a képalkotásra.

A multiplex képalkotáshoz két riporter plazmidot, smHA-KDM5B-MS2 és SunTag-kif18b, valamint két szondát, FB-mCh és Sun-GFP (a HA epitóp eltávolításával) tranziens módon transzfektáltunk MatTek kamrára telepített U2OS sejtekbe 4-6 órával a képalkotás előtt. 3 órával később a sejtek tápfolyadékát fenolvörös-mentes teljes DMEM tápfolyadékra cseréltük. A sejtek ezután készen álltak a képalkotásra.

A transzlációs és kolokalizációs vizsgálatok képalkotási feltételei

Az egyes mRNS-ek és azok transzlációs állapotának FB-vel történő képalkotásához egy egyedi építésű, ferde megvilágítási sémán (HILO) alapuló szélesmezős fluoreszcens mikroszkópot használtunk17,67. Röviden, a gerjesztő sugarakat, 488, 561, 637 nm-es szilárdtest-lézereket (Vortran) kapcsoltuk össze és fókuszáltuk tengelyen kívül az objektív (APON 60XOTIRF, Olympus) hátsó fókuszsíkjára. Minden bejelentett lézerteljesítményt az objektív hátsó fókuszsíkján mértünk. Az emissziós jeleket egy képalkotó minőségű, ultralapos dichroikus tükörrel (T660lpxr, Chroma) osztottuk fel. A hosszabb emissziós jeleket (távoli vörös) a felosztás után egy sávszűrőn (FF01-731/137-25, Semrock) vezettük át. A felosztás utáni rövidebb emissziós jeleket (vörös és zöld) egy szűrőkerékbe (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation) beépített vörös sávszűrőn (FF01-593/46-25, Semrock) vagy zöld sávszűrőn (FF01-510/42-25, Semrock) vezettük át. A hosszabb (távoli vörös) és a rövidebb (vörös és zöld) emissziós jeleket két különálló EM-CCD kamerával (iXon Ultra 888, Andor) detektáltuk egy 300 mm-es akromatikus kettőslencsével (AC254-300-A-ML, Thorlabs) történő fókuszálással. Az Olympus ×60-as objektív, a 300 mm-es tubuslencse és az iXon Ultra 888 kombinációja 130 nm-es pixel-1 ×100-as képeket eredményez. Az élő sejtek képalkotásához egy piezoelektromos színpadon (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) egy színpadra szerelt, hőmérsékletet (37 °C), páratartalmat és 5% CO2-t biztosító inkubátor (Okolab) található. A lézereket, a kamerákat, a piezoelektromos színpadot és a szűrőkereket egy nyílt forráskódú mikrokontroller, az Arduino Mega board (Arduino) szinkronizálta. A képalkotás rögzítését nyílt forráskódú Micro-Manager szoftverrel (1.4.22)68 végeztük.

A képalkotás méretét a középső 512 × 512 pixelre2 (66,6 × 66,6 µm2), a kamera integrációs idejét pedig 53,64 ms-ra állítottuk be. A kamerák kiolvasási ideje a képalkotási méretünk, a kiolvasási mód (30 MHz) és a függőleges eltolási sebesség (1,13 µs) kombinációjából 23,36 ms volt, ami a 13 Hz-es képalkotási sebességünket eredményezte (70 ms képenként). A vörös és zöld jeleket felváltva képeztük le. Az emissziós szűrő pozícióját a kamera kiolvasási ideje alatt változtattuk. Az áthaladás minimalizálása érdekében a távoli vörös jelet a zöld jellel egyidejűleg képeztük le. A sejtek teljes vastagságának megörökítése érdekében 13 z-halmazt képeztünk le 500 nm-es lépcsőmérettel (összesen 6 µm) a piezoelektromos állvány segítségével. Ez azt eredményezte, hogy a teljes sejtképzési sebességünk 1 Hz volt a vörös vagy zöld jelek képalkotásakor, és 0,5 Hz a vörös és zöld jelek képalkotásakor, függetlenül a távoli vörös képalkotástól.

Az 1c, d, 2a, e ábrák esetében a sejtek egyetlen síkját folyamatosan, 6,5 Hz-en keresztül 100 időponttal képeztük le, és az idő alatt átlagoltuk (lézerek: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (1c. ábra), 90 µW (1d. ábra), 19 µW (2a. ábra), 155 µW (2e. ábra); 637 nm, 220 µW). A 2b. ábrán (balra) a sejtet folyamatosan, 0,5 Hz-en, 488 nm-es (100 µW) és 561 nm-es (10 µW) lézerrel, 13 z-halmazzal képeztük le minden egyes időpontban és átlagoltuk az egész idő alatt. A felvett 13 z-halmaz átlagát Fiji segítségével dekonvolváltuk. A 6b., c., e. és f. ábra esetében a sejteket 10 másodpercenként, időpontonként 13 z-halmazzal képeztük le (lézerek: 488 nm, 13 µW (6b. ábra), 18 µW (6c. ábra); 561 nm, 172 µW (6f. ábra); 637 nm, 150 µW (6b, c. ábra), 35 µW (6e. ábra)). A 7b. ábra esetében a sejtet folyamatosan, 0,5 Hz-es frekvencián, 13 z-stackkel képeztük le minden egyes időpontban (lézerek: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). A 8b. ábra esetében a sejteket 14 másodpercenként képeztük le 13 z-halmazzal minden időpontban (lézer: 488 nm, 70 µW). A 8c. ábra esetében a sejteket 40 másodpercenként 13 z-halmazzal képeztük le minden egyes időpontban (lézer: 488 nm, 130 µW). A motoros transzlációs foltok sebességének meghatározásához (8e. ábra) a neuronokat folyamatosan, 1 Hz-es frekvencián, 13 z-halmazzal minden időpontban képeztük le.

A 2b. ábra (jobbra) és a 2c. ábra esetében a kopokalizációt a korábban leírt Olympus IX81 forgó lemezes konfokális mikroszkóppal (CSU22 fej), ×100-as olajimmersziós objektívvel (NA 1,40) képeztük le a következő feltételek mellett: 488 nm (0,77 mW) és 561 nm (0,42 mW) szekvenciális képalkotás öt időpontban, késleltetés nélkül, több z szelettel, hogy minden időpontban a teljes sejttestet lefedje, 1 × 1 pörgési sebesség, a sejt fényerejéhez igazított expozíciós idő. A képeket Photometrics Cascade II CCD-kamerával, SlideBook szoftverrel (Intelligent Imaging Innovations) készítettük. Az ábrákon megjelenített képek öt időpont átlagolásával készültek, majd az összes z-szelet maximális projekcióját Fiji64 segítségével végeztük el.

A transzlációs helyek részecskekövetése

Az egyes transzlációs helyek detektálása és követése a maximális intenzitású projekciós képeken egyedi Mathematica (Wolfram Research) kóddal17 történt. Röviden, a képeket sávszűrővel dolgoztuk fel a részecskék kiemelésére, majd binarizáltuk őket, hogy intenzitás-középpontjaikat pozíciókként detektáljuk a Mathematica beépített ComponentMeasurements rutinjával. A detektált részecskéket egy legközelebbi szomszéd keresés segítségével követtük és kapcsoltuk össze időben. Az mRNS-ek és a transzlációs helyek pontos koordinátáit (szuperfelbontott helyeit) úgy határoztuk meg, hogy az eredeti képeket (a beépített Mathematica rutin NonlinearModelFit segítségével) a következő formájú 2D Gaussokra illesztettük:

mivel IBG a háttérfluoreszcencia, I a részecske intenzitása, (x0, y0) a részecske helye és (σx, σy) a részecske terjedése. A két kamera közötti eltolódást a Mathematica beépített FindGeometricTransform rutinjával regisztráltuk, hogy megtaláljuk azt a transzformációs függvényt, amely a 100 nm átmérőjű Tetraspeck gyöngyök illesztett pozícióit a kép látómezejében egyenletesen elosztva a legjobban igazította.

A 6c, e, f, 7c, 8b, d ábrák esetében a részecskéket egyedi Mathematica kóddal követtük és a Mathematica segítségével ábrázoltuk tovább. A 7c. ábra esetében az átlagos átlagos négyzetes elmozdulásokat a Gauss-illesztett koordinátákból (2D maximális intenzitású vetületi képekből) számoltuk ki. A diffúziós állandót úgy kaptuk meg, hogy az első öt időpontot egy m = 4D meredekségű egyenesre illesztettük, ahol D a diffúziós együttható. Az egyes motorizált transzlációs foltokat (8e. ábra) a Fiji Plugin TrackMate69 segítségével követtük a maximális projekciót követően, majd Mathematica segítségével ábrázoltuk. Az összes Mathematica kód kérésre rendelkezésre áll.

1×HA-jelölt fehérjék egymolekulás követése sejtekben

A képalkotás előtti napon a sejteket MatTek kamrára telepítettük, és a gyártó utasításai szerint LipofectamineTM LTX reagenssel PLUS reagenssel (Invitrogen) 1× HA-mCh-H2B és FB-Halo transzfektáltuk átmenetileg LipofectamineTM LTX reagenssel (Invitrogen). A transzfekciót követően 3 órával a tápfolyadékot teljes DMEM-re cseréltük. A képalkotás előtt a sejteket nátrium-borohidriddel (NaBH4) kezelt Halo ligand TMR-rel (Promega)45 festettük meg. Röviden, 1 µl 1 mM Halo ligand TMR festéket 10 percig redukáltunk 200 µl 50 mM NaBH4 oldatban (10 percig PBS-ben előoldva, pH 7,4). Ezután 200 µL redukált TMR-t 800 µL fenolvörös-mentes DMEM-mel hígítottunk, hogy 1 mL redukált-TMR médiumot kapjunk. A transzfektált sejtek médiumát kicseréltük a redukált-TMR médiumra, majd a sejteket 30 percre inkubátorba (5% CO2, 37 °C) helyeztük a festéshez. Ezután a sejteket háromszor mostuk fenolvörös-mentes DMEM-mel. A mosások között a sejteket 5 percig inkubáltuk inkubátorban (5% CO2, 37 °C).

A sejteket egy egyedi építésű, ferde megvilágításon (HILO) alapuló szélesmezős fluoreszcenciamikroszkóppal17,67 képeztük le. A képalkotó látómezőt 256 × 256 pixelre2 (33,3 × 33,3 µm2) állítottuk be, a kamera integrációs idejét pedig 30 ms-ra. A sejteket 7,7 mW 561 nm-es lézerrel képeztük le, képenként 43,8 ms képalkotási sebességgel, összesen 10 000 időponttal (7,3 perc). A képalkotás során a Halo-TMR redukált ligandum fotoaktiválása érdekében 10 másodpercenként egy 6,2 mW-os 405 nm-es lézert 50 ms-ig impulzáltunk. Az egyes molekulákat a TrackMate69 Fiji plugin segítségével követtük. Annak biztosítása érdekében, hogy a nyomok 1 × HA-mCh-H2B-hez kötött FB-Halo-t képviseljenek, a nyomokat tovább szűrtük a Mathematica programban. A szűrő kizárta a 16 képkockánál rövidebb pályákat. Továbbá a képkockák közötti összes ugrásnak 220 nm-nél kisebbnek kellett lennie. Ezt a kritériumot mások is használták a kromatinhoz kötött és a nem kötött transzkripciós faktorok megkülönböztetésére46. Végül a Mathematica programban a pályákat színkódoltuk aszerint, hogy mikor készültek (mint az 5. kiegészítő ábrán), vagy a képkockák közötti átlagos ugrásméret szerint (mint az 5. ábrán).

Puromycin kezelés

U2OS sejteket, amelyeket tranziens módon transzfektáltunk smHA-KDM5B-MS2-vel és FB-vel vagy smHA-KDM5B-MS2-vel, FB-vel és MCP-HaloTaggal töltöttünk fel, a fenti módon, a képkockák közötti 10 s-os időközökkel képeztünk le. Miután 5 vagy 10 időpontot vettünk fel a kezelés előtti képként, a sejteket közvetlenül a 6. vagy 11. időpont felvétele előtt 0,1 mg mL-1 puromycin végkoncentrációval kezeltük. A puromicin hozzáadása után a sejteket az előkezelés előtti felvételek készítésekor használt körülmények között képeztük le, amíg a transzlációs foltok el nem tűntek.

Újsejtkultúra és transzfekció

A macskák agykérgi neuronjait olyan embrió 18. napi (E)18 magzatok eldobott agykérgéből nyertük, amelyeket előzőleg a hippokampusz kinyerése céljából boncoltunk, és 10% magzati szarvasmarha szérumot (FBS, Atlas Biologicals) és 10% dimetil-szulfoxidot (Sigma-Aldrich, D8418) tartalmazó Neurobasal médiumban (ThermoFisher Scientific) folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A kriokonzervált patkány agykérgi neuronokat ∼15 000-30 000 sejt/cm2 sűrűségben MatTek tányérokra (MatTek) ültettük és 2% B27 kiegészítést (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alanin/l-glutamin és 1% FBS-t (Atlas Biologicals) tartalmazó Neurobasal médiumban tenyésztettük. A transzfekciókat 5-7 napos tenyésztés után Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint. A 4 × HA-mRuby-Kv2.1-et és FB-GFP-t együttesen expresszáló neuronokat 1-2 nappal a transzfekciót követően leképeztük (2b. ábra). Az smHA-Kv2.1-et és FB-GFP-t együttesen expresszáló neuronokat 1-7 nappal a transzfekció után képeztük le (2. kiegészítő ábra balra). A transzlációs vizsgálatokhoz a neuronokat 4-12 órával a transzfekció után vettük fel. Minden neuron-képalkotási kísérletet hőmérséklet-szabályozott (37 °C), párásított, 5%-os CO2-környezetben, fenolvörös nélküli Neurobasal médiumban (ThermoFisher Scientific) végeztünk. A neuronok azonosságát úgy erősítettük meg, hogy a leképezendő sejttestből kiinduló folyamatokat több száz mikronon keresztül követtük, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy azok valódi neuronok.

A zebrafish fejlődésének nyomon követése

Minden zebrafish kísérletet jóváhagyott a Tokyo Tech Genetic Experiment Safety Committee (I2018001), és az állatok kezelése az irányelveknek megfelelően történik. Az FB-GFP zebrahal-embrióban történő megjelenítéséhez mRNS-t készítettünk az FB-GFP és az N × HA-mCh-H2B számára. Az FB-GFP-t és az N × HA-mCh-H2B-t kódoló DNS-fragmentumokat T7 promótert és poli A70-t tartalmazó plazmidba illesztettük be. A későbbi plazmidokat (T7-FB-GFP és T7-N × HA-mCh-H2B) XbaI restrikciós hellyel linearizáltuk az in vitro átíráshoz az mMESSAGE mMACHINE kit (ThermoFisher Scientific) segítségével. Az RNS-t RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk és vízben reszuszpendáltuk. A mikroinjekciózás előtt a zebrahal (AB) ikrákat 2 mg mL-1 pronázban (Sigma Aldrich; P5147) 0,03%-os tengeri sóban 10 percig történő áztatással hámtalanítottuk. Az 1 sejtes stádiumú embriók sárgájába (a sejtrész közelében) mRNS-t (egyenként 200 pg FB-GFP és N × HA-mCh-H2B) tartalmazó keveréket (~0,5 nL) injektáltunk. A negatív kontrollhoz a HA-mCh-H2B mRNS-t kihagytuk. 5-10 perccel az mRNS beadása után Cy5-jelölt, endogén hiszton H3 Lys9 acetilációra specifikus Fab-ot (CMA310)25 injektáltunk (100 pg ~0,5 nL-ben). Az injektált embriókat 28 °C-on inkubáltuk a négysejtes stádiumig, majd 0,5%-os agarózba (Sigma Aldrich, A0701) 0,03%-os tengeri sóba ágyaztuk be, az állat pólusával lefelé egy 35 mm-es üvegfenekű tálra (MatTek). A fluoreszcenciás felvételeket egy 28 °C-ra beállított fűtött állvánnyal (Tokai Hit) és egy UPLSAPO ×30 szilikon olajimmersziós objektívvel (NA 1,05) felszerelt konfokális mikroszkóppal (Olympus; FV1000) készítettük, amelyet a beépített FV1000 FLUOVIEW ver.4.2 szoftverrel kezeltünk. A 488, 543 és 633 nm-es lézerrel (640 × 640 pixel; 0,662 µm pixel-1, tűlyuk 800 μm; 2,0 μs pixel-1) 5 percenként három színes képet készítettünk egymás után, átlagolás nélkül. A maximális intenzitású vetületeket 20 darab 5 μm-es z-halmazból készítettük.

A zebrafish embriókon belüli sejtmagokat 4D-ben követtük a Fiji TrackMate69 plugin segítségével. Az eredményeket utófeldolgoztuk és ábrázoltuk Mathematica segítségével. A sejtmagok számának és területének, valamint az átlagos nukleáris, citoplazmatikus és nukleáris:citoplazmatikus intenzitásnak az időben történő számszerűsítéséhez az összes sejtmag intenzitását a maximális intenzitású vetületekben a Mathematica beépített ComponentMeasurements függvényével mértük. A ComponentMeasurements funkció a mérendő objektumok bináris maszkjait igényli. A sejtmagok bináris maszkjait a Mathematica beépített Binarize függvényével készítettük el, megfelelő intenzitásküszöbértékkel, hogy csak a sejtmagokat emeljük ki a Cy5-jelölt Fab (az endogén hiszton H3 Lys9 acetilációra specifikus) képeken. Az egyes sejtmagok körüli citoplazma maszkjait úgy készítettük el, hogy a nukleáris maszkokat 4 pixellel tágítottuk (a beépített Dilation parancs segítségével), majd a tágított maszkból kivontuk az eredeti, 1 pixellel tágított nukleáris maszkokat. Ezáltal az egyes magok körül gyűrűszerű maszkok jöttek létre, amelyekből a citoplazma átlagos intenzitását mértük.

Felületi plazmon rezonancia

A tisztított FB kötődési kinetikáját a HA epitóp taghez felületi plazmon rezonanciával (OpenSPR, Nicoyalife) mértük. Miután a biotinnal jelölt HA peptidet egy Streptavidin szenzorchip (Nicoyalife) befogta, a PBS 7,4 pH-jú futópufferben hígított tisztított FB-GFP-t lassan átáramoltattuk a szenzorchipen 5 percig, hogy a kölcsönhatás létrejöhessen. Ezután a futópuffert 10 percig hagytuk folyni a disszociációs adatok gyűjtéséhez. A nem-specifikus kötődési görbét úgy kaptuk meg, hogy az FB-GFP azonos koncentrációját ugyanabban a futópufferben egy másik Streptavidin szenzorchipen (Nicoyalife) átáramoltattuk. A kontroll adatait pontosan úgy gyűjtöttük, mint a kísérletben. A 100 és 30 nM FB-GFP esetében a kötődési válasz jelentősen magasabb volt, mint a kontrollnál, elhanyagolható nem-specifikus kötődési kölcsönhatás mellett. Ezért ezt a két koncentrációt választottuk a kötési kinetika illesztéséhez. A kontroll levonása után megkaptuk a jelválasz vs. idő görbét, amint az a 4. kiegészítő ábrán látható. A kötődési kinetikai paramétereket a görbe egy-egy kötődési modellhez való illesztésével kaptuk meg a TraceDrawer (Nicoyalife) szoftver segítségével (4. kiegészítő ábra).

Reporting summary

A kutatási tervvel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.