A gyors fehérje folyadékkromatográfia (FPLC) és a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC): két folyadékkromatográfiás módszer közvetlen összehasonlítása. Ez a cikk a két technika közötti különbségeket tárgyalja, különös tekintettel az analitikai követelményekre.
A gyors fehérje-folyadékkromatográfia (FPLC) és a nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) elnevezések már utalnak a kromatográfiás módszerek közötti különbségekre. Míg a HPLC nagy nyomással dolgozik a kis kémiai vegyületek elemzésére, addig az FPLC nagy biomolekulákat, például fehérjéket vagy DNS-t tisztít. A biomolekulák kromatográfiája nagyon igényes és érzékeny, mivel nem bírják a magas hőmérsékletet, a nagy nyomást és a HPLC-ben általában használt oldószereket. Ezen okok miatt a biomolekulák elválasztása a HPLC-hez képest alternatív megközelítést igényel.
A gyors fehérje folyadékkromatográfiára több kifejezést is szoktak használni, mint például biokromatográfia, bioszeparáció vagy biotisztítás. A kromatográfiának ezt a speciális formáját nagy, több kilodalton (kDa) méretű biomolekulák, például fehérjék, nukleotidok vagy peptidek tisztítására alkalmazzák (1. ábra). Az FPLC felhasználójának célja, hogy minél tisztább és natívabb terméket kapjon. A klasszikus HPLC céljai ezzel szemben az analitok azonosítása és minősítése, általában kis méretű vegyületek, amelyek mérete néhány atomtól körülbelül 3000 Da-ig terjed.
A tiszta fehérje kinyerésének kihívása a sejtkivonatból
A biomolekulákat tipikusan bakteriális vagy eukarióta sejtekből tisztítják, amelyek tele vannak fehérjékkel, DNS-sel, RNS-szel és sejtmembránokkal. Ezért a kívánt fehérje tisztítása a sejtkivonatból nagy kihívást jelenthet. A biokémikusok több trükköt alkalmaznak: az egyik a rekombináns fehérjék használata, amelyeket a sejtek túlkifejeznek. Az érdeklődésre számot tartó fehérje túlexpressziója lehetővé teszi a nagyobb mennyiségben történő tisztítást. A második trükk az, hogy az érdeklődésre számot tartó fehérjéhez olyan címkét adnak, amelyet a gyanta (oszlop anyaga) specifikusan felismer. A tag nélküli fehérjék nem kötődnek az oszlophoz és azonnal eluálódnak, míg a kívánt fehérje feldúsul és könnyen elválasztható.
A biomolekulákat sejtlizátumokból tisztítják, ami sokkal nagyobb mintamennyiséget jelent, mint az analitikus HPLC-ben. Ezért nagyobb mintahurkokat vagy akár nagyobb áramlási sebességű szivattyúkat használnak a minta befecskendezéséhez. Ráadásul az FPLC és a HPLC oszlopok anyagai teljesen különböznek egymástól. A HPLC esetében nagyon kis szemcseméretű és nagy nyomásállóságú szilikagömböket alkalmaznak, míg az FPLC a legtöbb módszerhez nagyobb szemcseméretű agaróz vagy polimer anyagot igényel. Az FPLC-hez használt gyanták nem olyan nyomásstabilak, mint a szilikagyöngyök, és nagyon érzékenyek a légbuborékokra. Továbbá nemcsak az oszlop anyaga, hanem az oszlop hardvere is különbözik. A klasszikus HPLC-ben nyomásálló rozsdamentes acél oszlopokat használnak. Mint már említettük, az FPLC esetében a nyomásstabilitás nem fontos, ezért átlátszó és biokompatibilis üvegoszlopokkal is lehet dolgozni. Ez nagy előny, mivel a felhasználó ellenőrizheti az oszlopot a légbuborékok szempontjából, vagy figyelemmel kísérheti az anyag állapotát a tisztítási futtatás során.
Diverz biomolekulák, változatos tisztítási módszerek
Az oszlopok anyagának különbségei a módszerekben is tükröződnek. Az analitikai HPLC-ben a fordított fázisú kromatográfia hidrofób állófázisokkal és poláros mobilfázisokkal a választott módszer, míg az FPLC-ben többféle módszert alkalmaznak (2. ábra). Az egyik FPLC-módszer a méretkizárásos kromatográfia (SEC), ahol a molekulákat méretük szerint választják el. A kisebb molekulák be tudnak diffundálni a gyöngyök pórusaiba, míg a nagyobb molekulák szinte visszatartás nélkül áthaladnak az oszlopon. A kisebb molekulák később eluálódnak ki az oszlopból, így a molekulák méretüknek megfelelő gradiens keletkezik. Egy másik elválasztási módszer az ioncserélő kromatográfia. A biomolekulákat a puffer pH-értékétől függő specifikus töltésük szerint választják el és tisztítják meg. Minél nagyobb töltésű a fehérje, annál jobban kötődik az ellentétes töltésű gyantához. A fehérje oszlopról való eluálásához a futás során növelik a sóionok koncentrációját. A sóionok versenyeznek a fehérjével a gyantához való kötődésért. Egy másik fontos FPLC-módszer az affinitáskromatográfia, ahol a kívánt molekula specifikusan tud kötődni az oszlophoz, míg a többi molekula nem tud, és kötődés nélkül eluálódik. Itt olyan speciális közeggel ellátott oszlopokat használnak, amelyek felismerik a kívánt biomolekulát. Az affinitáskromatográfia egy speciális formája az immobilizált fémion-affinitás (IMAC). Az érdeklődésre számot tartó fehérjét genetikailag módosítani kell, mégpedig úgy, hogy a fehérjéhez egy címkét adnak, amely általában hat hisztidinből áll. Az IMAC gyanta specifikusan felismeri ezt a “Hisâtag”-ot. Az eluálás a His-taggel ellátott fehérjékkel versengő imidazol koncentrációjának növelésével történik. Ezenkívül a fehérjéket specifikus hidrofóbitásuk alapján is el lehet választani a hidrofób kölcsönhatás elválasztási módszerével. A gyantát úgy állítják össze, hogy a leghidrofóbabb fehérjék kötődnek a legerősebben az oszlophoz, és a sógradiens csökkentésével eluálódnak.
A kívánt fehérje tisztításához általában a módszerek kombinációját alkalmazzák. Az első lépésben, az úgynevezett “befogási” lépésben a fehérjét a nyers kivonatból tisztítják. Jellemzően affinitáskromatográfiát alkalmaznak a tisztítás ezen első lépéséhez. A második lépésben, a “köztes” lépésben a további szennyeződést ioncserélő kromatográfiával vagy hidrofób kölcsönhatással távolítják el. A végső “polírozási” lépés – általában egy méretkizáró kromatográfiás lépés – célja, hogy megszabaduljon a maradék szennyeződésektől, és így nagy tisztaságú terméket kapjon. Ez a fehérjetisztítási stratégia teljes mértékben az adott biomolekulától függ. Egyes esetekben egy kétlépcsős tisztítás is elegendő lehet. Minél több módszert kombinálunk, annál többet veszítünk a tisztítás során a kívánt fehérjéből, de annál nagyobb tisztaság érhető el.
A tisztítás után az elért minta tisztaságát, koncentrációját és az enzim működését vagy aktivitását HPLC, nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE), enzimaktivitási vizsgálatok vagy tömegspektrometria segítségével lehet elemezni.
FPLC követelmények
A fehérjék láncba sorolt aminosavakból állnak. Ez a lánc háromdimenziós szerkezetbe van hajtogatva, ami az egyes fehérjék működésének és aktivitásának kulcsa. Ezért nagyon fontos, hogy ez a fehérjeszerkezet megmaradjon a tisztítási folyamat során. Az olyan külső tényezők, mint a magas hőmérséklet, a magas nyomás, a szélsőséges pH-érték vagy az oldószerek megzavarhatják a fehérje szerkezetét, ezért az FPLC során kerülni kell őket. A fehérjék munkahőmérséklete általában 4 °C. Ezért az FPLC-berendezést gyakran hidegkamrában vagy hűtőkamrában helyezik el, ahol nemcsak alacsony hőmérsékletnek, hanem kondenzációs páratartalomnak is ki van téve. Az FPLC-rendszer alkatrészeit kifejezetten ezekre a körülményekre kell tervezni. Ráadásul az FPLC-komponensek további kihívással is szembesülnek, mégpedig az eluensként használt sóoldatos pufferoldatokkal. Általában a sejtkörnyezethez hasonló izoszmotikus pH-értéket és sókoncentrációt választanak. A kromatográfiás rendszerek általában rozsdamentes acélból készülnek. Egyrészt a pufferekben lévő só korrózióhoz vezethet, másrészt a rozsdamentes acélból származó fémionok interferálhatnak a fehérjével és megzavarhatják annak szerkezetét. Ezért fontos elkerülni a rozsdamentes acélt, és biokompatibilis anyagot, például poliéter-éter-keton (PEEK) kerámiát vagy titániumot használni az FPLC elvégzésekor. A HPLC-rendszerekhez hasonlóan az FPLC-rendszereket is szoftver vezérli. Az FPLC és a HPLC szoftverek között jelentős különbségek vannak. Az utóbbit elsősorban a minták elemzésére használják, és számos analitikai eszközt tartalmaz. Az FPLC-ben azonban nincs szükség sok analitikai eszközre, és gyakori, hogy a módszereket a térfogat vagy akár az oszlop térfogata alapján generálják (3. ábra). A legtöbb FPLC-alkalmazásnál az oszloptérfogat-alapú módszereket részesítik előnyben, ami megkönnyíti a felskálázást. Az FPLC szoftverek többnyire nagyon intuitívak és felhasználóbarátok, és tartalmaznak közvetlen vezérlést, amely lehetővé teszi a paraméterek beállítását a futtatás során. Ezáltal a felhasználó nagyon spontán tud reagálni a különböző helyzetekre.
Az tehát egyértelmű, hogy e két kromatográfiás terület között jelentős különbségek vannak (1. táblázat). A módszerek, a hardver és a szoftverek nagyban különböznek attól függően, hogy a molekulát elemzik vagy tisztítják. Az FPLC-alkalmazások esetében a minták érzékenysége és az a törekvés, hogy a minták minél natívabbak legyenek, tovább növeli a kihívást. Összességében mindkét technika rendkívül érdekes terület, amellyel mindenkinek, aki ezen a területen dolgozik, tisztában kell lennie.
Stephanie Runde a Müncheni Műszaki Egyetemen szerzett biokémiai diplomát. Doktori fokozatát a berlini Freie Universität Berlinben szerezte, jelenleg a Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH-nál dolgozik FPLC termékmenedzserként.