Az immunfluoreszcencia (IF) egy gyakori morfológiai megközelítés, amelyet a szubcelluláris komponensek eloszlásának meghatározására használnak. Az IF vizsgálathoz fluoreszcens festékkel konjugált antitestekre van szükség. Az antitest a célpont epitópjához kötődve specifikusan felismeri az antigént, és a fluorofór fluoreszcens mikroszkóp alatt detektálható. Így a szubcelluláris komponensek sötét háttérben is láthatóvá válnak. Az IF alternatív félkvantitatív elemzési módszerként is használható az érdeklődésre számot tartó expresszió nyomon követésére.

Az IF-nek három típusa van: közvetlen IF, közvetett IF és kombinált IF.

A közvetlen IF egyetlen, fluoreszcens festékkel konjugált primer antitestet használ.

A közvetett IF két antitestet használ a festéshez: az epitóphoz specifikusan kötődő primer antitestet és egy hozzá illő, fluoreszcens festékkel konjugált másodlagos antitestet.

A kombinált IF a direkt és az indirekt IF festés kombinációja.

1. táblázat. A közvetlen, az indirekt és a kombinált IF összehasonlítása.

IF típusa	Direkt	Indirekt	Kombinált
Sémadiagram
Előnyei	Gyors festés Egyazon gazdatestből származó antitestek esetén elérhető Kisebb non-specifikus háttérjel	Szekunder jelerősítés Egyetlen másodlagos antitest több, ugyanabból a gazdaszervezetből származó primer antitestet is detektálhat Egy primer antitesthez különböző fluoreszcens festékkel rendelkező másodlagos antitestek illeszthetők .	Szekunder amplifikáció a gyenge jelátvitelhez Egyazon gazdaszervezetből származó antitestek esetén elérhető
Hátrányok	Kisebb érzékenység a szekunder jelátvitel-erősítés hiánya miatt	Az idő-időigényes különböző gazdaszervezetekből származó antitestek szükségesek Az antitestek keresztreaktivitásának lehetősége	többlépéses festés

Az IF három típusa közül, az indirekt IF módszer a legnépszerűbb.

Az IF megközelítés alkalmazható szöveti metszeteken, tenyésztett sejtvonalakon és egyedi sejteken. Az IF folyamata hasonló az immunhisztokémiához (IHC).

• Mintagyűjtés és fixálás

A mintákat a szövetek eltávolítása után gyorsan kell fixálni, és jobb, ha az előfixálást szívinfúzió útján, 4%-os formaldehiddel vagy paraformaldehiddel végezzük kis állatoknál, például rágcsálóknál. Ajánlott, hogy a szövetek ne legyenek 10 mm-nél vastagabbak, és a fixálószer térfogata legalább 15-20-szor nagyobb legyen, mint a szövet térfogata. A fixálás nagyon fontos a sejtek morfológiájának és szerkezetének, valamint az antigén integritásának megőrzése szempontjából. Ezért a fixáló oldatokat gondosan kell kiválasztani a különböző antigéneknek és szövetmintáknak megfelelően.

2. táblázat. Fixálási stratégia részleges antigénekhez.

• Dehidratálás és beágyazás

A szövetmetszetek készítése során a következő okokból van szükség a dehidratálásra:
1. Paraffinos metszet: A paraffin nem keverhető a vízzel.
2. Fagyasztott metszet: A fagyasztott-felolvasztott jégkristályok tönkretennék a sejtek morfológiáját.

A dehidratálás mindig úgy történik, hogy a szövetet komoly, növekvő gradiens etanololdatba vagy szacharózoldatba merítjük.

A szövetmintákat ezt követően paraffinmetszetekhez olvasztott paraffinviasz, fagyasztott metszetekhez pedig OCT vegyület hozzáadásával lehet beágyazni. Ez a lépés megfelelő keménységet biztosít a lágy szövetmintáknak, és lehetővé teszi a szövetek könnyű vágását.

• Szeletelés és festés

A beágyazott szöveteket mikrotóm vagy fagyasztóm segítségével vékony szeletekre lehet szeletelni. A szeletek vastagságát a sejtátmérő és az IF-vizsgálat célja szerint kell eldönteni. A vékonyabb szeleteket (≤10 μm) a festés előtt javasolt közvetlenül ragasztós tárgylemezre rögzíteni, mivel a többszöri mosási lépések során könnyen megmaradnak. A vastagabb szeletek (10~30 μm) jobb képeket eredményeznek a szabadon lebegő módszerrel, mivel az elsődleges antitest a szelet mindkét oldalán át tud hatolni. A szabadon lebegő metszeteket pedig festés után rögzítjük a tárgylemezekre. A kis szövetek, például az egér dorsalis gangliongyökér (DRG) szabadon lebegő metszetei nehezen kivitelezhetőek, és könnyen elveszik a minta. Ezért néhány kisméretű szövetmintánál a pálcikás metszetmódszer ajánlott. A festési lépéseket sötétben kell elvégezni, ha fluoreszcens festékkel konjugált antitestről van szó.

Elérhető IF protokollok:

• Pálcikás metszet
• Szabadon lebegő metszet
• Kultúrált sejtek

• Képalkotás és elemzés

A pozitív jelzést fluoreszcens mikroszkóp alatt, sötét háttérben virtualizáljuk. Az érdeklődés helyét általában egy olyan fehérje együttes festésével határozzák meg, amelynek a helye ismert. Alternatívaként a pozitív sejtek mennyisége vagy a pozitív jelátvitel fluoreszcencia-intenzitása is mérhető a kvantitatív elemzéshez. Például az erősebb fluoreszcencia-intenzitás a célfehérje relatív magas expressziójára utal.

1. ábra. Az IF munkafolyamata szöveti metszeteken.

Az IF és az IHC egyaránt hatékony megközelítés a morfológiai elemzéshez, fontos diagnosztikai és prognosztikai alkalmazásokkal. Számos különbséggel kell foglalkozni a kutatás során:

3. táblázat. Az IHC és az IF összehasonlítása

.

.

	IHC	IF
Megjelölési módszer	Kromogén	Fluoreszcens
Feldolgozási lépés	több, mint szükséges szubsztrát	kevesebb
Kép	Ultra érzékeny jelző “homályos” reakció eredménye a kromogén enzimkomplex által képzett csapadék	Nagy felbontás Sokszoros festés
Mikroszkóp	Fénymikroszkóp	Fluoreszcens mikroszkóp
Szabályozhatóság	Szabályozhatóság	Szabályozható a következő ideig évekig	Kevésbé stabil a fotobleaching miatt
Példa (egér hippokampusz)