Az elmúlt évtizedben a kemogenetikai és optogenetikai technikák forradalmasították az integratív idegtudományt, mivel új eszközöket biztosítottak bizonyos populációk vagy neurotranszmitterrendszerek aktivitásának nagyobb szelektivitással történő reverzibilis manipulálására (Sternson és Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). Az optogenetikával összehasonlítva, amely gyors és fázisos neuronális modulációt tesz lehetővé nagy időbeli felbontással, a kemogenetika lehetővé teszi a rendszerek kiterjedtebb modulációját, ami különösen hasznos a tónusos jelenségekre összpontosító vizsgálatok számára (pl. a dopamin motivációs folyamatokban való érintettségének vizsgálata; Whissell et al., 2016). A kemogenetikai eszközök közül széles körben használják a kizárólag dizájner drogok által aktivált dizájner receptorokat (DREADD), amelyeket biológiai “zár- és kulcs”-rendszernek neveznek a sejtaktivitás szelektív manipulálására a G-fehérje jelátviteli útvonalakon keresztül. Először a Roth csoportja fejlesztette ki nagyon elegánsan (Armbruster et al., 2007), ez a G-fehérjéhez kapcsolt receptor (GPCR) egy muszkarin receptor: a zár, amelyet úgy mutáltak, hogy csak a klozapin-N-oxidra (CNO) reagáljon, a kulcs, az atípusos antipszichotikum, a klozapin egy származékos metabolitja, egyébként potenciálisan farmakológiai aktivitással nem rendelkező.

A 2016 óta azonban néhány publikáció aggasztó kérdéseket vetett fel a CNO használatával kapcsolatban. Először is, a CNO viszonylag nagy dózisai (10 mg/kg) szisztémásan adagolva farmakológiai off-target aktivitást fejthetnek ki, amint azt a DREADD-k által nem közvetített viselkedési hatások indukciója bizonyítja patkányokban és egerekben (MacLaren és mtsai., 2016; Gomez és mtsai., 2017; Baerentzen és mtsai., 2019). Ezenkívül Gomez és munkatársai (2017) kimutatták, hogy a CNO nem jut át könnyen a vér-agy gáton, alacsony DREADD-kötési affinitást mutathat, és visszametabolizálódott klozapinná, így a DREADD-k valódi effektorává vált. E feltűnő megfigyelések alapján azt javasolták, hogy a CNO helyett kis dózisú klozapint (0,1 mg/kg) használjanak közvetlenül a DREADD-k aktiválására. A klozapin alacsony dózisainak alkalmazása a fokozatosan klozapinná átalakuló CNO nagy dózisai helyett azonban két fő korlátot eredményez. Először is, nem nyilvánvaló, hogy a klozapin akut injekcióban vagy hosszan tartó diffúzióban ugyanúgy hat a DREADD-kre (Mahler és Aston-Jones, 2018). Másodszor, mivel a klozapin egy atipikus antipszichotikus szer, számos endogén célpontja van, például szerotoninerg, muszkarinerg vagy dopaminerg receptorok, viszonylag erős affinitásokkal (Meltzer, 1989; Schotte és mtsai., 1993; Brunello és mtsai., 1995; Ashby és Wang, 1996; Armbruster és mtsai., 2007), és valószínűleg off-target hatásokat vált ki, még alacsony dózisok esetén is. Valóban, a DREADD-kísérletekhez ajánlott 0,1 mg/kg klozapin dózis jelentősen növeli a szorongással kapcsolatos viselkedést egerekben (Manzaneque és mtsai., 2002), valamint patkányokban (ezt a hatást mi is megfigyeltük; R. Goutaudier és S. Carnicella, nem publikált megfigyelések), ahol a klozapin a potenciális szedáció révén a lokomóciót is befolyásolja, és rontja a kognitív rugalmasságot (Ilg és mtsai., 2002), 2018).

Noha e hatások előfordulása függhet az alkalmazott fajtól, törzstől vagy nemtől, és nagyon diszkrét lehet (mivel nem minden viselkedési dimenziót érint); potenciálisan jelentősen befolyásolhatják az állatok teljesítményét a különböző viselkedési feladatokban. A magas stressz és a szorongás zavaró tényezők lehetnek például memória- vagy fájdalomvizsgálatokban (Sousa és mtsai., 2006; Sorge és mtsai., 2014). Ezenkívül a visszaélés kábítószerekkel vagy pszichiátriai rendellenességekkel, például skizofréniával, szorongással vagy kognitív rugalmassággal kapcsolatos viselkedés módosíthatja az egész fenotípust (Floresco és mtsai., 2009; Koob és Schulkin, 2018). E megfigyelések alapján fontos óvintézkedésekre van szükség a klozapinnal kapcsolatban az elfogult viselkedési vizsgálatok elkerülése érdekében.

Szelektívebb lenne egy új, kifejezetten a DREADD-kre tervezett molekula? A 21 vegyület (C21) egy szintetikus DREADD ligandum, amelyet 2015-ben fejlesztettek ki (Chen és mtsai., 2015) és részben in vitro, valamint in vivo jellemeztek 2018-ban (Thompson és mtsai., 2018). Ismét leírták, hogy alacsony dózisokban (<3 mg/kg) mentes a viselkedési off-target hatásoktól, és képes megváltoztatni a DREADD-expresszáló állatok viselkedését. Ezt a tanulmányt erősítette meg Jendryka és munkatársai (2019), akik farmakokinetikai és farmakodinamikai kísérleteket végeztek egerekkel és C21-gyel (3 mg/kg). Kimutatták, hogy 30 perccel a C21 beadása után a molekula koncentrációja a liquorban >10-szer magasabb volt, mint a DREADD aktiválásának becsült EC50-értéke (CSF = 40 nm és EC50DREADDs = 3 nm), és visszametabolizáció nélkül klozapinná. Egy nemrégiben patkányokon, egereken és makákókon végzett BioRxiv preprint vizsgálat (Bonaventura és mtsai., 2018) eredményei azonban arra utalnak, hogy bár a C21 alacsony agyi penetrációt mutat, 1 mg/kg-os dózis már vad típusú egerekben is módosíthatja az agyműködést. Ezenkívül gyenge affinitást és foglaltságot figyeltek meg a DREADD-hez in vitro patkány agyszeletekben, valamint in vivo egerekben és makákókban pozitronemissziós tomográfiás vizsgálatban. A C21-gyel azonos kísérleti vizsgálat alapján alternatívaként két másik ligandumot, a JHU37152-t és a JHU37160-at javasolták, amelyek nagyobb in vivo potenciállal rendelkeznek a DREADD-kre és potenciálisan kevesebb off-target hatással (Bonaventura és mtsai., 2018). Bár a DREADD ligandumok ezen új generációja ígéretesnek tűnik, újdonságuk miatt még mindig kevéssé jellemzettek, és szerkezetileg továbbra is homológok a klozapinnal és a CNO-val. A kimerítő jellemzés a celluláris és viselkedéses vizsgálatokban ezért kulcsfontosságú lesz a CNO esetében talált potenciális buktatók kizárásához.

A kemogenetikai megközelítések szelektivitásának javítására egy alternatív megoldás egy másik zár- és kulcskombináció alkalmazása lenne. Ilyen a κ-opioid receptor-DREADD (KORD), amely a humán κ-opioid receptorból származó mutált gátló GPCR (Vardy és mtsai., 2015). A klasszikus DREADD-ekhez képest, amelyek klozapin, CNO, C21 vagy JHU vegyületeket kötnek, a KORD-ot a szalvinorin B, a KOR-szelektív agonista szalvinorin A drogszerű metabolitja, a szalvinorin A. Bár ezt a kemogenetikai megközelítést elegánsan használták egy aktiváló DREADD-vel kombinálva, hogy egy “ON és OFF” rendszert hozzanak létre ugyanazon neuronális populáción belül (Vardy et al, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), továbbra is marginálisan használják, mivel csak rövid idő alatt csökkenti a neuronális aktivitást (Aldrin-Kirk és Björklund, 2019). Ezenkívül a szalvinorin B nagy koncentrációban mutat némi affinitást az endogén KOR-hoz, és még nem részesült alapos jellemzésben, ahogyan azt jelenleg a DREADD-vel kapcsolatos vegyületek esetében végzik (Roth, 2016). A GPCR mutált ioncsatornával való helyettesítése, egy másik alternatív tervezett receptor, az úgynevezett ligandumkapcsolt ioncsatornák (LGIC) a Stenson laboratórium által kifejlesztett lehetőség (Magnus et al., 2011). A DREADD-khez képest az LGIC-k egy mutált nikotinreceptor ligandumkötő doménjét egy másik kiválasztott receptor ionpórus doménjével kombinálják, hogy egy kiméra ioncsatornát hozzanak létre. A DREADD-khez hasonlóan ezt a hibrid csatornát a kinuklidinil-benzamidból, egy α7 nikotinos acetilkolinreceptor agonistából származó kis agonista aktiválja, és lehetővé teszi az ioncserét a neuronmembránon keresztül. Az erre a megközelítésre jellemző egyéb korlátok mellett (Aldrin-Kirk és Björklund, 2019) a DREADD-kkel közös az is, hogy olyan farmakológiai ligandumot használnak, amely a kísérleti körülményektől függően potenciálisan kölcsönhatásba léphet az endogén receptorokkal. Végül, mindezek a zárak az endogén receptorokból származnak, és mint ilyenek, nem tudnak megszabadulni a farmakológiához eredendően kapcsolódó korlátozásoktól.

A közelmúltbeli fejleményeken és a fennmaradó kérdéseken túlmenően fel kell tenni egy döntő kérdést: vajon megtalálják-e valaha is a teljesen szelektív és inert kulcsot? Valószínűleg nem. Lényeges szem előtt tartani, hogy a DREADD-k a genetikát és a farmakológiát ötvöző kemogenetikai eszközök. Bár a genetikai megközelítések erőteljes kontrollt biztosítanak a zárak (azaz a DREADD-k) kifejeződésére bizonyos sejtpopulációkban vagy alpopulációkban feltételes megközelítésekkel, ezek az endogén GPCR-ekből származnak, és mint ilyenek, ugyanazoknak a korlátoknak vannak kitéve, mint a kulcs klasszikus farmakológiája. Ezért nem valószínű, hogy olyan molekulákat találunk, amelyek nagy kötődési affinitást mutatnak a DREADD-khez anélkül, hogy affinitást mutatnának az agyban már jelen lévő számos receptor közül néhányhoz, amelyek szorosan kapcsolódnak a DREADD-khez. A klozapin például nagyon nagy affinitással rendelkezik a DREADD-khez, de az 5-HT2 szerotoninerg receptorhoz is (Ki = 10-8 mindkettőhöz; Armbruster és mtsai., 2007; Gomez és mtsai., 2017), és nagy affinitással rendelkezik más GPCR-ek széles köréhez (Ki = 10-7-10-6; Armbruster és mtsai., 2007). Még a kifejezetten ehhez a kemogenetikai technikához tervezett szintetikus ligandumok is jelentős affinitást mutatnak az endogén receptorokhoz. Például, bár a JHU37152 és a JHU37160 alacsonyabb affinitással rendelkezik az 5-HT receptorokhoz, mint a klozapin, összességében hasonló célprofiljuk van, mint ennek a gyógyszernek, még nagyobb affinitással a muszkarin receptorokhoz (Bonaventura és mtsai., 2018), ami potenciálisan erősebb off-target hatásokra utal. A C21 szintén nagyobb affinitást mutat a hisztaminerg H1-receptorhoz, mint a DREADD-khez (Ki > 10-8 és Ki = 10-7,2, illetve; Thompson és mtsai., 2018), és nagyobb kötődési potenciált mutat az opioid receptorokhoz, mint a klozapin (Bonaventura és mtsai., 2018). E nagy hatású megközelítés buktatóinak minimalizálása érdekében, függetlenül a kulcsválasztástól, kritikus óvintézkedéseket kell tenni (1. ábra).

Minden viselkedési kísérlet előtt először a kísérleti feltételeket kell tesztelni a legjobb ligandum és az optimális dózis vagy dózisok megtalálása érdekében, a kísérleti megközelítéstől függően. A DREADD-ket nem szabad kulcsrakész eszköznek tekinteni; a viselkedési vizsgálat előtt sejtes, neurokémiai vagy elektrofiziológiai kísérleteket kell végezni (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016), hogy megerősítsék a ligandum hatékonyságát a választott dózisban az adott rendszerben. Ezenkívül DREADD-hiányos kontrollállatokat is be kell vonni annak igazolására, hogy a ligandum vagy a receptor önmagában nem rendelkezik aszpecifikus neurobiológiai hatásokkal, amelyeket esetleg egy neurotranszmitter aktivál vagy konstitutív aktivitással rendelkezik (Saloman et al., 2016).

Másrészt, ha lehetséges, két különböző DREADD-ligandumot kell tesztelni annak megerősítésére, hogy a megfigyelt viselkedési hatások specifikusan DREADD által közvetítettek. A DREADD-re gyakorolt specifikus farmakológiai hatások hasonlóak lennének, de a célponton kívüli hatások különbözhetnek.

Harmadszor, és ez a legkritikusabb pont, hagyományos farmakológiai kontrollokat kell alkalmazni. Ugyanazt a filozófiát kell alkalmazni, mint a farmakológiában, és a neurobiológiai kísérletekhez hasonlóan a DREADD-ket nem expresszáló transzgenikus állatok (pl. DREADD-üres vírusvektorok) csoportjait kell integrálni a ligandum és a választott dózis szelektív hatásainak ellenőrzésére (Smith és mtsai., 2016, Campbell és Marchant, 2018; Mahler és Aston-Jones, 2018; az ilyen felépítést követő kísérleti vizsgálatokra lásd még Xia és mtsai., 2017; Cope és mtsai., 2019). Ez a kijelentés triviálisnak tűnhet, de az abszolút szelektív ligandumra való törekvés és e megközelítés vonzereje már néhány túlságosan magabiztos viselkedési vizsgálathoz vezetett, amelyeket néha e kontroll teljes hiányában végeztek.

Összefoglalva, a DREADD-k pontos módot biztosítanak a neurális áramkörök és a viselkedés manipulálására, és az optogenetika nagyszerű alternatíváját nyújtják egy adott sejtes alpopuláció tonikus manipulációjára, így izgalmas új kutatási utakat nyitnak. Azonban, ahogyan az optogenetikában a fény termikus tulajdonságai aszpecifikus hatásokhoz vezethetnek (lásd még Owen et al., 2019), úgy a kemogenetikánál is nagyobb elővigyázatosságra van szükség, és kötelezővé kell tenni a standard kontrollokat. Fel kell ismerni a DREADD korlátait, és időt kell szánni az esetleges célon kívüli hatások elkerülésére vagy ellenőrzésére, valamint annak ellenőrzésére, hogy ez a megközelítés önmagában nem okoz-e torzítást. A genetika erősségeinek felhasználása a farmakológia gyengeségeinek figyelembevétele mellett maximalizálni fogja a megközelítésben rejlő lehetőségeket.