Genom assembly and annotation

A H. medicinalis genomjának összeállításához DNS-t nyertünk egy kifejlett piócából. A feldolgozás előtt a piócát legalább 2 hónapig táplálkozás nélkül tartottuk. Három shotgun könyvtárat hoztunk létre a szekvenálás elvégzéséhez három különböző platform segítségével (1. kiegészítő táblázat). Az összes leolvasott adatkészletet egyesítettük, és az SPAdes segítségével egyetlen assemblyt hoztunk létre. A kapott assembly 168 624 kontigot tartalmazott, az N50 contig hossza 12,9 kb volt (2. kiegészítő táblázat).

Az előzetes elemzés (contigs BlastN) kimutatta a bakteriális szekvenciák jelenlétét a kapott assemblyben. Ezért binninget végeztünk a piócakontigok megkülönböztetésére (egy piócakontig). A kontigok eloszlását GC-bőségük, tetranukleotidfrekvenciájuk és olvasási lefedettségük szerint alakítottuk ki. A binning pontosságának növelése érdekében a leolvasási lefedettséget a DNS-leolvasások és a H. medicinalis kombinált transzkriptomjának megfelelő leolvasások kombinálásával határoztuk meg (lásd alább). Az eukarióta és prokarióta kontigok megkülönböztetését az 1a/b. ábra, a 3. kiegészítő táblázat és a 2. kiegészítő adat szemlélteti. Ezenkívül kiválasztottuk a mitokondriális kontigokat a pióca mitokondriális genomjának összeállításához .

Az eukarióta kontigok páros olvasások felhasználásával állványozási eljáráson estek át. A scaffoldokat Illumina párosított végű és párosított olvasási adathalmazok felhasználásával generáltuk SSPACE segítségével. A scaffolding után az összeállítás 14 042 szekvenciából állt, amelyek N50 scaffold hossza 98 kb volt (4. és 5. kiegészítő táblázat). A pióca genom hossza a becslések szerint 220-225 Mb. Az összerakott genomtervezet teljes hossza 187,5 Mbp, ami a pióca genom elméleti méretének 85%-ának felel meg (lásd a 6. kiegészítő táblázatot). Összesen 14 596 fehérjéket kódoló gént jósoltunk.

Az ismert véralvadásgátlókat vagy vérliszthez kapcsolódó fehérjéket kódoló gének új homológjait is azonosítottuk. Az egyes fehérjecsaládok többszörös aminosav-illesztéseit (1., 2. kiegészítő ábra) A genomszekvencia-adatok alapján és az ismert fehérjeszekvenciák felhasználásával meghatároztuk e gének szerveződését (7. kiegészítő táblázat, 1b. ábra). Az exonok és intronok pozícióit és hosszát a megfelelő cDNS- és fehérjeszekvenciák referenciaként való felhasználásával jósoltuk meg. Egyes esetekben a gének közös scaffoldokban lokalizálódnak, és tandemeket vagy klasztereket alkotnak 1b. ábra.

mRNS-seq, transzkriptom összeállítás és annotáció

Három gyógypióca faj, a H. medicinalis, a H. verbаna és a H. orientalis szövetspecifikus mRNS-mintáinak kinyeréséhez az elülső testrészek krioszekciójából lézeres mikrodissectióval izoláltunk nyálsejteket és izmokat (2a. ábra). Ezután minden egyes mRNS-mintához két cDNS-könyvtárat készítettünk normalizálással és normalizálás nélkül oligo-dT primerrel, és szekvenáltuk őket az Ion Torrent PGM-en (8. kiegészítő táblázat). A konstruált cDNS-könyvtáraknak megfelelő négy olvasási adatkészletet használtuk fel az egyes gyógypióca fajok kombinált transzkriptomjának de novo összeállításához a Trinity RNS-asszembler segítségével (9. kiegészítő táblázat). A kombinált transzkriptomokat a nem normált szövetspecifikus leolvasások feltérképezésére használtuk. A leolvasások feltérképezése szükséges volt az egymást követő differenciális expressziós elemzés elvégzéséhez.

A detektált transzkriptek GO (Gene Ontology) elemzését a Blast2GO és a BlastX segítségével végeztük. Referenciaadatbázisként az “nr” adatbázis szolgált. A GO-elemzés azt mutatta, hogy mindhárom orvosi piócafajnál hasonló volt a transzkriptek eloszlása a GO-kategóriák között (3. kiegészítő ábra). A legközelebbi BlastX találatok taxonómiai eloszlása is hasonló volt (4. kiegészítő ábra). Az azonosított transzkriptek többsége két Annelida fajhoz illeszkedett: 59,8%-ban a H. robusta-hoz és 10,7%-ban a C. teleta-hoz. Ez az elemzés azt is megerősítette, hogy a nem póréhagymás transzkriptumok nem kontamináltak.

A kódoló régiók (vagy nyitott olvasókeretek, ORF-ek) előrejelzését és a transzkriptomikai adatok annotálását a Transdecoder és a Trinotate segítségével végeztük. Az ORF-eket a BlastP algoritmus segítségével fordítottuk le, a fehérjeszekvenciákat pedig az EuKaryotic Orthologous Groups (KOG) osztályozással annotáltuk az eggNOG adatbázis segítségével (5. kiegészítő ábra). A KOG-osztályozás kimutatta, hogy mindhárom orvosi piócafajnak hasonló a transzkriptek eloszlása a KOG-kategóriák között. Mindhárom orvosi piócafajról azt is megállapítottuk, hogy az ortológ klaszterek túlnyomó többsége közös (6. kiegészítő ábra).

Differenciális expressziós elemzés

A nyálsejtekben és az izmokban azonosított transzkriptumok relatív expressziós szintjének becsléséhez, valamint a nyálsejtekre jellemző egyedi transzkriptumok azonosításához a szövetspecifikus cDNS-leolvasásokat normalizálás nélkül térképeztük fel az egyes orvosi piócafajok kombinált transzkriptomjával szemben. A H. medicinalis szövetspecifikus cDNS-olvasatait a H. medicinalis genom-összeállításával szemben is leképeztük. A differenciálisan expresszálódó géneket egy nemrégiben kidolgozott protokoll szerint detektáltuk. A nyálsejtekben és az izmokban differenciálisan expresszálódó gének azonosításához minden egyes gyógypióca fajhoz egyedi MA-diagramot készítettünk a kombinált transzkriptomot felhasználva (2b. ábra, 7. kiegészítő ábra). A H. medicinalis esetében egy további MA-diagramot készítettünk a genom-összeállítás felhasználásával (2c. ábra). Azokat a géneket, amelyek q-értéke (FDR) < 0,05 volt, differenciálisan expresszáltnak tekintettük.

A H. medicinalis, H. orientalis és H. verbana nyálsejtjeiben 102, 174 és 72 differenciálisan expresszált transzkriptet azonosítottunk. Mivel a három közeli rokonságban álló orvosi piócafaj, a differenciálisan expresszált transzkriptek fehérjeszekvenciáit ortológ klaszterekbe csoportosítottuk a későbbi funkcionális elemzés egyszerűsítése érdekében. Azonosítottunk 25 differenciálisan expresszált, ortológ klasztert, amelyeken három piócafaj osztozik, és 44 ortológ klasztert, amelyeken legalább két piócafaj osztozik (3. ábra, 10-11. kiegészítő táblázatok). Az azonosított ortológ klaszterek szekvenciáinak többsége a H. robusta genomjában jegyzett hipotetikus fehérjéknek felel meg. Az azonosított ortológ klaszterekben található konzervált domének elemzése lehetővé tette az ismert fehérjecsaládokhoz tartozó szekvenciák meghatározását.

A H. medicinalis differenciálisan expresszált génjeit is elemeztük a genom-összeállítás segítségével. A nyálsejtek, az izmok és az idegszövet cDNS-olvasatait (az olvasatokat a Sequence Read Archive-ból (SRA) nyertük) leképeztük a genom-összeállításra. Az idegszövet esetében a ganglion 2 olvasási adathalmazt használtuk, mivel az a preorális szegmensekben lokalizálódott. A differenciális expressziós elemzés 42 gént azonosított, amelyek csak a H. medicinalis nyálsejtjeire jellemzőek (12. kiegészítő táblázat).

A nyálsejtek szekréciójának proteomikája

A proteomikai elemzéshez három gyógypióca faj, a H. medicinalis, a H. orientalis és a H. verbana SCS-eit gyűjtöttük, amelyeket legalább 2 hónapig táplálkozás nélkül tartottunk. Az SCS-eket egy korábban ismertetett módszer szerint gyűjtöttük, némi módosítással (lásd Módszerek).

A mintaelőkészítési módszer kritikus az azonosított fehérjék eredő repertoárja szempontjából, mivel az SCS kis és nagy molekulatömegű komponensekből áll, és tartalmaz proteináz inhibitorokat, glikoprotein komplexeket és lipideket. Az utóbbiak komplexeket képezhetnek a fehérjékkel . Ezért több mintaelőkészítési módszert és több tömegspektrometriás technikát kombináltunk, hogy az SCS fehérjék legszélesebb repertoárját lefedjük. A különböző mintaelőkészítési módszerekkel és tömegspektrometriás technikákkal nyert proteomikai adatkészleteket kombináltuk, hogy létrehozzuk az egyes gyógypiócafajok azonosított fehérjéinek végleges listáját.

A H. medicinalis, H. orientalis és H. verbana SCS-ében 189, 86, 344 fehérjét azonosítottunk, és a fentiek szerint ortológ klaszterekbe csoportosítottuk őket. Mindhárom gyógypióca faj 39 ortológ klaszteren osztozott, és 50 ortológ klaszteren legalább két faj osztozott (3. ábra, 13. kiegészítő táblázat). A transzkriptomikai és proteomikai adatok kombinációja a nyálsejtekben egyedileg kifejeződő gének 25 ortológ klasztert mutatott ki (11. kiegészítő táblázat). A pióca SCS egyes komponenseinek listáját a 3. ábra tartalmazza. Meglepő módon az ismert SCS antikoagulánsokat és a vérliszthez kapcsolódó fehérjéket kódoló gének nem mutattak eltérő expressziót a nyálsejtek és az izmok között. Ennek a megállapításnak a validálása érdekében megvizsgáltuk a saratin, az eglin C, a bdellinek, a hirustasin, a destabiláz, a metallokarboxi-peptidáz inhibitor, az apiráz és az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) expresszióját a nyálsejtekhez és az izmokhoz készített további, független, szövetspecifikus cDNS-könyvtárak valós idejű PCR segítségével. A hirudinra és a destabilázra vonatkozó valós idejű PCR-eredmények (8. kiegészítő ábra) megerősítették ezt a megállapítást. Ez arra utal, hogy az antikoagulánsokat és a vérzéscsillapítással kapcsolatos fehérjéket kódoló gének nemcsak a vértáplálásban vesznek részt, hanem más, eddig ismeretlen élettani funkciókhoz is hozzájárulnak.

A következőkben a funkcionális csoportokba sorolt SCS komponenseket jellemezzük, és leírjuk lehetséges szerepüket a vérzéscsillapításban. A fehérjék szekvenciáit és igazodásukat a 9-24. kiegészítő ábrák mutatják be.

Enzimek

Proteázok

A tanulmány eredményei azt mutatják, hogy az M12, M13 és M28 családba tartozó metalloproteázok az SCS fő enzimatikus komponensei. Az M12B (ADAM/reproliszin) peptidázok a dezintegrinszerű metalloproteinázok nagy családja, amelyek széles körű funkciókkal rendelkeznek és számos élettani folyamatban vesznek részt . Ezek az enzimek gyakran megtalálhatók a kígyóméregben, míg a transzkriptumok különböző vérszívó fajok szialotranszkriptomjaiban figyelhetők meg . A hemosztázisban az М12 családba tartozó szekretált proteázok részt vehetnek a vérlemezkék adhéziójának gátlásában és a fibrinogén lebontása révén a vérrögök lágyulásában. Ezek a fehérjék fémfüggő proteolitikus aktivitást mutatnak az extracelluláris mátrix fehérjékkel (zselatin, fibrinogén, fibronektin) szemben, ezáltal befolyásolják a gyulladás és az immunválaszok szabályozását.

Az emlősökben az M13 család proteázai részt vesznek a szív- és érrendszer kialakulásában és fejlődésében, valamint a neuropeptidek szabályozásában a központi idegrendszerben . Egyik legfontosabb funkciójuk a biológiailag aktív peptidek, különösen a vérnyomás szabályozásában részt vevő peptidek (angiotenzin és bradikinin) aktiválása. Emlősökben az ACE a renin-angiotenzin rendszer (RAS) fontos összetevője. Az ACE kifejeződik a pióca (Theromyzon tessulatum), a kúpcsiga (Conidae), a vámpírcsiga (Colubraria reticulata) és a kétszárnyúak (Diptera) szialotranszkriptomjában .

Az M28 család exopeptidázainak azonosított szekvenciái a Q-típusú karboxi-peptidázokhoz tartoznak, amelyeket lizoszomális dipeptidázoknak vagy plazma glutamát-karboxi-peptidáznak (PGCP) is neveznek. Ezekről a peptidázokról kimutatták, hogy részt vesznek a szekretált peptidek metabolizmusának szabályozásában a vérplazmában és a központi idegrendszerben emlősökben . Úgy tűnik, hogy ezek az enzimek bizonyos jelző peptidek inaktiválására szolgálnak a vérben, és a hematofág paraziták hemoglobinolitikus rendszereinek összetevői, az emésztő exopeptidázok szerepét betöltve . Figyelemre méltó, hogy a piócák nyálmirigy-szekréciója karboxi-peptidáz inhibitorokat tartalmaz, amelyek feltehetően megakadályozzák a vérliszt más típusú peptidázok általi idő előtti megemésztését .

Szuperoxid-dizmutáz (EC 1.15.1.1)

A szekretált szuperoxid-dizmutáz család (SODC, Cu/Zn típusú) enzimek szekvenciáit azonosítottuk. Ez a fémfehérje család elsősorban eukariótákra jellemző, és a szabad gyökök inaktiválásában vesz részt, ami lassítja az oxidatív folyamatokat. A vérben a szuperoxid-dizmutáz katalizálja a szuperoxid átalakulását molekuláris oxigénné és hidrogén-peroxiddá, és megakadályozza a peroxinitrit és a hidroxilgyök képződését. Érdekes módon a peroxinitrit a kulcsfontosságú prokoagulánsok nitrálásával elnyomhatja a vérzéscsillapító funkciót , míg a hidrogén-peroxid számos folyamat (alvadás, trombózis, fibrinolízis, angiogenezis és proliferáció) szabályozásában részt vevő kulcsfontosságú jelzőmolekula. A kullancsokban a SODC feltehetően részt vesz a bélrendszer baktériumok, köztük a betegségek kórokozói által történő kolonizációjának szabályozásában . Az SCS-ekben a SODC a jelek szerint antibakteriális hatást fejt ki a veleszületett immunrendszer más fehérjéivel együtt, és megakadályozza a táplálkozás és az emésztés során a vér nem kívánt oxidációját. Nevezetesen a hemtartalmú vegyületek és a szabad vas részt vesznek a szabad gyökök képződésében és az oxidatív stressz kiváltásában .

Karbonátanhidráz (EC 4.2.1.1)

Ez az enzim a bikarbonát pufferrendszer kulcsfontosságú összetevője és részt vesz a vér, az emésztőrendszer és más szövetek pH értékének szabályozásában . Hematofág állatokban ez az enzim képes fenntartani az optimális feltételeket a véres étkezés emésztéséhez . Úgy tűnik, hogy a karbon anhidráz a harapás helyén a savasodás helyi növekedését okozza, csökkentve a véralvadási faktorok aktivitását.

Hyaluronidáz (EC 3.2.1.35)

Ezek az enzimek gyakoriak a hematofág és mérges állatok proteomikai és transzkriptomikai adataiban. A különböző piócafajok nyálváladékairól ismert, hogy tartalmaznak hialuronidázt (heparináz, orgeláz) . A proteomban és a transzkriptomban három olyan klasztert találtunk, amelyek a 79-es glikozil-hidroláz család (O-glikozil-hidrolázok) doménjét tartalmazzák. Ebbe a családba tartoznak a heparinázok, amelyek fontos szerepet játszanak a kötőszövetekben. A mérgekben és a nyálmirigyek váladékában ezek az enzimek katalizálják a hialuronsav hidrolízisét, ami az extracelluláris mátrix szerkezeti integritásának elvesztését eredményezi, és ezáltal megkönnyíti az antikoagulánsok és más aktív molekulák mélyebbre történő behatolását a szövetekbe . Ezenkívül a heparináz által termelt kis molekulatömegű heparin hasítása elnyomja és gátolja a véralvadást .

Apiráz (EC 3.6.1.5)

Apirázok olyan nukleotidázok, amelyek részt vesznek az ATP és az ADP enzimatikus lebontásában AMP-re. A szekretált apirázok és 5′-nukleázok jól ismert és jól jellemzett összetevői a mérges és vérszívó állatok, köztük a piócák nyálmirigy-szekréciójának . Az apirázok véralvadásgátlók, mivel eltávolítják az ADP-t, amely a vérlemezkék aggregációjának fontos induktora a szöveti sérülések helyén .

Adenozin/AMP deamináz (EC:3.5.4.4)

katalizálja az adenozin hidrolitikus deaminálását inozinná. Az adenozin-deaminázok jól tanulmányozottak, és különböző vérszívó rovarok nyálában találták meg őket . Az ADA megtalálható a Spiralia családba tartozó vámpírcsiga C. reticulata, valamint a piócák nyálmirigyének váladékában is . Úgy gondolják, hogy az ADA fontos szerepet játszik az adenozin eltávolításában, mivel részt vesz a fájdalomérzékelési folyamatokban .

Proteináz inhibitorok

Antistasinok

A proteináz inhibitor I15-nek (pióca antistasin) megfelelő szekvenciákat azonosítottunk 4. ábra. Az ebbe a családba tartozó fehérjék gyakran előfordulnak a vérszívó piócákban, és kulcsszerepet játszanak a véralvadás gátlásában. Fő célpontjaik a vérzéscsillapításban részt vevő szerin proteázok, mint például a Xa faktor, a kallikrein, a plazmin és a trombin . A Haementeria ghilianii-ből származó Ghilanten antistasinról kimutatták, hogy gátolja a vérlemezkék aggregációját , és az óriás amazonasi piócából (Hementaria ghilianii) származó gigastasinról nemrégiben jelentették, hogy hatékonyan gátolja a C1 komplementet . A Hementeria officinalisból származó antistasin a vizsgálatunkban azonosított szekvenciák legközelebbi homológja.

CAP/CRISP

A ciszteinben gazdag szekréciós fehérje/antigén 5/pathogenezissel kapcsolatos 1 fehérjék (CAP) szupercsaládjába számos fehérjecsalád tartozik, különösen a ciszteinben gazdag szekréciós fehérje (CRISP) 5a ábra. Ezek gyakran megtalálhatók a kígyók és más hüllők mérgében, és legtöbbjük toxin . Egyes vizsgálatok szerint a vérszívó fajokból származó CRISP-ekről úgy gondolták, hogy részt vesznek a vérzéscsillapításban (HP1). Az azonosított szekvenciák hasonlóságot mutatnak a vérszívó parazita fonálféreg Ancylostoma caninum (horogféreg) fehérjeszekvenciáival, mint például a káliumcsatorna blokkoló AcK1 és a lehetséges vérlemezkeaggregáció-gátló HPI , valamint a kígyótoxinok triflin (Protobothrops flavoviridis) és natrin-1 (Naja atra) . A differenciálisan expresszálódó gének között új “Cys-gazdag” motívummal rendelkező szekvenciákat azonosítottunk (5b. ábra). A fehérjéknek ezt a csoportját egy szignálpeptid és két CX {5,14} cisztein-mintázat jelenléte jellemzi. CX {7} CX {8} СС {2} С és CX {7,17} CX {9} CX {8} СС {2} С.

Eglin-like

Az eglinek kis ciszteinmentes fehérjék, amelyek a szerinproteináz-inhibitorok I13 családjába tartoznak . A piócákból származó eglinek gátló hatással rendelkeznek a neutrofil elasztázokkal és a G kathepszinekkel szemben, valamint részt vesznek a termés tartalmának idő előtti proteolízissel szembeni védelmében . Megjegyzendő, hogy a jelen tanulmányban azonosított szekvenciák alacsony homológiát mutatnak a piócák klasszikus eglinjével (6a. ábra).

Cystatin

Cystatin szekvenciát csak a H. verbana proteomjában azonosítottunk. A cisztatinok a cisztein proteázok (kathepszin B, H, C, L, S) kis fehérjék gátlói, és gyakran megtalálhatók különböző kullancsok szialotranszkriptomjában . A kullancsokban a cisztatinok fontos szerepet játszanak az immunválaszhoz, a vér emésztésében részt vevő endogén cisztein-proteázok szabályozásához és a hem méregtelenítéshez kapcsolódó folyamatokban . A Nippostrongylus brasiliensis fonálféreg cisztatinokat használ a gazdaszervezet immunrendszerének kijátszására .

PAN domén

Ez a domén számos fehérjében jelen van, beleértve a vérfehérjéket, a plazminogént és a XI. véralvadási faktort . A plazma prekallikrein PAN/apple doménje ismert, hogy közvetíti a nagy molekulatömegű kininogénhez való kötődését, és a XI faktor PAN/apple doménje kötődik a XIIa és IX faktorokhoz, vérlemezkékhez, kininogénhez és heparinhoz . A H. officinalis pióca nyálmirigy-szekréciójáról kiderült, hogy tartalmazza a pióca trombocitaellenes fehérjét (LAPP), amely PAN doménnel rendelkezik, és részt vesz a vérzéscsillapításban. Ez a fehérje affinitást mutat az I, III és IV kollagénekhez, és ezáltal gátolja a kollagén által közvetített trombocita adhéziót .

Alfa-2-macroglobulin (α2M)

A rendkívül konzervált, multifunkcionális α2M részt vesz a proteázok széles körének (szerin-, cisztein-, aszparagin- és metalloproteázok) gátlásában, kölcsönhatásba lép a citokinekkel és hormonokkal, és szerepet játszik a cink- és réz kelátában . Működhet plazmininhibitorként, ezáltal gátolja a fibrinolízist, de bizonyos esetekben a trombin és a kallikrein inaktiválásával gátolja a véralvadást . Úgy gondolják, hogy ez a fehérje nemcsak a piócák immunfolyamataiban vesz részt, hanem a nyálmirigy szekréciójának fontos összetevője is, amely fokozza az antikoagulációs folyamatokat.

Az adhézióban részt vevő molekulák

Fikolin

A fikolinok a veleszületett immunrendszer egyik összetevője és a komplement aktiváció lektin-függő útvonalát váltják ki . A gerinctelenekben a fikolinok részt vesznek a bakteriális sejtfal komponensek felismerésében . A fibrinogén-szerű domén jelen van az eritrocitákhoz affinitással rendelkező fehérjékben, pl. a tachylectin-5A (TL5A) . A TL5A erős haemagglutináló és antibakteriális aktivitást mutat Ca2+ ionok jelenlétében . Hüllőméregben a fikolin-szerű fehérjék, a ryncolin (a Cerberus rynchopsból) és a veficolin-1 (UniProt: E2IYB3) (a Varanus komodoensisből) feltehetően trombocita-aggregációt és véralvadást váltanak ki.

F5/8 típusú C domén

Számos azonosított szekvencia tartalmaz egy vagy több diszkoidin motívumot (DS), az úgynevezett F5/8 típusú C domént. Ez a domén számos transzmembrán és extracelluláris fehérjében, pl. neuropilinekben, neurexin IV-ben és diszkoidin domén receptor fehérjékben, valamint a vérzéscsillapításban részt vevő fehérjékben, például az V. és VIII. véralvadási faktorokban van jelen . A DS-domén fontos szerepet játszik a különböző ligandum molekulák, köztük foszfolipidek és szénhidrátok kötésében . E tulajdonságaiknak köszönhetően a DS-tartalmú fehérjék aktívan részt vesznek a sejtadhézióban, a migrációban, a proliferációban és a jelátviteli kaszkádok aktiválásában . Úgy tűnik, hogy a pióca DS-domén-tartalmú fehérjék galaktózhoz nagy affinitással rendelkező lektinekként viselkednek, és a pióca veleszületett immunrendszerének összetevői lehetnek. Ezenkívül képesek a vérlemezkék és az endothelium felszínén lévő kollagénhez vagy foszfatidil-szerinhez kötődni, és így kompetitív gátlás révén károsítják a vérzéscsillapító faktorok közötti kölcsönhatásokat.

A kis sűrűségű lipoprotein receptor a család

A kis sűrűségű lipoprotein receptor (LDLR) család a vérplazma fontos összetevője, és részt vesz az emlősök vérében lévő kis sűrűségű lipoproteinek felismerésében és endocitózisában . Az ismert homológ fehérjékkel ellentétben ezek a receptorok inkább szekréciós, mint membránfehérjék, és négy LDLR A osztályú (ciszteinben gazdag) ismétlődést tartalmaznak. Egyes gerinctelen állatokról, köztük a szegletes férgekről feltételezik, hogy képtelenek a koleszterin és a szteroid hormonok szintézisére, és a táplálkozás során a piócák a koleszterint elsősorban a gazdatest véréből, mint exogén forrásból szerzik be . Feltételezzük, hogy ezt a fehérjét a pióca a koleszterinben gazdag lipoproteinkomplexek elkapására és szállítására használhatja.

R-típusú lektin

Prokariótákban és eukariótákban találtak olyan fehérjéket, amelyek a ricin-típusú béta-törpe lektin domént tartalmazzák. Az állatokban az R-típusú lektinek változatos aktivitást mutatnak . Jelen vannak a scavenger receptorokban (mannóz, fukóz, kollagén receptorok), N-acetilgalaktozaminitranszferázokban, hemolitikus toxinokban (CEL-III a Cucumaria echinatából) és apoptózist indukáló citotoxinokban . Korábban hasonló szekvenciákat azonosítottak a pióca transzkriptomokban; a szerzők azonban feltételezték, hogy ez a molekula mitokondriális lokalizációval rendelkezik . Egy másik figyelemre méltó közeli homológ a földigiliszta Lumbricus terrestris galaktózkötő lektinje, az EW29 . Az EW29 két homológ doménből áll, és kísérletileg kimutatták, hogy hemagglutináló aktivitást mutat . Mivel számos ismert R-típusú lektin részt vesz az adhézióban és kiváltja a hemolízist , ez a molekula további tanulmányozásra érdemes.

vWFA domén

Ez a domén különböző plazmafehérjékben van jelen: komplement faktorok, integrinek és kollagének VI, VII, XII és XIV . A pióca proteomban azonosított egyik fehérje egy szekretált fehérje, amely a vWFA domén négy példányából áll 7. ábra. A szekvencia több feltételezett felismerési helyet tartalmaz: a fémion-függő adhéziós helyet (MIDAS), az integrin-kollagén kötőhelyet és a glikoprotein Ib (GpIb) kötőhelyet. A BlastX elemzés szerint ez a domén homológ a VI. típusú kollagénnel. Figyelembe véve a fehérje doménszerveződését, valamint a glikoprotein- és kollagénkötő helyek jelenlétét, az egyik feltételezett hatásmechanizmus az endotél vagy a vérlemezkék felszínéhez való kötődés, ezáltal a kollagénnel való kölcsönhatás megakadályozása. Ez a kötődés áll a vérzéscsillapítás során fellépő kompetitív gátlás (thrombocyta scavenging) hátterében .

.