NS2B-NS3 protease

A célfehérje háromdimenziós szerkezetének (3D) adatai a gyógyszerkutatás elsődleges követelményének számítanak. Mind a röntgenkrisztallográfiás szerkezeteket, mind a célfehérjékre generált homológia modelleket használták a potenciális ligandumok azonosítására a kémiai adatbázisokból, de a 3D kristallográfiás szerkezetek dokumentáltan hatékonyabbak, mint az in silico generált homológia modellek. Ezért a DENV NS2B-NS3 proteáz 3D szerkezetét, amelyet a DENV-fertőzés elleni fő terápiás célpontként javasoltak, a fehérjeadatbankból (PDB) a PDB ID:2FOM40 azonosítóval kerestük. Az NS2B-NS3pro kristályszerkezetét 1,5 Å felbontással oldották fel, és két fehérjeláncot mutatott, azaz az NS2B kofaktort alkotó A láncot és az NS3pro domént tartalmazó B láncot (2a. ábra). Itt a B láncban lévő proteázdomént (NS3pro) (2b. ábra) választottuk ki a G. lucidumból származó kiválasztott triterpenoidokkal végzett szerkezetalapú virtuális szűréshez.

3D szerkezet a DENV NS2B-NS3 proteázról: (a) a két fehérjelánc szalagdiagramja; az A lánc (zöld szín) az NS2B kofaktort, a B lánc (piros szín) pedig az NS3pro domént ábrázolja, és (b) a DENV-proteáz NS3pro domén grafikus ábrázolása az aminosavmaradványok teljes számával, atomokkal, nehézatomokkal és nettó töltéssel, valamint az előre jelzett másodlagos szerkezeti elemekkel (cső = alfa-helix, nyilak = béta-lapok) jelölve.

Virtuális szűrés és dokkoló szimulációs elemzés

A közelmúltban a szerkezetalapú virtuális szűrés egyre népszerűbbé vált a nagy bioaktív kémiai könyvtárakból kiválasztott célpontokkal szemben új vezető vegyületek felfedezésére. Ez a megközelítés magában foglalja a ligandumok szimulált dokkolását a kiválasztott receptor aktív helyének régiójában, majd az inhibitorok rangsorolását és pontozását23. Ebben a munkában a G. lucidumból származó 22 ismert antivirális triterpenoid szerkezetalapú virtuális szűrését végeztük el NS3pro ellen a Schrodinger suite Glide moduljának segítségével (S1. táblázat). Ezeket az inhibitorokat tovább elemeztük a Glide modul XP dokkolási protokolljával, hogy információt gyűjtsünk a kötési energiáról, valamint az aktív centrum maradékaihoz való további kötési mintázatokról. Megfigyelhető volt, hogy a kiválasztott triterpenoidok mindegyike jelentős kötési affinitást mutatott az NS2B-NS3pro-val szemben, kivéve a Ganoderinsav G-t (S1. táblázat). Az 1,8-dihidroxi-4,5-dinitroantrakinon referencia-inhibitor molekuláris dokkolása ugyanezen aktív helyhez -5,377 kcal/mol dokkolási pontszámot eredményezett. Ezért a -5 kcal/mol küszöbértéknél jobb dokkolási pontszámmal rendelkező triterpenoidokat választottuk ki a molekuláris kölcsönhatás elemzéséhez. Összesen négy triterpenoidot, azaz a Ganodermanontriolt (-6,291 kcal/mol), a Lucidumol A-t (-5,993 kcal/mol), a Ganoderinsav C2-t (-5,948 kcal/mol) és a Ganosporerinsav A-t (-5,830 kcal/mol) választottuk ki a DENV-proteáz NS3pro doménjének lehetséges inhibitoraként. Ezek a dokkolási pontszámok jelentősnek minősültek az ismert 1,8-dihidroxi-4,5-dinitroantrakinon (-5,377 kcal/mol) inhibitorhoz és az Azadirachta indicából származó Nimbin (-5,56 kcal/mol), Desacetylnimbin (-5,24 kcal/mol) és Desacetylsalannin (-3,43 kcal/mol) bioaktív molekulákhoz képest a DENV NS3pro-val41. Ezek az eredmények a G. lucidumból származó bioaktív triterpenoidok DENV-proteáz gátlóként való potenciáljára utalnak, és azt sugallják, hogy felhasználhatók a DENV-fertőzés elleni vírusellenes gyógyszerek kifejlesztésében.

Molekuláris kölcsönhatás és MM/GBSA elemzés

Mivel a fehérje-ligandum dokkolt komplexek molekuláris kapcsolatai a biológiai rendszerek molekuláris mechanizmusainak jobb megértéséhez vezethetnek42, a kiválasztott triterpenoidok és referencia inhibitor DENV-proteázzal való molekuláris kapcsolatprofilozását is vizsgáltuk. Az NS3pro-Ganodermanontriol komplex az aktív régióban Lys73 (3 Å), Thr120 (2,94 Å) és Asn167 (3,26 Å, 2,86 Å) maradékokkal mérsékelt egyszerű és kettős hidrogénkötésekkel mutatott kölcsönhatást. Az NS3pro-Ganodermanontriol komplexen belül további hidrofób vonzásokat regisztráltak a Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 és Ala164 maradékoknál. A His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 és Gly153 maradékok is poláris, illetve glicin kölcsönhatást mutattak a Ganodermanontriollal. Eközben az NS3pro-Ganodermanontriol dokkolt komplexben pozitív (Lys73 és Lys74) és negatív töltésű kölcsönhatásokat (Asp75) is rögzítettünk a maradékokkal (3a,b ábra).

3D és 2D dokkolt komplexek az NS3pro doménről, amelyek intermolekuláris kapcsolatokat mutatnak a megfelelő szűrt triterpenoidokkal; (a,b) NS3pro-Ganodermanontriol komplex, (c,d) NS3pro-Lucidumol A komplex, (e,f) NS3pro-Ganoderinsav C2 (g,h) NS3pro-Ganosporerinsav A. A 2D komplexekben a zöld, lila, piros, kék és szürke színű maradékok a hidrofób, pozitív, negatív, poláris és glicin kölcsönhatást jelzik, a rózsaszín nyilak pedig a hidrogénkötés kialakulását.

Az NS3pro-Lucidumol A kölcsönhatási profiljai az Asp75 (3,31 Å) és Asn152 (2,48 Å) maradékokkal kialakult két egyszeres hidrogénkötést és a Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å) maradékkal kialakult kettős hidrogénkötés képződését tükrözték, amely szintén hozzájárul a Gly151 maradékkal való glicin kölcsönhatáshoz. Ezenkívül hidrofób (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 és Tyr161) és poláris kölcsönhatásokat (His51, Ser135 és Asn152) is regisztráltak a dokkolt komplexben. Az Asp75 negatív töltésű kölcsönhatásokat mutat a proteáz aktív zsebében a Lucidumol A-val (3c,d ábra). Az NS3pro-val komplexbe dokkolt Ganoderinsav C2 szintén mérsékelt kettős hidrogénkötés kialakulását mutatta a Gly151-gyel (2,73 Å, 3,12 Å), míg a Trp50 (2,66 Å) és Arg54 (1,93 Å) maradékoknál egyszerű hidrogénkötés kialakulása volt megfigyelhető. Ezen túlmenően a komplexben a Ganoderinsav C2 hidroxilcsoportja és a proteáz Arg54 maradványa között sóhíd képződést is észleltünk. Ezenkívül poláris (His51 és Asn152 maradék), negatív (Asp75 maradék) és pozitív (Arg54 maradék) kölcsönhatásokat is rögzítettünk az NS3pro-Ganodérsav C2 dokkolóban (3e,f ábra). Az NS3pro-Ganoderinsav A dokkolt komplexben a Thr120, Asn152 és Asn167 maradékoknál három egyszeres hidrogénkötés alakult ki, míg a Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 és Ala164 maradékoknál hidrofób kölcsönhatásokat mutattak (3g,h ábra). Továbbá, a dokkolt NS3pro a Ganosporeric acid A-val poláris (Thr118,Asn119,Thr120, Asn152 és Asn167 maradékok), pozitív (Lys73 és Lys74) és negatív töltésű kölcsönhatásokat (Asp75) mutatott.

Az NS3pro proteáz aktív helyére egy referencia inhibitor, az 1,8-dihidroxi-4,5-dinitroantrakinon is dokkolt, és jelentős kölcsönhatásokat regisztráltak. Ez a komplex egyszeres hidrogénkötés kialakulását mutatja a Phe130 maradéknál, míg a His51-nél sóhíd és pi-pi kölcsönhatást észleltek az inhibitorral. Ezenkívül hidrofób (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 és Tyr151), poláris (His51, Ser131 és Ser135) és glicin (Gly151 és Gly153) kölcsönhatásokat is észleltünk a dokkolt komplexben.

Azt a következtetést vontuk le, hogy az összes átvizsgált triterpenoid hidrogénkötést mutatott az NS3pro-val a katalitikus triádnál (His51, Asp75 és Ser135 maradék), valamint néhány más konzervált maradéknál (Phe130, Tyr150, Asn152 és Gly153), amelyek a jelentések szerint jelentős szerepet játszanak a DENV-proteáz szubsztrátkötésében43,44. Emellett néhány további maradékot is naplóztak, amelyek hidrogénkötéseket osztanak meg a különböző ligandumokkal. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a ligandum és az NS3pro katalitikus triád egyik maradékának hidrogénkötései megzavarhatják az Asp75 és His51 maradékok karboxil- és imidazolcsoportjai közötti elektronátvitelt. Az ilyen zavar a beszámolók szerint a Ser135 maradék hidroxilcsoportjának (ß-OH) meghiúsult nukleofil támadásához vezet, amely nélkülözhetetlen a proteolitikus aktivitás beindításához43,44. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a vizsgált triterpenoidok különböző intermolekuláris kölcsönhatásokon keresztül erős affinitást mutathatnak a DENV NS3pro doménjéhez, és azt sugallták, hogy az NS2B-NS3pro gátlásán keresztül gyógyszerként működhetnek a DENV-fertőzés ellen.

Továbbá mind a négy triterpenoid, a Ganodermanontriol, a Lucidumol A, a Ganoderinsav C2 és a Ganosporeric acid A DENV NS3pro-val dokkolt komplexeit MM/GBSA számítások segítségével is elemezték, hogy kiszámítsák a megfelelő ligandumok kötési affinitását az aktív központban. Ezek a számítások viszonylag negatív MM/GBSA értékeket mutattak mind a négy dokkolt komplex esetében, azaz NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Ganoderinsav C2 (-19.039 kcal/mol) és NS3pro-Ganoszporerinsav A (-11,449 kcal/mol), míg a referencia inhibitor komplex NS3pro-1,8-Dihidroxi-4,5-dinitroantrakinon nagyobb értéket produkált (-38,934 kcal/mol). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a kiválasztott triterpenoidok gátló aktivitása az NS3pro-val szemben gyengébb lehet, mint a referencia inhibitoré, ugyanakkor azt is sugallták, hogy a Ganodermanontriol erősebb kötési affinitását az NS3pro-hoz a többi triterpenoidhoz képest a prediktált dokkolási pontszámok is alátámasztották. Ezenkívül a kiválasztott triterpenoidok és a pozitív kontroll DENV NS3pro fehérjével komplexált komplexekre vonatkozó ΔG-értékek és fizikai-kémiai komponensek, azaz ΔGBind Coulomb, ΔGBind kovalens, ΔGBind vdW (van der Waals-erők), ΔGBind Solv SA (oldószerrel hozzáférhető felület) és ΔGBind Solv GB (szolvatációs energia általánosított Born) elemzése azt mutatja, hogy, a ligandumtól függően a ΔGBind Coulomb és/vagy ΔGBind vdW járult hozzá leginkább a DENV NS3pro fehérjével alkotott triterpenoid és referencia inhibitor komplexek stabilitásához. (4. ábra, S2, S2. táblázat). Ezért a DENV NS3pro fehérjéhez a legígéretesebb funkcionális triterpenoidként a ganodermanontriolra következtettünk, és a többi triterpenoiddal együtt tovább elemeztük molekuladinamikai és in vitro elemzéssel.

A MMGBSA módszerrel számított szabad kötési energia (kcal/mol) a vizsgált triterpenoidokra, ill. (a) Ganodermanontriol, (b) Lucidumol A, (c) Ganoderinsav C2 és (d) Ganosporerinsav A DENV NS2B-NS3 proteázzal komplexált molekuláris dokkolási szimulációt követően.

Molekuladinamikai (MD) elemzés

A molekuláris dokkoló megközelítéssel számított cél-ligandumon előre jelzett interakciós információkat molekuladinamikai szimulációval és kristallográfiai vizsgálatokkal38,41 lehet tovább validálni. A továbbiakban a kiválasztott triterpenoid-NS3pro domén komplexek stabilitását 10 ns-os MD-szimulációval értékeltük a négyzetes átlagos eltérés (RMSD), a négyzetes átlagos fluktuáció (RMSF) és a fehérje-ligandum érintkezési térkép elemzése alapján.

A DENV NS3pro mind a négy ligandummal komplexált C-alfa- és gerincatomjainak RMSD-elemzése stabil és elfogadható eltéréseket mutatott a 10 ns-os MD-szimuláció során (5. ábra). Érdekes módon a receptor esetében a végső ingadozást <2 Å RMSD értékkel regisztrálták, míg a Ganodermanontriol inhibitor az NS3pro doménnel alkotott komplexben a szimulációs intervallum végén stabil és 6 Å maximális eltérést mutatott (5a. ábra). A receptor egyes maradékaira és a ligandum atomjaira számított RMSF is tolerálható (2,8 Å-nál kisebb) eltéréseket mutatott a szimulációs intervallum során (S3a, S4a ábra). Ugyanakkor a ligandum ciklopenta-fenanthren-7-on gyűrűjének keto- és metilcsoportjainál is jelentéktelen RMSF-ingadozás volt megfigyelhető 5-7 ns időtartam alatt (ábra. S3a).

RMSD az NS3pro fehérje és a G. triterpenoidok alfa-szénatomjainak szénatomjaira. lucidum mint ligandum, (a) NS3pro-Ganodermanontriol, (b) NS3pro-Lucidumol A, (c) NS3pro-Ganoderic acid C2 és (d) NS3pro-Ganosporeric acid A, az MD-szimulációk 10 ns-os pályáján.

Az NS3pro-Lucidumol A komplex RMSD-elemzése azt mutatta, hogy mind a receptor, mind a ligandum 3 Å-nál kisebb eltéréseket mutatott a 10 ns szimulációs intervallum alatt (5b. ábra). Eközben az RMSF-elemzés mind az NS3pro, mind a Lucidumol A esetében <3 Å eltéréseket jelzett előre, a ligandum heptán régiójának metil- és hidroxilcsoportjában is elfogadható eltéréseket regisztráltak a 10 ns szimulációs intervallum alatt (S3b ábra). Hasonlóképpen, a ligandum az NS3pro-Ganodérsav C2 komplexben elfogadható eltéréseket mutatott a kezdeti 2-5 ns alatt, majd stabilitást, és a végső eltérést kevesebb mint 8 Å-nál regisztrálták a 10 ns szimulációs intervallum alatt (S4b ábra).

Az NS3pro-Ganodérsav C2 komplex szintén jelentéktelen eltéréseket mutatott a receptorban 2-5 ns között, majd stabilitást, a végső eltérést kevesebb mint 1,75 Å-nál regisztrálták a szimulációs intervallum alatt (5c ábra). A ligandum (kevesebb mint 6 Å) és a receptor (3 Å) elfogadható eltéréseit az adott komplexre számított RMSF is alátámasztotta (S3c, S4c ábra).

Még az NS3pro-Ganoszporerinsav A dokkolt komplexben a ligandum szimulációs elemzése kezdetben 6 ns-ig alacsony eltérést mutatott a ligandum kezdeti heptán-részénél elhelyezkedő karboxilcsoportban, majd a 10 ns-os intervallum végéig stabil állapotot ért el 4,6 Å RMSD-nél (5d. ábra). Eközben az NS3pro stabil oszcillációt mutatott 1,6 Å RMSD körül, jelentéktelen eltérésekkel a kezdeti N-terminális régióban (5d. ábra). Ezek a megfigyelések a megfelelő dokkolt komplex stabilitására utaltak, amit a receptor és a ligandum egyes maradékaira (3,5 Å-nál kisebb), illetve atomjaira (3 Å) vonatkozó RMSF-görbék is alátámasztottak (S3d, S4d ábra).

A szimulációs pályagörbékből egy fehérje-ligandum kölcsönhatási térképet is készítettünk, amely leírja az egyes maradékok hozzájárulását a molekulák közötti kötéshez (6. ábra). Az NS3pro-Ganodermanontriol komplex fehérje-ligandum kölcsönhatási térképe a Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 és Asn167 maradékok hidrogénkötéseket, hidrofób vonzásokat, ionos kölcsönhatásokat és vízhidakat képező részvételét mutatta (Ábra. 6a). A Leu149 és Asn152 maradékok kiemelkedő vízhidakkal és hidrogénkötéses vonzásokkal járultak hozzá a 10 ns szimulációs intervallum alatt (6a. ábra). Az Asn152 maradékot is hidrogénkötések kialakítására jósolták a dokkoló komplexben (3a,b ábra), ami azt sugallta, hogy ez a maradék fontos az NS3pro-ban a Ganodermanontriollal való kölcsönhatás szempontjából.

Normált halmozott oszlopdiagram a dokkolt komplexekhez, ill.azaz (a) NS3pro-Gandomanontriol, (b) NS3pro-Lucidumol A, (cc) NS3pro-Ganoderinsav C2 és (d) NS3pro-Ganosporerinsav A az MD-szimuláció során számított különböző kontaktusokkal és kölcsönhatási profilokkal. A kölcsönhatási frakciók >1,0 értékei plauzibilisek, mivel egyes maradékok több, hasonló altípusú kölcsönhatást hoznak létre.

Az NS3pro-Lucidumol A kölcsönhatási térkép a His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154 részvételét mutatta, Val155, Tyr161 és Asn167 maradékok hidrogénkötésekben, hidrofób kölcsönhatásokban és vízhídképzésben, az Asp75 és Gly153 maradékok pedig a legnagyobb mértékben járultak hozzá a vízhídképzéshez és a hidrogénkötés kialakításához (ábra). 6b). A molekuláris dokkoló analízis szintén a Gly153 szerepére utalt a ligandummal való hidrogénkötésben (3c,d ábra), ami jelezte e maradék fontosságát a fehérje-ligandum stabilitásában. Emellett a Tyr161, Asp75 és Leu128 maradékok is jelentős hozzájárulást mutattak a ligandummal való vízközvetített, hidrogénkötéses, illetve hidrofób kölcsönhatásokban (6b. ábra). Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a Gly153, Tyr161, Asp75 és Leu128 kiemelkedően felelősek az NS3pro-Lucidumol A komplex stabil konformációjáért a szimulációs intervallum során.

Eközben az NS3pro-Ganodérsav C2 komplexben a Lys28, Ile36, Trp50, His51, Arg54, Val72, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Ser131, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val155 és Tyr161 maradékok különböző molekuláris kölcsönhatásokhoz járultak hozzá a fehérje-ligandum leképezésben a szimuláció során (6c. ábra). Érdekes módon a legnagyobb intermolekuláris kölcsönhatáshoz az Arg54 járult hozzá hidrogénkötés kialakításán keresztül, amelyet vízhidak és ionos vonzás követett (6c. ábra). Ezt a maradékot a molekuláris dokkolási elemzés is megjósolta, hogy két hidrogénkötést képez a Ganoderinsav C2-vel (3e,f ábra), ami arra utal, hogy kulcsfontosságú tényező a cél-ligandum stabilitásának fenntartásában a szimuláció során.

Az NS3pro-Ganoderinsav A kölcsönhatási profil azt mutatta, hogy a Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 és Asn167 maradékok aktívan hozzájárultak a vízhidak, hidrofób és ionos kölcsönhatásokhoz (Ábra. 6d). A Lys73, Lys74, Val155 és Asn167 maradékok azonban az előrejelzések szerint hidrogénkötéseken keresztül a legnagyobb mértékben járultak hozzá a Ganosporeric acid A ligandummal komplexált NS3pro stabilitásához, amelyet a vízhidak, hidrofób és ionos kölcsönhatások követtek (6d. ábra). Az Asn167-et is megjelölték a dokkolt komplexben a Ganosporeric acid A-val való hidrogénkötés kialakulásáért, ami a komplex stabilitásához való jelentős hozzájárulását mutatja. Ezek az eredmények igazolták és sugallták az egyes triterpenoidok jelentős stabilitását a DENV-proteáz NS3pro doménjével a dokkolt komplexekben. Ezért ismét azt javasolták, hogy ezek a triterpenoidok felhasználhatók a DENV-fertőzés elleni gyógyszerek készítményeiben.