… (Zhang et al., 2009) súlyos problémákat okozott az Flv4 és Flv2 fehérjék jellemzésében. Először azt feltételezték, hogy egy ilyen membránasszociáció az Sll0218 fehérjén keresztül történik, amely egy integrál membránfehérje négy prediktált transzmembrán hélixszel. Kiderült azonban, hogy ez nem így van, mivel az Flv4 nagyrészt a membránfrakcióban maradt még az Sll0218 fehérje hiányában is (a D fl v2 , D sll0218-19 és D sll0218- 19/ fl ag – fl v4 mutánsok) (az adatok nem láthatóak). Sőt, az Sll0218 fehérje az Flv2/Flv4 heterodimertől függetlenül egy nagy membránkomplexhez társul ( 4. ábra). Végül a membránszubfrakcionálás kétfázisú particionálási módszerének módosításával az Sll0218 fehérje a tilakoid membránhoz lokalizálódott, míg az Flv4 és Flv2 ebben a rendszerben inkább a plazmamembránhoz társul (2D ábra). Ez utóbbi asszociáció erősen kationfüggőnek tűnt (2B. és 2C. ábra). Hasonló viselkedésről számoltak be nemrégiben egy másik Synechocystis-fehérje esetében is, bár a membránasszociáció mechanizmusa nem világos (Carmel és mtsai., 2011). Az Flv2/Flv4 heterodimer modell és a szekvenciaillesztés alapján a fehérje felszínén néhány feltételezett, His, Asp és Glu maradékokat tartalmazó fémkötőhelyet ismertünk fel. A homológ szerkezetekben is találtunk felszínhez kötött fémeket. Például a Synechococcus sp-ből származó fl avodoxinszerű domén (PDB ID: 3HLY) Ca 2+ , a M. thermoacetica FprA (PDB ID: 1YCF, 1YCG és 1YCH) pedig több Zn 2+ kötődést mutat a felszínen (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). A szerkezeteken szereplő fémionok a kristályosítási oldatból származnak, de a fémkötő maradékok egy része konzervált vagy hasonló maradékokkal helyettesített a modellünkben (lásd a 2. kiegészítő táblázatot online). Összességében ezek a maradékok lehetnek felelősek az Flv2 és Flv4 kationfüggő asszociációjáért a membránfrakcióhoz. A modell elektrosztatikus felületi potenciáljának elemzése alapján az Flv4 monomer negatívabban töltött felülettel rendelkezik (8B ábra), és több feltételezett fémkötő helyet tartalmaz a felületén, mint az Flv2 monomer (lásd online a 2. kiegészítő táblázatot). Figyelembe véve, hogy az izolációs pufferben használt kationkoncentráció sokkal magasabb, mint a valós fiziológiai körülmények (2B-2D ábra), az Flv2/Flv4 in vivo membránhoz való kötődése átmeneti és reverzibilis lehet. Az Flv2/Flv4 plazmamembránhoz való specifikus kötődése sejttöréskor (2D ábra) a felületi töltéssel is összefügghet, mivel a plazmamembrán belső felülete negatívabb, mint a jobb oldali tilakoid membrán (Barber, 1982; Körner et al., 1985). A tilakoid membrán felületi töltése azonban a fotoszintézis során drámaian megváltozhat, ami közvetítheti az Flv2/Flv4 tranzitkötését a tilakoid membránnal is. Az Sll0218 fehérje egyértelműen egy nagy molekulatömegű komplexbe lokalizálódott a tilakoid membránban. Az Sll0218 fehérje furcsa viselkedése a membrán alfrakciók hagyományos kétfázisú elválasztási rendszerében azonban arra utalt, hogy az Sll0218 fehérje nem egyenletesen oszlik el a tilakoid membránban. Egy nagy komplexhez társul, amely csak alig kisebb, mint a fő PSII dimer. A PSII dimer és a PSII monomer komplexek arányának csökkenése csak az Sll0218 fehérjét nélkülöző mutánsokban ( D sll0218-19 és D fl v4 ) következik be, a D fl v2-ben nem (5. ábra, 1. táblázat). Ezért feltételezzük, hogy az Sll0218 chaperonként működhet a levegő CO 2 -szintű körülmények között összeállt PSII dimer stabilizálásában. Bár a PSII komplexet monomer és dimer formában is izolálták már (Rögner et al., 1987; Hankamer et al., 1997; Adachi et al., 2009), széles körben elfogadott, hogy in vivo a PSII komplex dimerként működik mind a cianobaktériumokban, mind a magasabb rendű növényekben (Hankamer et al., 1999; Kuhl et al., 2000), míg a monomer PSII a PSII normál összeszerelésének és javításának egyik intermedierje lehet (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Bár a PSII in vivo dimerizációját cianobaktériumokban megkérdőjelezték a szolubilizációhoz használt detergensek és a tilakoidkomplexek in vitro elemzése miatt (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), mutáns megközelítésekkel meggyőző bizonyíték van a dimerképződésre. Valóban, a monomer-monomer határfelületen elhelyezkedő kis PSII alegységek, a PsbM és PsbT kulcsfontosságúnak bizonyultak a PSII megfelelő összeszereléséhez és javításához (Ohnishi és Takahashi, 2001; Iwai és mtsai., 2004; Bentley és mtsai., 2008). Mivel az Sll0218 fehérje csak alacsony (azaz légköri szintű) CO 2 körülmények között fejeződik ki, feltételezzük, hogy a PSII dimerek összeszerelődése eltér az Sll0218 fehérjék jelenlététől vagy hiányától függően (lásd alább). A fotoszintézis optimalizálása szigorú szabályozást igényel a napenergia abszorpciója és kémiai energiává alakítása, valamint a későbbi anyagcsereutak általi hasznosítása között. A vízi fotoautotrófok, például a cianobaktériumok számára a CO 2 nélkülözhetetlen, de gyakran kevés szubsztrát. Természetes környezetben a CO 2 elégtelen rendelkezésre állása, különösen ha nagy besugárzással párosul, a fotoszisztémákra nehezedő nagy gerjesztési nyomást eredményez (Huner, 1998), és korlátozza a fotoszintézis sebességét. Ennek kezelésére a cianobaktériumokban számos CO 2 -koncentráló mechanizmust indukálnak alacsony Ci körülmények között, hogy növeljék a ribulóz-1,5-bisz-foszfát-karboxiláz/oxigenáz körüli CO 2 -koncentrációt, és ezzel egyidejűleg ciklikus elektronáramlást indukáljanak a több ATP előállítása érdekében (lásd: Kaplan és Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005; Badger et al., 2006; Price et al., 2008). Microarray és proteomikai vizsgálatok egy alacsony CO 2 -koncentrációs stimulont mutattak ki (Wang et al., 2004; Eisenhut et al., 2007; Battchikova et al., 2010), amely magában foglalja az sll0217-19 ( fl v4- fl v2 ) operont is, amely ugyanolyan erősen szabályozott, mint az indukálható CO 2 -koncentrációs mechanizmus génjei. Az fl v2 és fl v4 gének szintén nagy fényreakcióval rendelkeznek (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). Az fl v4 és fl v2 inaktivációs mutánsok nagyfokú érzékenységet mutattak a PSII fotoinhibíciójára levegő CO 2 -szintű körülmények között (Zhang et al., 2009). Az operon kifejeződésével kapcsolatos közelmúltbeli vizsgálataink továbbá kimutatták, hogy az operon fl v4-fl v2 szoros szabályozását kis szabályozó RNS-ek végzik (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess és E.-M. Aro, publikálatlan adatok). Az fl v4-fl v2 operon ilyen erős indukciója és szabályozása az antisense RNS-ek által, valamint a PSII megfigyelt védelme a levegő CO-szintje és a magas …