Abstract
Háttér és cél. A vastagbélrák (CRC) műtét előtti szűrésére, diagnózisára és/vagy stádiumbeállítására szolgáló megbízható, nem invazív előrejelző eszköz kritikus fontosságú a kezelés megválasztása és a prognózis szempontjából. Módszerek. A 2015. január 1. és 2018. december 31. között CRC kezdeti kezelésére felvett betegeket kerestük és tekintettük át. A CD16+CD56+ természetes ölősejtek (NK) CD16+CD56+ adatait a CRC stádiumai szerint elemezték. Eredmények. A minősített résztvevők száma az egészséges, I. stádiumú, II. stádiumú, III. stádiumú és IV. stádiumú CRC-betegek között 60, 66, 60, 70 és 68 volt. Szignifikáns különbség volt a keringő CD16+CD56+ NK-sejtekben az egészséges csoport és a CRC-csoport között (), valamint az egészséges csoport és a III. vagy IV. stádiumú CRC-csoport között ( és 0,001, illetve). A keringő CD16+CD56+ NK-sejtek aránya a limfocitákban negatívan korrelált a CRC előfordulásával. Amikor a keringő CD16+CD56+ NK-sejtek segítségével összehasonlítottuk az I. és II. stádiumú CRC esetek csoportját a III. és IV. stádiumú CRC esetek csoportjával, a Receiver Operating Characteristic görbe alatti terület 0,878 volt. A 15,6%-os optimális határértéket használva az OR 0,06 (0,03, 0,11), az érzékenység 86,5%, a specificitás 72,5%, a pozitív prediktív érték 74,2% és a negatív prediktív érték 85,5% volt. Következtetések. A keringő CD16+CD56+ NK-sejtek a CRC szűrési és diagnosztikai/stádiumbeosztási eszközeként használhatók.
1. Bevezetés
A kolorektális rák (CRC) előfordulása évente körülbelül egymillió, és évente közel 700 000 ember halálát okozza, ezzel a negyedik leghalálosabb rákos megbetegedés a világon . A CRC jelenlegi szűrési stratégiája a székletalapú tesztek alacsony érzékenységével és/vagy specificitásával , a röntgenvizsgálatok előtti fárasztó bélelőkészítési lépésekkel és az endoszkópos vizsgálatoknál a perforáció magas kockázatával szembesül. Valójában a CRC legjobb szűrési és nyomonkövetési vizsgálatának magas megfeleléssel könnyen elvégezhetőnek és megismételhetőnek kell lennie, különösen figyelembe véve a diagnózis időpontjában akár 25%-ban nem operálható eseteket és a korai stádiumban lévő esetek 50%-os kiújulási arányát a műtétet követően .
A CRC stádiumbeosztása és prognózisa főként a sebészeti beavatkozásokat követő patológián alapul . A CRC osztályozására és prognózisára a paraffin metszeteken végzett konszenzusos immunszcore gyakorlati példa volt . Bár számos tanulmány alkalmazott kiegészítő és nem invazív biomarkereket a CRC diagnózisában , még mindig hiányzik egy megbízható, magas szenzitivitással és specificitással rendelkező előrejelző eszköz a CRC műtét előtti diagnózisára és/vagy stádiumbeállítására.
Az immunrendszerről ismert, hogy részt vesz a CRC kialakulásában és progressziójában . Kimutatták, hogy a CRC-ben a különböző immunsejtek immuninfiltrációja összefügg az áttétképződéssel és a prognózissal . Továbbá, a keringő immunsejtek tükrözhetik a helyi immunválaszt a tumor mikrokörnyezetében , ezáltal potenciálisan fontos információt szolgáltatva a betegség progressziójáról a CRC-ben . A természetes ölősejtek (NK) mint az immunsejtek fontos alcsoportja, amelynek aktivitását a sejtfelszíni receptorok által kapott aktiváló és gátló jelek közötti változó és kényes egyensúly váltja ki, a transzlációs és klinikai vizsgálatok érdekes célpontjainak tekinthetők.
A jelen tanulmányban a CD16 és CD56 kettős pozitív NK sejteket elemeztük a CRC betegek egészséges és különböző stádiumaiban a kezdeti kezelés előtt, megpróbálva kideríteni a CD16+CD56+ NK sejtek értékét a CRC előrejelzésében és a kezelés előtti stádiumban.
2. Módszerek
Ez egy retrospektív kohorsz vizsgálat volt, amelyet a Harbin Orvosi Egyetem 2. kapcsolt kórházában, egy északkelet-kínai tercier kórházban végeztünk. Az adatgyűjtés előtt az intézményi etikai bizottság jóváhagyását szerezték be, és a betegektől a felvételkor tájékozott beleegyezést kértek.
A 2015. január 1. és 2018. december 31. között CRC kezdeti kezelésre az Onkológiai Osztályra felvett betegek klinikai adatait kikeresték és áttekintették. A bevont betegeknek rendelkezniük kellett a kezelés előtti NK-sejt adatokkal (az első műtét előtti legfrissebb adatokkal), valamint szövettanilag igazolt primer CRC-vel. A stádiumbeosztás a tumorcsomó-metasztázis (TNM) terminológia alapján történt . A nem egyértelmű diagnózissal rendelkező, más daganatos megbetegedésekkel szövődményes, a CRC korábbi kezelése után felvett, egyéb krónikus betegségben (például szív- és érrendszeri és endokrin betegségekben) szenvedő, illetve vírusos vagy bakteriális fertőzésben szenvedő betegeket kizárták. A kontrollcsoportba korban és BMI-ben illeszkedő egészséges résztvevőket (akiknek nem volt klinikai panaszuk, és akik a felvételkor éppen az éves fizikális vizsgálaton estek át) vettek fel.
A kezelés előtt (a CRC-csoport esetében) vagy az éves vizsgálat napján (az egészséges kontrollok esetében) minden résztvevőtől heparinnal bevont csőbe perifériás vénás vérmintát vettek, és 2-8 °C-on tárolták. A frissen gyűjtött vérből 100 μl-t átvittek egy áramlásspecifikus csőbe. 20 μl BD Multitest 6 színű TBNK reagensből (Ref # 644611, BD, USA, beleértve CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC és CD8 APC-Cy7) adtunk 20 μl-t az áramlási citometriás vizsgálathoz a gyártási útmutatónak megfelelően, amelynek paneljén belül a CD16+CD56+ specifikusan számszerűsítette az NK sejteket a limfocita populáción belül. Az elegyet szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk sötétben, majd 2,5 ml vörösvérsejt-lízispufferrel (Sigma-Aldrich) kezeltük 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben. Az elegyet kétszer mostuk PBS pufferrel, reszuszpendáltuk és fixáltuk 0,5 ml 0,9%-os formaldehidet (Sigma-Aldrich) tartalmazó PBS-ben, majd FACSCanto II áramlási citométer rendszerrel (BD Biosciences) FACSDiva™ szoftver 8.0 verziójával (BD Biosciences) elemeztük. Minden mintából legalább 20 000 sejtet elemeztünk a P1 kapuban.
2.1. Statisztikai elemzés
A diszkrét adatokat az esetek számában (százalékban) fejeztük ki, és a teszt vagy a Fisher-féle egzakt teszt segítségével elemeztük, az esélyhányados (OR) és a 95%-os konfidenciaintervallum (95% CI) mellett, attól függően, hogy melyik volt alkalmazható. A folytonos adatokat a mutatták ki, és a -teszt segítségével elemezték. A Receiver Operating Characteristic (ROC) görbe alatti területet használták az előrejelzés értékének bemutatására. A statisztikai elemzéshez az SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY) programot használták. Kétszeresen eltérőnek tekintettük a szignifikáns különbséget.
3. Eredmények
Az előre meghatározott vizsgálati időszakban 2714 CRC-beteget vettek fel kórházunkba. Az előre meghatározott felvételi kritériumok szerint 66 I. stádiumú, 60 II. stádiumú, 70 III. stádiumú és 68 IV. stádiumú beteg került be vizsgálatunkba. A kontrollcsoportba további 60, korban és BMI-ben illeszkedő egészséges résztvevőt vontunk be. Nem volt szignifikáns különbség az életkor, a nem, a testsúly, a magasság vagy a BMI tekintetében az egészséges kontrollok és a CRC-esetek között, illetve a különböző csoportok között (, 1. táblázat).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
# teszt az összes csoport között. ANOVA teszt az összes csoport között. $ teszt az egészséges kontrollcsoport és a többi megfelelő csoport között. -teszt az egészséges kontrollcsoport és a többi megfelelő csoport között. $$ érték az egészséges vs. CRC esetek között, teszt vagy -test.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.1. táblázat. A keringő CD16+CD56+ NK-sejtek prediktív értéke CRC-ben
A keringő CD16+CD56+ NK-sejtekben jelentős különbség volt az egészséges csoport és a CRC-esetek között (, 1. táblázat). A keringő CD16+CD56+ NK-sejtek százalékos aránya a limfocitákban negatívan korrelált a CRC előfordulásával.
A CD16+CD56+ NK-sejtek szerepét a CRC előrejelzésében a Receiver Operating Characteristic (ROC) görbét alkalmaztuk. Az egészséges kontrollok és a CRC-esetek összevetésekor (1. ábra) a görbe alatti terület (AUC) 0,725 volt (2. táblázat). A 19,7%-os optimális határértéket használva az OR 0,08 (0,04, 0,15), az érzékenység 80,0%, a specificitás 76,9%, a pozitív prediktív érték (PPV) 44,0%, a negatív prediktív érték (NPV) 94 volt.4%.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
AUC: a görbe alatti terület. A küszöbérték feletti esetszám/összes esetszám a megfelelő csoportokban.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. táblázat. A keringő CD16+CD56+ NK-sejtek a CRC-esetek különböző stádiumaiban
A keringő CD16+CD56+ NK-sejtekben nem volt különbség az egészséges csoport és az I. vagy II. stádiumú CRC-csoport ( és , illetve ) között, de jelentős különbségek vannak az egészséges csoport és a III. vagy IV. stádiumú CRC-csoport között ( , illetve , illetve , 1. táblázat). Mivel a CD16+CD56+ NK-sejtek tekintetében nem volt különbség az egészséges csoport és az I. vagy II. stádiumú CRC-csoport között, az egészséges kontrollok+I+II. stádiumú CRC-esetek csoportjának és a III+IV. stádiumú CRC-esetek csoportjának összehasonlításakor (2. ábra) az AUC 0,892 volt (2. táblázat). A 15,6%-os optimális határértéket használva az OR 0,07 (0,04, 0,12), az érzékenység 84,4%, a specificitás 72,5%, a PPV 80,5% és az NPV 77,5% volt.
Az I. és II. stádiumú CRC esetek csoportját a III. és IV. stádiumú CRC esetek csoportjával összehasonlítva (3. ábra) az AUC 0,878 volt (2. táblázat). A 15,6%-os optimális határértéket használva az OR 0,06 (0,03, 0,11), az érzékenység 86,5%, a specificitás 72,5%, a PPV 74,2% és az NPV 85,5% volt.
4. Megbeszélés
Tágabb értelemben a CD56-expressziójuk alapján az NK-sejtek CD56fényes és CD56dim sejtekre oszthatók. Az előbbi sejtek immunregulációval és proinflammatorikus citokinek termelésével vannak kapcsolatban, míg az utóbbi sejtek citotoxikusak . Az NK-sejteken található CD16 (FcγRIII) közvetíti az antitest-függő sejtközvetített citotoxicitást , és a CD16 jelenléte így kizárja bizonyos T- vagy B-sejtekkel korreláló NK-sejtek érintettségét .
A közelmúltban két tanulmány is a CD3-CD56+-t használta az NK-sejtek markereként. Az egyik tanulmány az NK-sejtek alcsoportjainak jelenlétéről számolt be CRC-betegekben, és a következő következtetést vonta le: “a CD16+ NKT-szerű sejtek százalékos aránya függetlenül társult a CRC-betegek rövidebb betegségmentes túlélésével” . A szerzők azonban csak korlátozott számú beteget vontak be, és a különböző stádiumok szerinti rétegzés, valamint a CD56fényes és CD56dim NK-sejt-populáció felosztása tovább hígította adataik erejét. Ráadásul e betegek egy része már az NK-sejtek gyűjtése előtt radiológiai kezelésben részesült, ami heterogenitást (a kezdetben kezelt és a kezelés utáni betegek keveredését) hozhat az összevont betegpopulációba. Egy másik tanulmány negatív korrelációról számolt be a perifériás NK-sejtek és a CRC TNM-stádiuma között, az NK-sejtek szignifikáns különbségével az egészséges és az I. és II. stádiumú, valamint az egészséges és a IV. stádiumú betegek között, de nem az egészséges és a III. stádiumú betegek között . Ez az ellentmondásos tendencia az egyes csoportokba bevont betegek kis számából adódhat. A mi vizsgálatunkban több beteget gyűjtöttünk, és csak a korábbi kezelés nélküli betegeket vettük fel az elemzéshez, ami megmutathatja a természetes testállapotot a CRC terhe alatt. Így adataink, mint ilyen homogének, szűrővizsgálatként alkalmazhatók a kezdeti kezelés előtt.
Vizsgálatunk másik erőssége a vírusos vagy bakteriális fertőzéses esetek kizárásában rejlik. Az NK-sejtek felszínén aktiváló és gátló receptorok vannak . Az NK-sejteket aktiváló receptorok, mint például a Ly49H, a KIR2DL3 vagy a KIR3DS1, szükségesek a citomegalovírus , a hepatitis C vírus , illetve az Epstein-Barr vírus fertőzések tisztításához. Másrészt az NK-sejteket gátló receptorok, mint például a CD94-NKG2A , vagy a KIR-ek , szintén részt vesznek a vírusfertőzésben. Az aktiváló és gátló receptorok közötti egyensúlyt a receptor-ligandum kötődés tartja fenn. A közvetlen Toll-szerű receptorokat (TLR-ek) a gram-negatív baktériumok egyik összetevője, a lipopoliszacharid aktiválhatja. A TLR-ek NK-sejteken történő stimulációjáról is beszámoltak, hogy részt vesznek az NK-sejtek aktiválásában . Ezért a vírusos vagy bakteriális fertőzéses esetek kizárása csökkenti ezen esetek heterogenitását a CRC esetek elemzésében.
A CRC prognózisának immunhisztokémiai festésen alapuló, génmutáció vagy polimorfizmus , illetve aktiváció kimutatására szolgáló, csak sebészeti beavatkozások után kivitelezhető előrejelzéséről számoltak be. A CRC keringő biomarkereinek egyik kategóriája a génszabályozás (mikroRNS vagy metiláció) körébe tartozik . Egy másik kategória a szérum metabolizmus elemzésében rejlik . Ebben az értelemben a keringő CD16+CD56+ NK-sejtek prediktív szerepet játszanak mind a szűrésben, mind a sebészeti beavatkozások előtti stádiumbeosztásban.
5. Következtetés
Összefoglalva, azt találtuk, hogy a keringő CD16+CD56+ NK sejtek százalékos aránya negatívan korrelált a CRC előfordulásával és a CRC stádiumbeosztásával. A 19,7%-os és 15,6%-os határértéket használva a keringő CD16+CD56+ NK-sejtek százalékos aránya képes volt különbséget tenni az egészséges és a CRC-esetek, illetve az I+II. és III+IV. stádiumú esetek között.