A hemociták típusai a tücsökben

Az 1A. ábra a tücsök hemocitáinak differenciális interferencia kontraszt (DIC) mikroszkópos képét mutatja, amelyen különböző méretű és alakú sejtek láthatók. E hemociták pontos azonosítása érdekében körülbelül 1000 sejtet méretük és morfológiájuk alapján (adatok nem láthatóak) hat típusba soroltunk (1B~G ábra). Amint az 1B. ábrán látható, a hemolimfában a tipikus granulocita volt megfigyelhető. A granulociták általában kerek vagy ovális alakúak voltak, és a citoplazmán belül sok polimorf granulum volt megfigyelhető. A granulocita plazmamembránján kis pszeudopodiák vagy filopodiák voltak megfigyelhetők (1B. ábra, fehér nyilakkal jelölve). Az 1C. ábrán látható sejtet plazmatocitáknak tekintettük a jellegzetes orsó alakjuk és a plazmamembrán két végén megfigyelhető hosszú, szőrszerű struktúrák miatt (fehér nyilakkal jelölve). Az 1D ábrán egy prohemocita látható, amelyek a rovarok hemolimfájában megfigyelt legkisebb kerek sejtek. A sejtmagok a sejtmérethez képest nagyok voltak, és a sejt közepén helyezkedtek el (1D ábra). Így a prohemociták citoplazmája és sejtmagja gyakran megkülönböztethetetlen volt. Az 1E. ábra egy különböző citoplazmatikus granulumokat tartalmazó koagulocitát ábrázol. A koagulociták plazmamembránja sima, struktúrák nélküli volt, sejtmagjuk pedig nagy és jól megfigyelhető. Az oenocitoidok voltak a legnagyobb megfigyelt hemocita-típus, és ritkán fordultak elő a hemolimfában (1F ábra). Az oenocitoidok általában kerek tükörtojás alakúak voltak, számos citoplazmatikus szemcsével. Az 1G. ábra egy szferulocitát mutat, amelyek kerekek és közepes méretűek voltak, a citoplazmában sok apró sötét vagy fénylő szemcsével. Amint az 1D~G ábrán látható, a prohemociták, koagulociták, oenociták és szferulociták plazmamembránján nem voltak struktúrák láthatóak, amelyek optikailag nagyon simák voltak.

A tücskök vérében megfigyelt hatféle hemocita. A hemociták általános alakja és relatív mérete a hemolimfában (A). A G. bimaculatusban talált hatféle hemocitát méret és morfológia alapján a granulociták (B ; GR), plazmatociták (C ; PL), prohemociták (D ; PR), koagulociták (E ; CO), oenociták (F ; OE) és szferulociták (G ; AD) közé soroltuk. A granulociták és plazmatociták plazmamembránján lévő legyezőszerű vagy amőba-szerű struktúrákat fehér nyilak jelzik (B és C). Méretsáv = 25 µm (A) vagy 10 µm (B~G).

Noduláció és tokozás hemociták által

A rovaroknál a sejtes immunválaszokat, mint például a noduláció, tokozás és fagocitózis, immunhemociták, például granulociták és plazmatociták végzik. A kórokozónak való kitettség után ezek a hemociták megváltoztatják alakjukat, és plazmamembránjukban nagy amőba- vagy legyezőszerű struktúrák alakulnak ki. E gyors morfológiai változások valós idejű megfigyelésére olyan technikát fejlesztettünk ki, amely lehetővé teszi a rovar hemociták 7 napon át történő tenyésztését a fiziológiai aktivitás megőrzése mellett (lásd az Anyagok és módszerek fejezetben). Bár nem tudtunk stabil, több évig passziválható hemocita-vonalakat létrehozni, sikerült megfigyelni a hemociták morfológiáját a kórokozókra adott válaszreakcióban in vitro. A C kiegészítő film csak a hemocitákat mutatja 12 órás inkubáció után. A legtöbb tenyésztett sejt aktívan mozgott. Néhány sejt a tenyésztés során hálót mutatott a sejtmembrán körül, és úgy találtuk, hogy a tenyésztőlemezekhez rögzült. A hemociták ritkán aggregálódtak vagy nagy klasztereket alkottak.

A 2A. ábra E. colival tenyésztett hemocitákat mutat (lásd még az 1. kiegészítő filmet). Néhány hemocita aggregáltabb és mozgóbb volt megfigyelhető. Az inkubációs idő növekedésével bizonyos hemocitákból hálók (amőba-szerű szőrszálak vagy extracelluláris csapdák) keletkeztek, és ezek a hálók különböző hemocitákat gyűjtöttek össze, hogy nagy klasztereket alkossanak (2A-1~A-6. ábra; az amőba-szerű szőrszálakat vagy extracelluláris csapdákat fekete nyilak jelzik). Amint a 2A-1. ábrán látható, a hemociták három csoportját (fekete körökkel jelölve) végül a hálók egyetlen klaszterbe vonták (2A-5. és A-6. ábra).

Élősejtes képek E. coli vagy Sephadex gyöngyökkel fertőzött tücsök hemocitákról. (A) Fénymikroszkópos felvételek E. colival tenyésztett hemocitákról. Az inkubációs idő növekedésével specifikus hemocitákból hálók (amőba-szerű szőrszálak vagy extracelluláris csapdák; fekete nyilakkal jelezve) keletkeztek. Ezek a hálók mind a hatféle hemocitát nagy csomókba tömörítették (A-1~A-6; fekete dobozok jelzik). A film elérhető az 1. filmként (az idő az oltás utáni percekben). (B) Fénymikroszkópos felvételek a Sephadex gyöngyökkel tenyésztett hemocitákról. A hemociták körüli Sephadex gyöngyöket véletlenszerűen SP1, SP2, SP3, SP4 és SP5 jelzéssel láttuk el. Idővel a Sephadex gyöngyöket (SP1, SP2, SP3 és SP4) hemociták vették körül és különböző típusú hálókkal (B-1~B-9; fekete nyilakkal jelezve) kapszulázták be. A film elérhető a 2. filmként (az idő az oltás utáni percekben). Méretsáv = 25 µm (A és B). A C. film egyedül, Sephadex gyöngyök nélkül tenyésztett hemocitákat mutat. A legtöbb hemocita aktívan mozgott. Néhány sejt plazmamembrán-hálóval kapcsolódott a tenyésztőlemezekhez. Nagy hemocita-csoportosulások azonban nem voltak megfigyelhetők.

Nem lehetett azonban megállapítani, hogy a fent leírt hemociták összegyűjtését az E. coli váltotta-e ki. E kérdés megválaszolásához a hemocitákat Sephadex-gyöngyökkel (120 μm átmérőjű) aktiváltuk, ami DIC-mikroszkóppal könnyen megfigyelhető (2B ábra, 2. kiegészítő film). Amint a 2A. ábrán látható, a Sephadex gyöngyöket a specifikus hemociták által létrehozott hálók fogták be (2B. ábra; a hálókat fekete nyilak jelzik a sárga dobozokban). A hemociták körüli Sephadex-gyöngyöket véletlenszerűen SP1, SP2, SP3, SP4 és SP5 jelzéssel láttuk el. Amint a 2B-2. és a B-3. ábra összehasonlításából látható, az SP1, SP2 és SP3 együtt és a sárga doboz által jelzett területre húzódott. Ezenkívül az SP1-et végül teljesen körülvették a különböző hemociták (2B-9. ábra). Az SP4-gyel jelölt gyöngy szintén beépült az SP1, SP2 és SP3 csoportba (2B-4~B-9. ábra; sárga doboz jelzi). Idővel az összes Sephadex gyöngyöt (SP1, SP2, SP3 és SP4) sok hemocita vette körül. Ezzel szemben megfigyelhető volt, hogy egyes hemociták érintkeztek az SP5-tel, de az nem húzódott be a sárga doboz által jelzett területre, annak ellenére, hogy hasonló helyzetben volt, mint az SP1. Ezért úgy tűnt, hogy a hemociták általi csomósodás véletlenszerűen történik.

Granulocita-aktiválás karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyökkel

A következőkben azt vizsgáltuk, hogy mely hemociták hozták létre a hálókat és vettek részt az immunválasz különböző lépéseiben, beleértve a kapszulázást és a csomósodást. Ehhez a kórokozók helyett karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyöket használtunk, amelyek DIC-mikroszkóppal könnyen megfigyelhetők, és valós idejű képeket gyűjtöttünk a hemocitákról. A 3A. ábra a karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyökkel 12 órán keresztül stimulált hemocitákat mutatja (3. kiegészítő film). A hemociták által létrehozott hálók (fekete nyilakkal jelölve) aktívan mozogtak a latexgyöngyök (piros nyilakkal jelölve) körül (3A-1. ábra). Idővel a gyöngyöket a hálók elnyelték, és végül a hemociták citoplazmájában láthatók voltak (3A-2~A-4. ábra). Azonban nem minden, hálóval találkozó karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngy fagocitálódott. Úgy tűnt tehát, hogy az aktivált hemociták mozgása nem felelt meg pontosan a gyöngyök mozgásának.

Karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyökkel stimulált granulociták élősejtes képei. (A) Fénymikroszkópos felvételek a 12 órán keresztül karboxilált-modifikált polisztirol latexgyöngyökkel tenyésztett hemocitákról. A-1~A-4, tenyésztett hemociták 12~18 perc után. A hemociták által termelt hálók (fekete nyilak) láthatóak a latexgyöngyök (piros nyilakkal jelezve) körül. A latexgyöngyöket a hálók elnyelték, és végül a hemociták citoplazmájába kerültek (A-4). A film elérhető a 3. filmként (az idő a stimuláció utáni percekben). Méretsáv = 40 µm. (B) Nagyított képek. (B-1) 4 óra elteltével sok karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyöt fogtak be a hemociták (latexgyöngyök, piros nyilak; és specifikus hemociták, fehér körök). (B-2~B-6) Kitenyésztett granulociták 0, 2, 4, 4, 12 és 48 órával a stimuláció után. (B-2) Nyugalmi állapotban lévő granulociták, amelyek kerek vagy ovális alakúak. (B-3) 2 órával a stimuláció után a granulociták morfológiai változásokat kezdtek mutatni, és legyezőszerű vagy amőbaszerű plazmamembrán struktúrák (fehér nyilak) láthatók. (B-4 és -5) A granulociták citoplazmájában nagyszámú latexgyöngy halmozódott fel 4 és 12 órával a fertőzés után. (B-6) 48 órával a fertőzést követően sok latexgyöngy halmozódott fel a granulociták citoplazmájában, de hálók már nem voltak megfigyelhetők, és sok granulocita inertnek tűnt. Méretsáv = 15 µm (B-1) vagy 10 µm (B-2~B-6).

A részletes megfigyeléseket nagy nagyítású konfokális mikroszkóp segítségével végeztük (3B ábra). A fertőzést követő 4 órában a karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyök egyes hemocitákon belül megfigyelhetők voltak (3B-1. ábra; a gyöngyöket piros nyilakkal, az egyes hemocitákat fehér körökkel jelöltük). Ezután részletesebben megfigyeltük, hogy mely specifikus sejtek nyelték el a latexgyöngyöket (3B-2~B-6. ábra). A 3B-2. ábra nyugvó granulocitákat mutat, amelyek általában kerek vagy ovális alakúak voltak, a citoplazmán belül sok polymorf sötét szemcsével. A karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyökkel történő stimuláció után 2 órával a granulociták morfológiai változásokat kezdtek mutatni, beleértve a plazmamembrán legyezőszerű vagy amőba-szerű kiemelkedéseit (3B-3. ábra; fehér nyilakkal jelölve). Karboxilát-modifikált polisztirol latexgyöngyöket figyeltek meg a granulociták citoplazmájában 4 órával a stimulációt követően, és 12 órával a stimulációt követően sok granulocita citoplazmájában nagyszámú latexgyöngy halmozódott fel (3B-4. és B-5. ábra; a gyöngyöket piros nyilak, a hálókat fehér nyilak jelzik). Ezenkívül megfigyelhető volt, hogy a hálók idővel egyre nagyobbak és szélesebbek lettek (3B-4. és B-5. ábra). A stimulációt követő 48 órában sok latexgyöngy halmozódott fel a granulociták citoplazmájában, de a hálók már nem voltak láthatók, és sok granulocita inertnek tűnt (3B-6. ábra; a gyöngyöket piros nyilak jelzik).

Amint a 2. ábrán látható, a granulociták nemcsak más granulocitákhoz, hanem különböző típusú hemocitákhoz is kapcsolódni látszottak e hálók segítségével. Nem figyeltünk meg fagocitózist egyetlen más sejttípusban sem, kivéve egy kis számú plazmatocitát (adatok nem láthatóak). Ezenkívül a granulocitákon és kis számú plazmatocitán kívül semmilyen immunológiai aktivitást vagy morfológiai változást nem figyeltünk meg egyetlen sejttípusban sem.

A granulociták lizoszómáit aktiválta az E. coli-részecskékkel

Hogy megvizsgáljuk, hogy a granulocitákon belül megfigyelt vakuolumok patogénnel kapcsolatos fagoszómák-e, a tücsköknek E. coli-részecskéket injektáltunk, amelyeket elsősorban a fagocitózis markereiként használnak, és amelyek zöld színnel fluoreszkálnak, amikor savasodott organellumokhoz, például intracelluláris lizoszómákhoz jutnak. Ezzel egyidejűleg a teljes hemocitákat LysoTracker Reddel festették meg, amely a lizoszómákat jelöli. Amint a 4A-1. ábrán látható, a granulociták citoplazmájában zöld fluoreszcens jel (fagocitált E. coli részecskék) volt megfigyelhető közvetlenül a részecskék beadása után. Ezzel egyidejűleg egy vörös fluoreszcens jelet is megfigyeltünk, amely az aktivált lizoszóma-képződést jelzi (4A-2. ábra). Az injekciót követő 4 órában számos granulocitában erősen polimorf vakuolumok voltak láthatók (4A-4. és A-5. ábra). A zöld fluoreszcens jel (fagocitált E. coli részecskék) és a vörös fluoreszcens jel (aktivált lizoszómák) összevont képe látható (4A-6. ábra). Az injekció beadása után 12 órával a zöld fluoreszcens jel halványodni kezdett, míg a vörös fluoreszcens jel megmaradt (4A-7~A-9. ábra). Az injekciót követő 24 órára mindkét fluoreszcens jel elhomályosodott (4A-10~A-12. ábra). A granulociták vörös fluoreszcens jele azonban 48 órával az injekció beadása után ismét megfigyelhető volt (4A-13~A-15. ábra). A 4Aa~Ao. ábra az A-1~A-15 panelek betétjeit (fehér dobozokkal jelölve) mutatja nagyobb nagyításban. A csak PBS-pufferrel injektált tücskök a beadás utáni minden időpontban negatívak voltak a vörös és zöld fluoreszcencia tekintetében (4B. ábra).

LysoTracker Red jelölés a granulocita lizoszómákban zöld fluoreszcens E. coli részecskékkel injektált tücskökben. (A) A granulocita lizoszómák alakulása 0, 4, 12, 24 és 48 órával az E. coli részecskék beadása után. (A-1, A-4, A-7, A-10 és A-13) A fagocitózis markereként használt E. coli részecskék zöld színnel fluoreszkálnak, amikor savasodott organellumokhoz, például intracelluláris lizoszómákhoz jutnak. (A-2, A-5, A-8, A-11 és A-14) LysoTracker Reddel (lizoszómális marker) festett granulociták konfokális fluoreszcens mikroszkópos képei. (A-1 és A-2) A zöld és vörös fluoreszcens jelek a granulociták citoplazmájában az injekciót követő 1 órától kezdve voltak megfigyelhetők. (A-4 és A-5) Sok granulocita zöld és vörös fluoreszcenciát mutatott a granulociták erősen polimorfikus vakuolumaiban 4 órával az injekciót követően. (A-7 és -8) 12 órával az injekció beadása után a zöld fluoreszcens jel elhalványult, de a vörös fluoreszcens jel megmaradt. (A-10 és A-11) 24 órával az injekció beadása után a zöld és a vörös fluoreszcens jelek szinte teljesen eltűntek. (A-13 és A-14) 48 órával az injekció beadása után a zöld fluoreszcens jel teljesen eltűnt, de a vörös fluoreszcens jel ismét megfigyelhető volt. A zöld és vörös fluoreszcens jelek összevont képei láthatóak (A-3, A-6, A-9, A-12 és A-15). (a~o) Az A-1 ~A-15 panelek betétjei (fehér dobozokkal jelölve) nagyobb nagyításban. (B) A vörös fluoreszcens jel a PBS-szel injektált tücskök granulocitáiban (negatív kontroll). (C) Áramlási citometriai elemzés az injekciót követő 1 h~48 h-ban. (C-1 és C-2) A zöld fluoreszcens jel 2,08% volt az injekciót követő 1 órában, és 24,6%-ra nőtt az injekciót követő 4 órában. (C-3~C-5) A zöld fluoreszcens jel fokozatosan csökkent, 12 órára 10,87%-ra, 24 órára 3,98%-ra és 48 órára 1,74%-ra. (C-1-1~C-4-1) A vörös fluoreszcens jel az injekciót követő 12 órára 69,54%-ra nőtt, majd 24 órára 5,78%-ra csökkent. (C-5-1) A vörös fluoreszcens jel ismét megnőtt, 30,25%-ra, 48 órával az injekció beadása után. (C-1-2~C-5-2) A csak PBS-pufferrel injektált tücskök granulocitáinak vörös fluoreszcens jele. (D) Az áramlási citometriás elemzéseket háromszor megismételtük.

A PBS-pufferrel vagy E. colival kezelt tücskök zöld- és vörös fluoreszcens jelének számszerűsítésére a hemocitákat áramlási citometriával elemeztük 0~48 órával az injekció beadása után (4C ábra). Az injekciót követő 0 órában a hemociták 2,08%-a mutatott pozitív zöld fluoreszcenciát, és ez az érték 4 órával az injekciót követően 24,36%-ra nőtt (4C-1. és C-2. ábra). A zöld fluoreszcens jel fokozatosan csökkent a hemociták 10,87%-ára 12 órára, 3,98%-ára 24 órára és 1,74%-ára 48 órára (4C-3~C-5. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az E. coli részecskéket a granulociták aktívan bekebelezték és megemésztették, és 48 órával az injekció beadása után teljesen kiürültek. Az injekciót követő 12 órában a hemociták 69,54%-a mutatott pozitív vörös fluoreszcenciát, és a jel 24 órával az injekciót követően a hemociták 5,78%-ára csökkent (4C-1-1~C-4-1. ábra). Mikroszkópos megfigyeléseinkkel összhangban a vörös fluoreszcens jel a hemociták 30,25%-ára nőtt 48 órával az injekciót követően. Ezzel szemben a PBS-t injektált tücskök zöld és vörös fluoreszcenciája minden időpontban negatív volt (4C-1-2~C-5-2. ábra). Az áramlási citometriás elemzést háromszor megismételtük (4D ábra).

A granulocita lizoszómák reaktiválása 48 órával a fertőzés után

A granulocita lizoszómák reaktiválását 48 órával a fertőzés után mikroszkópos megfigyeléssel tovább vizsgáltuk (5A és B ábra). Ahogy a 4A. ábrán látható, a zöld fluoreszcens jel (fagocitált E. coli részecskék) és a vörös fluoreszcens jel (aktivált lizoszómák) 4 órával az injekciót követően látható volt (5A-1~A-3. ábra). A fluoreszcens jelek 24 órával a fertőzés utánra elhalványultak (5A-4~A-6. ábra). A fertőzést követő 24 órában megfigyeltük, hogy a granulociták citoplazmájában sejtek voltak láthatók (5A-4~A-6. ábra; fehér nyilakkal jelölve). Ez a jelenség 48 órával a fertőzés után még szembetűnőbb volt (5A-7~A-9. ábra; fehér nyilakkal jelölve). Ezenkívül a lizoszómák ezen elnyelt sejtek körül 48 órával a fertőzés után aktiválódtak (5A-8. ábra). Amint a 4A-14., 4C-5-1. ábrán látható, ezek a mikroszkópos megfigyelések magyarázatot látszanak adni a vörös fluoreszcens jel növekedésére 48 órával a fertőzés után. Ennek megerősítésére a granulociták sejtmagjait 4′,6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) festettük meg 48 órával a fertőzés után. Amint az 5B-1. ábrán látható, gyakran két maggal rendelkező granulociták voltak megfigyelhetők. Alkalmanként kettőnél több magot tartalmazó granulociták vagy deformált magok is megfigyelhetők voltak (5B-2 és B-3 ábra; fehér nyilakkal jelölve).

A granulocita lizoszómák újraaktiválása 48 órával a beadás után. (A) Fluoreszcens mikroszkópos felvételek a granulocitákról 4, 24 és 48 órával az injekció beadása után. (A-1 és A-2) A granulociták zöld és vörös fluoreszcens jeleket mutattak az erősen polimorf vakuolumokban 4 órával az injekciót követően. (A-4 és A-5) 12 órával az injekció beadása után a zöld fluoreszcens jel elhalványult, de a vörös fluoreszcens jel megmaradt. Ezenkívül a granulociták citoplazmáján belül is megfigyelhető volt néhány sejt (fehér nyilak). (A-7 és A-8) Ez a jelenség gyakrabban volt megfigyelhető 48 órával az injekció beadása után. Ezenkívül az ezeket az elnyelt sejteket körülvevő lizoszómák aktiválódtak (A-8). A zöld és vörös fluoreszcens jelek összevont képei láthatóak (A-3, A-6 és A-9). (B) DAPI-val festett granulociták 48 órával az injekció beadása után. (B-1) A granulociták citoplazmájában két sejtmag volt megfigyelhető. (B-2 és B-3) Esetenként két vagy több sejtmag vagy deformált sejtmag volt megfigyelhető a granulocita citoplazmában (fehér nyilakkal jelölve). Méretsáv = 10 µm (A) vagy 20 µm (B).

Nekrózissal kapcsolatos granulocita sejthalál 48 órával a fertőzés után

Amint a 3B-6. és 5A-8. ábrán látható, a fagoszómák felhalmozódása a granulocitákban megváltoztatta azok alakját és sejthalált idézett elő. A hemocitákat 48 órával a fertőzés után fluoreszcein-izotiocianát (FITC) konjugált annexin V-vel és propídium-jodiddal (PI) festettük meg az apoptotikus vagy nekrotikus sejthalál igazolására (6A. ábra). A zöld fluoreszcens jel (annexin V) csak kismértékben növekedett 12 óra és 48 óra között (A-10., A-7. és A-10. ábra), de a vörös fluoreszcens jel (PI) erős festődést mutatott 12 órával a fertőzés után (6A-5. ábra). A fertőzés utáni 24 és 48 órában a vörös fluoreszcens jel továbbra is fennmaradt (6A-8. és A-11. ábra). A vörös fluoreszcens jel (PI) és a DIC-képek összevont képei láthatók (6A-3., A-6., A-9. és A-12. ábra). A 6Aa~Ad ábra az A-3, A-6, A-9 és A-12 panelek dobozokkal jelzett betétjeit mutatja nagyobb nagyításban. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a fagoszómák felhalmozódása a granulocitákban nem tipikus apoptotikus, hanem nekrózissal kapcsolatos sejthalált idézett elő. A PI-festés számszerűsítéséhez a hemocitákat megfestettük és áramlási citometriával vizsgáltuk 0, 12, 24 és 48 órával a fertőzés után. A fertőzést követő 12 órában a granulociták 71,29%-a volt PI-vel festett, szemben a 0 órás 13,52%-kal (6B-1. és B-2. ábra). A fertőzést követő 24 órában a PI-festés kissé csökkent, 45,97%-ra, de 48 órára ismét 76,24%-ra emelkedett (6B-3. és B-4. ábra). Az áramlási citometriai elemzést háromszor megismételtük (6C. ábra).