DDRGK1 szükséges az ER homoeosztázisához

A DDRGK1 sejtfunkciójának megértéséhez megvizsgáltuk a DDRGK1 kiütésének hatását két siRNS keverékével, a korábban leírtak szerint21. Azt találtuk, hogy a DDRGK1 knockdownja apoptotikus sejthalált indukált mind az MCF7, mind a HepG2 sejtekben, amelyet Annexin V/PI festés (1a. ábra), kaszpáz-3 aktiváció és PARP hasadás (1b. ábra) jellemzett. Meg kell jegyezni, hogy a DDRGK1 knockdownja által indukált kaszpáz-3 hasadást a HepG2 sejtekben kimutathatjuk, de az MCF7 sejtekben nem, mivel az MCF7 sejtek kaszpáz-3 deficiensek22. A kvantitatív valós idejű PCR (Q-PCR) elemzés azt mutatta, hogy a DDRGK1 knockdownja növelte a pro-apoptotikus gének BAX, BAK, NOXA, DR5 és Bid expresszióját, míg az anti-apoptotikus gén Bcl-2 expressziója csökkent (1c,d ábra). Fontos, hogy azt találtuk, hogy a DDRGK1 kiütése az MCF7 és HepG2 sejtekben ER stresszválaszt indukált, a BiP, HSPA8 és CHOP ER stressz-specifikus gének fokozott expressziójával (1e,f ábra).

(a) Az MCF7 és HepG2 sejteket vagy kontroll siRNS-szel vagy DDRGK1-et célzó siRNS-szel transzfektáltuk 72 órán keresztül. A sejteket ezt követően Annexin V-vel és PI-vel festettük, majd áramlási citometriai elemzésnek vetettük alá, amelyet az apoptotikus sejtek (Annexin V+) számszerűsítése követett. (b) A PARP és a hasított kaszpáz-3 Western blot analízise kontroll és DDRGK1-knockdown MCF7 és HepG2 sejtekben az a) pontban leírtak szerint. (c,d) A BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 és Bcl-2 relatív mRNS expressziós szintjének Q-PCR analízise kontroll és DDRGK1-knockdown MCF7 és HepG2 sejtekben. (e,f) A BiP, HSPA8 és CHOP relatív mRNS-expressziós szintjének Q-PCR-analízise kontroll és DDRGK1-knockdown MCF7 és HepG2 sejtekben. Minden adatot három kísérlet átlaga±s.d. értékeként mutatunk be. *P<0,05, **P<0,01 és ***P<0,001 Student’s t-próbával.

A DDRGK1 ER stresszválaszban való részvételének további megerősítésére meghatároztuk a DDRGK1 hatását a sejtek túlélésére az ER stressz indukáló thapsigargin (Tg) és tunicamycin (Tm) kezelés után. A DDRGK1 lekoppintása mind a HepG2, mind az MCF7 sejtekben fokozta az ER stressz által indukált apoptózist Tg kezelés hatására, amit Annexin V/PI festéssel és a kaszpáz-3 és PARP hasadással értékeltünk (2a-c ábra és 1A-C kiegészítő ábra). Ezzel szemben a DDRGK1 túlterjedése csökkentette az ER stressz által kiváltott sejthalált a HepG2 sejtekben (2d-f ábra). Ezenkívül az MCF7 sejtek életképességét MTT-teszttel vizsgáltuk, és az eredmények azt mutatták, hogy a DDRGK1 kiütése érzékenyebbé tette a sejteket a Tg- vagy Tm-kezelésre, csökkentett sejtéletképességgel (1D. kiegészítő ábra), míg a DDRGK1 túltermelése elősegítette a sejtek túlélését Tg- vagy Tm-kezelés után (1E. kiegészítő ábra). Összességében eredményeink arra utalnak, hogy a DDRGK1 létfontosságú szerepet játszik az ER homoosztázis szabályozásában.

(a). A HepG2 sejteket kontroll siRNS-szel vagy DDRGK1 elleni siRNS-szel transzfektáltuk 72 órán keresztül, majd a sejteket 24 órán keresztül DMSO-val (vehicle control) vagy Tg-vel (2,5 μM) kezeltük a betakarítás előtt. A sejteket Annexin V-vel és PI-vel festettük, majd áramlási citometriai elemzést végeztünk. (b). Az apoptotikus sejtek (Annexin V+) számszerűsítése az a-ban. (c) A PARP és a hasított kaszpáz-3 Western blot analízise az a-ban leírt HepG2 sejtekben. (d) A HepG2 sejteket kontroll vektorral vagy DDRGK1-gyel transzfektáltuk 36 órán keresztül, majd a sejteket 24 órán keresztül DMSO-val vagy Tg-vel (2,5 μM) kezeltük a betakarítás előtt. A sejteket Annexin V-vel és PI-vel festettük, majd áramlási citometriai elemzést végeztünk. (e) Az apoptotikus sejtek (Annexin V+) számszerűsítése a d. (f) A PARP és a hasított kaszpáz-3 Western blot analízise a d. pontban leírt HepG2 sejtekben. Minden adat három kísérlet átlaga±s.d. értékeként szerepel. **P<0,01 és ***P<0,001 Student’s t-próbával.

DDRGK1 modulálja az UPR-t

Hogy megértsük, hogyan szabályozza a DDRGK1 az ER homoosztázist, először három UPR-szenzor és downstream célpontjaik fehérjeszintjének változását elemeztük DDRGK1-depletált sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy a DDRGK1 knockdownja MCF7 és HepG2 sejtekben jelentősen csökkentette a teljes IRE1α szintjét, de gyengén csökkentette a foszforilált IRE1α (p-IRE1α) szintjét, ami a teljes IRE1α csökkent szintje miatt lehetett (3a. ábra). Az ATF6 és a hasított ATF6 szintje nem változott (3a. ábra). Érdekes módon a DDRGK1 kopogtatása nem befolyásolta a teljes PERK szintjét, de a foszforilált PERK (p-PERK) és a BiP szintje jelentősen megnőtt (3a. ábra). Ezután megvizsgáltuk a DDRGK1 depletió hatását az IRE1α szubsztrát XBP1-re. Az eredmények azt mutatták, hogy az XBP1s, az XBP1 splicelt formája jelentősen csökkent a DDRGK1-knockdown MCF7 sejtekben időfüggő módon (3b. ábra), ami korrelált az IRE1α fehérjeszint változásával (2A. kiegészítő ábra). Ezenkívül a DDRGK1 depletiója növelte az eIF2α foszforiláció (p-eIF2α) és a CHOP expresszió szintjét mind az MCF7, mind a HepG2 sejtekben (Kiegészítő ábra 2B). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a DDRGK1 depletiója elnyomja az UPR-IRE1α jelátvitelt és aktiválja az UPR-PERK apoptotikus útvonalat, ami következésképpen apoptózist vált ki, amint azt az 1. és 2. ábrán megfigyeltük. Az IRE1α szintje azonban a DDRGK1-et túlexprimáló sejtekben dózisfüggő módon emelkedett (3c. ábra), míg a p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP és az XBP1 spliced formájának szintje nem változott jelentősen (3c. ábra; 2C és D kiegészítő ábra). A DDRGK1 és az UPR közötti funkcionális kapcsolat feltárása érdekében felmértük az IRE1α és a PERK dinamikus változásait DDRGK1-knockdown MCF7 sejtekben és kontroll sejtekben a Tg kezelést követően különböző időpontokban. A Tg-kezelés a várakozásoknak megfelelően növelte az IRE1α és a p-IRE1α, a p-PERK és a BiP szintjét a kontroll sejtekben. A teljes IRE1α szintje azonban jelentősen csökkent (0-24 h), míg a p-IRE1α szintje mérsékelten csökkent (4-24 h) a DDRGK1-depletált sejtekben a kontroll sejtekhez képest (3d. ábra). Ezzel párhuzamosan az XBP1s szintje is csökkent a DDRGK1-depletált sejtekben a kontroll sejtekhez képest (4-12 h) (3e. ábra). A teljes PERK szintje nem változott, de a p-PERK szintje jelentősen megnőtt a DDRGK1-depletált sejtekben (0-12 h) (3d. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk HepG2 sejtekben is (2E és F kiegészítő ábra). Összességében eredményeink arra utalnak, hogy a DDRGK1 depletiója IRE1α degradációt és PERK aktivációt okoz.

(a) Az MCF7 és HepG2 sejteket kontroll siRNS-szel vagy DDRGK1-et célzó siRNS-szel transzfektáltuk 72 órán keresztül. A p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 és BiP fehérjeszintjét western blot segítségével határoztuk meg. (b) Az MCF7 sejteket kontroll siRNS-szel vagy DDRGK1 elleni siRNS-szel transzfektáltuk, majd a sejteket a jelzett időpontokban betakarítottuk az XBP-1 splicing RT-PCR analíziséhez. (c) MCF7 és HepG2 sejteket kontroll vagy DDRGK1 vektorokkal transzfektáltunk különböző dózisokban 36 órán keresztül. A p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK és ATF6 fehérjeszintjét Western blot segítségével határoztuk meg. (d) Az MCF7 sejteket kontroll siRNS-sel vagy DDRGK1-et célzó siRNS-sel transzfektáltuk 72 h. A sejteket a jelzett időpontokban 2,5 μM Tg-vel történő kezelés után gyűjtöttük össze western blothoz. (e) Az XBP-1 splicing RT-PCR analízise d. *Nem specifikus sávot jelöl.

A DDRGK1 az IRE1α

célzásával szabályozza az UPR-t. Az UPR-t az ER stressz szenzorok indítják be ER stressz esetén az ER homoosztázis szabályozása céljából8. Arról számoltak be, hogy az IRE1α hepatocita-specifikus deléciója egerekben az UPR-PERK útvonal aktiválódását eredményezte23. Annak eldöntésére, hogy a DDRGK1-depletált sejtekben megfigyelt p-PERK indukciót az IRE1α csökkent szintje közvetíti-e, megvizsgáltuk a p-PERK, a PERK és downstream célpontjainak szintjét IRE1α-depletált sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy az IRE1α kiütése jelentősen megnövelte a p-PERK és a p-eIF2α fehérjeszintjét mind az MCF7, mind a HepG2 sejtekben (4a. ábra), hasonlóan a DDRGK1-depletált sejtekben megfigyeltekhez (3a. ábra; 2B. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a DDRGK1 az IRE1α megcélzásával szabályozza az UPR-t. Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a DDRGK1 hogyan szabályozza az IRE1α-t. Eredményeink azt mutatták, hogy az IRE1α fehérjeszintje, de nem az mRNS-szintje (Kiegészítő ábra 3A) drámaian csökkent a DDRGK1-knockdown sejtekben (3a. ábra). A sejtek MG132 proteaszóma-inhibitorral történő kezelése blokkolta az IRE1α fehérje DDRGK1 által közvetített csökkenését (4b. ábra; 3B. kiegészítő ábra). Megfigyeltük továbbá, hogy a DDRGK1 depletiója drámaian csökkentette az IRE1α felezési idejét cikloheximid üldözési tesztben (4c. ábra). Ezekkel a megfigyelésekkel összhangban azt találtuk, hogy az IRE1α ektopikus expressziója mind a DDRGK1-depletált MCF7-, mind a HepG2-sejtekben javította a sejtek túlélését a kontrollsejtekhez képest, amelyet Annexin V/PI festéssel és kaszpáz-3 aktivációval jellemeztünk (4d,e ábra; 3C és D kiegészítő ábra). Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a DDRGK1 szabályozza az IRE1α stabilitását, és ezáltal szabályozza az UPR-t.

(a). Az MCF7 és HepG2 sejteket kontroll siRNS-szel vagy az IRE1α-t célzó siRNS-szel transzfektáltuk 72 órán keresztül. A p-PERK, PERK, p-eIF2α és eIF2α fehérjeszintjét western blot segítségével határoztuk meg. (b). Az IRE1α Western blot analízise kontroll és DDRGK1-knockdown MCF7 sejtekben, amelyeket MG132-vel (20 μM, 8 h) vagy anélkül kezeltek. (c). Az IRE1α bomlásának Western blot analízise kontroll és DDRGK1-knockdown MCF7 sejtekben 100 μg ml-1 cikloheximiddel történő kezelés után a jelzett ideig. A grafikon az IRE1α fehérjeszintek számszerűsítését mutatja. (d) Az MCF7 sejteket kontroll siRNS-szel vagy DDRGK1-et célzó siRNS-szel transzfektáltuk 72 órán keresztül. A betakarítás előtt a DDRGK1-knockdown sejteket kontroll vagy IRE1α vektorokkal transzfektáltuk 36 órán keresztül. A sejteket ezt követően Annexin V-vel és PI-vel festettük, majd áramlási citometriai elemzésnek vetettük alá, amelyet az apoptotikus sejtek (Annexin V+) számszerűsítése követett. Minden adatot három kísérlet átlaga±s.d. értékeként mutatunk be. *P<0,05 Student’s t-próbával. (e) Az IRE1α Western blot analízise MCF7 sejtekben d.

DDRGK1 kölcsönhatásba lép az IRE1α-val

Megértendő, hogy a DDRGK1 hogyan szabályozza az IRE1α stabilitását, HEK293T sejtekben végzett reciprok immunprecipitációs (IP) próbával vizsgáltuk, hogy a DDRGK1 kölcsönhatásba lép-e az IRE1α-val. Az eredmények azt mutatták, hogy az exogén módon expresszált Flag-IRE1α specifikusan kölcsönhatásba lépett az endogén DDRGK1 és BiP-vel (5a. ábra). Következésképpen az exogén módon expresszált Flag-DDRGK1 specifikusan kölcsönhatott az endogén IRE1α-val és az ismert DDRGK1-asszociált C53 fehérjével (14. hivatkozás). A Flag-DDRGK1 immunprecipitátumokban azonban nem tudtuk kimutatni a BiP-t (5b. ábra), ami arra utal, hogy a DDRGK1 esetleg nem lép közvetlen kölcsönhatásba a BiP-vel. Az IRE1α, mint endogén ER-asszociált degradációs (ERAD) szubsztrát, az IRE1α és a Sel1L-Hrd1 ERAD-komplex közötti társulás révén BiP-függő módon bomlik le24. Ezért megvizsgáltuk, hogy a BiP részt vesz-e a DDRGK1 és az IRE1α közötti kölcsönhatásban. Az eredmények azt mutatták, hogy a DDRGK1 és az IRE1α közötti kölcsönhatást nem befolyásolta a BiP kiütése (4. kiegészítő ábra). A DDRGK1 és az IRE1α kölcsönhatásának további megerősítése érdekében immunfluoreszcens festési kísérleteket végeztünk. Az eredmények azt mutatták, hogy ez a két fehérje ko-lokalizálódott az ER-ben (5c. ábra). Az IRE1α és a DDRGK1 kölcsönhatásában részt vevő régió feltérképezéséhez a Flag-IRE1α vad típusú és csonka mutánsait a DDRGK1-gyel együtt HEK293T sejtekbe ko-transzfektáltuk, és az IP eredmények azt mutatták, hogy az IRE1α citoplazmatikus kináz doménje szükséges a DDRGK1-gyel való kölcsönhatáshoz (5d. ábra). A DDRGK1 és az IRE1α közötti kölcsönhatás dinamikus változásainak megértéséhez ER stressz körülmények között a HEK293T sejteket Flag-DDRGK1 transzfektáltuk és különböző időpontokban Tg-vel kezeltük. A várakozásoknak megfelelően megfigyeltük, hogy a teljes IRE1α, a p-IRE1α és a BiP jelentősen megnövekedett ER stressz alatt. Érdekes módon azt találtuk, hogy a DDRGK1 specifikusan kölcsönhatásba lépett a foszforilálatlan IRE1α-val, de nem a p-IRE1α-val az immunprecipitátumokban (5e. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a DDRGK1 kölcsönhatásba lép a nem-foszforilált IRE1α-val és fenntartja annak stabilitását.

(a). Flag M2 affinitás gélből származó immunprecipitátumok Western blot analízise Flag-Vector vagy Flag-IRE1α vektorokkal 36 órán keresztül transzfektált HEK293T sejtekben. (b). Flag M2 affinitási gél immunprecipitátumainak Western blot analízise Flag-Vector vagy Flag-DDRGK1 vektorral 36 órán keresztül transzfektált HEK293T sejtekben. (c). Az MCF7 sejteket kétszeresen immunfestettük anti-DDRGK1 antitesttel (zöld) és anti-IRE1α antitesttel (piros). A sejtmagokat DAPI-val (kék) ellenfestettük. A két endogén fehérje, a DDRGK1 és az IIRE1α közötti ko-lokalizáció az egyesített panelen látható. Méretsáv, 20 μm. (d) Az IRE1α vad típusú és csonka konstrukciók sémái és a Flag M2 affinitásgél immunprecipitátumainak Western blot analízise Flag-vektorral vagy Flag-IRE1α vad típusú és csonka konstrukciókkal transzfektált HEK293T sejtekben. (e) Flag M2 affinitási gél immunprecipitátumok Western blot analízise mock- vagy Tg-kezelt (2,5 μM) Flag-Vektort vagy Flag-DDRGK1-et expresszáló HEK293T sejtekben.

A DDRGK1 és az IRE1α kölcsönhatásához szükséges az Ufm1

Egy közelmúltbeli tanulmány kimutatta, hogy a DDRGK1 ufmilációs szubsztrát és szükséges az ASC1 ufmilációjához15,20. Annak vizsgálatára, hogy az ufmiláció részt vesz-e az IRE1α stabilitásának DDRGK1 általi szabályozásában, megvizsgáltuk, hogy az Ufm1 depletió befolyásolja-e az IRE1α fehérje expresszióját. A DDRGK1 depletiójához hasonlóan megfigyeltük, hogy az Ufm1 expressziójának knockdownja drámaian csökkentette az IRE1α fehérje szintjét (6a. ábra), ami arra utal, hogy a DDRGK1 az ufmiláción keresztül szabályozza az IRE1α-t. Következésképpen azt találtuk, hogy a DDRGK1 túlterjedése nem stabilizálta az IRE1α fehérjét az Ufm1-knockdown MCF7 sejtekben a kontroll sejtekhez képest (6b. ábra). Ezenkívül az IRE1α fehérje szintje drámaian csökkent az Ufm1-knockdown MCF7 sejtekben mind Tg hiányában, mind jelenlétében (6c. ábra), ami arra utal, hogy az ufmiláció szükséges az IRE1α fehérje stabilitásának DDRGK1 általi szabályozásához. Ezután arra voltunk kíváncsiak, hogy az IRE1α ki van-e téve az ufmilációs módosításnak. E kérdés megválaszolásához az IRE1α ufmilációját a DDRGK1 és Ufm1, valamint az UBA5 (E1), UFC1 (E2) és UFL1 (E3) expresszáló sejtekben detektáltuk a korábban leírtak szerint20. Nem tudtuk azonban kimutatni az IRE1α fehérje ufmilációját, bár a DDRGK1 fehérje ufmilációja könnyen kimutatható volt, ahogyan azt korábban leírtuk (az adatok nem láthatóak)15,20,25 , ami arra utal, hogy az IRE1α nem lehet az ufmiláció célpontja. Érdekes módon azt találtuk, hogy a DDRGK1 és az IRE1α közötti társulás jelentősen csökkent az Ufm1-knockdown HEK293T sejtekben a kontroll sejtekhez képest (6d. ábra). Ezzel a megfigyeléssel összhangban azt találtuk, hogy a DDRGK1 K267R (egy ufmilációban hiányos DDRGK1 mutáns, amelyben a 267-es lizinmaradékot argininmaradékkal helyettesítettük)15 és az IRE1α kölcsönhatása drámaian csökkent a vad típusú DDRGK1-hez képest (6e. ábra), ami azt jelzi, hogy a DDRGK1 ufmilációja szükséges a DDRGK1 és az IRE1α közötti társuláshoz. Továbbá a DDRGK1 K267R nem stabilizálta az IRE1α fehérjét a vad típusú DDRGK1-hez képest (6f. ábra). Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a DDRGK1 K267-es ufmilációja szükséges az IRE1α-val való kölcsönhatásához és az IRE1α fehérje stabilitásának szabályozásához.

(a) Az MCF7 sejteket kontroll siRNS-sel vagy Ufm1-et célzó siRNS-sel transzfektáltuk 72 órán keresztül. Az IRE1α fehérjeszintjét western blot segítségével határoztuk meg. (b) Az IRE1α Western blot analízise kontroll és Ufm1-knockdown vektort vagy DDRGK1-et expresszáló MCF7 sejtekben. (c) Az IRE1α fehérjeszintjét western blot segítségével határoztuk meg kontroll és Ufm1-knockdown MCF7 sejtekben, miután 2,5 μM Tg-vel kezeltük őket a jelzett ideig. (d) Flag M2 affinitás gél immunprecipitátumok Western blot analízise HEK293T kontroll és Flag-vektort vagy Flag-DDRGK1-et expresszáló Ufm1-knockdown sejtekben. (e) Flag M2 affinitás gél immunprecipitátumok Western blot analízise Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT vagy K267R mutánssal transzfektált HEK293T sejtekben. (f) Az IRE1α Western blot analízise Flag-Vectorral, Flag-DDRGK1 WT-vel vagy K267R mutánssal transzfektált MCF7 sejtekben.

A DDRGK1 szükséges a HSC rekonstitúciós képességhez egerekben

Egy nemrégiben végzett tanulmány szerint a vérképző őssejtek (HSC-k) rendkívül érzékenyek az ER stresszre26. Ez arra engedett következtetni, hogy a DDRGK1 kritikus szerepet játszhat a HSC működésében. Először meghatároztuk a DDRGK1 expressziós szintjét több vérképzőszervi vonalban 2 hónapos vad típusú egerekből. A Q-PCR szignifikánsan magasabb DDRGK1-expressziós szintet mutatott ki a HSC-kben, beleértve a hosszú távú HSC-ket (LT-HSC-k), a rövid távú HSC-ket (ST-HSC-k) és a multipotens progenitorokat (MPP-k) (7a. ábra). Ezenkívül a DDRGK1 fehérjeszintje magasan kifejeződött a HSC-vel dúsított Lineage-c-Kit+ csontvelő (BM) sejtekben a Lineage+c-Kit- BM sejtekhez képest (7b. ábra). Ezek a megfigyelések a DDRGK1 fontos szerepére utalnak az őssejtekben. A DDRGK1 HSC funkcióban betöltött szerepének vizsgálatára kompetitív transzplantációs kísérleteket végeztünk a DDRGK1 lentivirális knockdownját követő HSC-kkel (7c. ábra). A CD45.1 donor egerekből származó Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) sejteket kontroll vagy DDRGK1-knockdown lentivírussal transzdukáltuk és letálisan besugárzott CD45.2 recipiens egerekbe transzplantáltuk. Az áramlási citometriai elemzés azt mutatta, hogy a donorból származó perifériás vér (PB) sejtek százalékos aránya jelentősen csökkent a DDRGK1-knockdown csoportban a kontrollhoz képest, ami azt jelzi, hogy a DDRGK1 kopogtatása jelentősen rontotta a HSC-k kompetitív rekonstitúciós képességét (7d. ábra). Míg a nem kompetitív transzplantációs kísérletben a DDRGK1-knockdown HSC-kkel transzplantált recipiens egerek még 3 hónappal a transzplantáció után is életben voltak, ez arra utal, hogy a DDRGK1 kopogtatása csupán a HSC-k kompetitív rekonstitúciós képességét rontotta. Az off-target hatások kizárása érdekében egy másik, DDRGK1-et célzó shRNS-t terveztünk, és hasonló eredményeket figyeltünk meg (5A. kiegészítő ábra). Három hónappal a transzplantáció után a recipiens egereket elaltattuk a BM-analízishez és az in vitro kolóniaképző vizsgálatokhoz. Az áramlási citometriai elemzés azt mutatta, hogy a DDRGK1 kopogtatása drámaian rontotta a transzdukált HSC-k fenntartását anélkül, hogy befolyásolta volna a vonalpotenciáljukat (azaz a myeloid, B-sejt és T-sejt vonalakat), amit a donorból származó vérképző ős- és progenitor sejtek, valamint a differenciált vérképző sejtek csökkent gyakorisága jelzett a BM-ben és a PB-ben (7e. ábra). Hasonló eredményt figyeltünk meg egy független kísérletben, amelyben egy másik, DDRGK1-et célzó shRNS-t használtunk (5B. kiegészítő ábra). Ezenkívül a recipiens egerekből donorból származó CD34-Flt3-LSK sejteket (LT-HSC-k) izoláltunk, és egysejtes kolóniaképző vizsgálatot végeztünk. Az eredmények azt mutatták, hogy a DDRGK1 kopogtatása csökkentette a HSC-k azon képességét, hogy intermedier és nagy kolóniákat képezzenek (7f. ábra). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a DDRGK1 szükséges a HSC-funkció fenntartásához.

(a) Q-PCR analízis a DDRGK1 relatív mRNS expressziós szintjéről a fiatal vad típusú egerek (2 hónapos, n=3) BM jelzett alpopulációiban. A DDRGK1 relatív expresszióját a GAPDH-hoz normalizáltuk. Az adatok átlag±s.d. (b) A DDRGK1 Western blot analízise fiatal vad típusú egerek (2 hónapos) dúsított Lineage+ c-Kit- és Lineage- c-Kit+ sejtjeiben. (c) A rekonstitúciós vizsgálat kísérleti sémája. (d) Reprezentatív FACS-mintázat, amely a GFP-pozitív sejtek százalékos arányát mutatja a donorból származó kontroll (sh-Vektor) vagy DDRGK1-knockdown (sh-DDRGK1) PB sejtekben (bal oldali panel). Az értékek a donorból származó GFP+ sejtek normalizált százalékos arányát jelentik a teljes beültetésen belül (jobb oldali panel, n=3). Az adatok átlag±s.d. **P<0,01 és ***P<0,001 Student’s t-próbával. (e) Az értékek a donorból származó GFP+ sejtek százalékos arányát mutatják LT-HSC (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, T és myeloid vonalú sejtpopulációk az elsődleges recipiens egerek BM-ében 12 héttel a transzplantáció után (n=3). Az adatok átlag±s.d. ***P<0,001 Student’s t-próbával. (f) A recipiens egerekből származó egyes, donorból származó GFP+ LT-HSC-ket 96 lyukú lemezekbe válogattuk és 14 napig in vitro tenyésztettük. A kolóniák százalékos arányát úgy számoltuk ki, hogy a kolóniák számát elosztottuk a beültetett egyedi sejtek eredeti számával. Az adatok átlag±s.d. **P<0,01 Student’s t-próbával.

Hogy megvizsgáljuk, hogy a károsodott HSC funkció a csökkent homing hatékonyság miatt következett-e be, kontroll vagy sh-DDRGK1 lentivírussal transzdukált, 2 hónapos egerekből tisztított LSK sejteket jelöltünk fluoreszcens festékkel (lila), majd letálisan besugárzott recipiensekbe injektáltuk őket. A transzplantáció után 18 órával a recipiens BM-ben jelenlévő jelölt LSK sejtek százalékos arányát áramlási citometriával elemeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy a DDRGK-knockdown LSK-sejtek homingképessége hasonló volt a kontrollsejtekéhez (6A és B kiegészítő ábra). Annak megállapítására, hogy a DDRGK1 kopogtatása hatással van-e az LSK sejtek sejtciklus-státuszára, a donorból származó kontroll és DDRGK1 kopogtatású LSK sejteket a Ki67 proliferációs markerrel és DAPI-val festettük, és nem találtunk jelentős különbséget a DDRGK1 kopogtatású HSC-k és a kontroll HSC-k sejtciklus-profilja között (7A. kiegészítő ábra). Ezután a DDRGK1-knockdown hatását vizsgáltuk a HSC-k apoptózisára Annexin V festéssel, és a donorból származó DDRGK1-knockdown LSK sejtekben szignifikánsan nagyobb apoptózis gyakoriságot találtunk a kontroll LSK sejtekhez képest; ez a jelenség mindkét DDRGK1-et célzó shRNS esetében megfigyelhető volt (8a. ábra; 7B. kiegészítő ábra). Ezután megvizsgáltuk a reaktív oxigénfajok (ROS) szintjét a transzdukált HSC-kben. Az eredmények azt mutatták, hogy a ROS-szint hasonló volt a kontroll és a DDRGK1-knockdown csoportok között (7C. kiegészítő ábra). A fenti megfigyelések alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a DDRGK1 kopogtatása a HSC-kben apoptotikus sejthalált indukált, ezáltal károsítva a HSC funkciót.

(a) Reprezentatív FACS-mintázat, amely az Annexin V-pozitív sejtek százalékos arányát mutatja a donorból származó kontroll és DDRGK1-knockdown LSK sejteken belül a transzplantációt követően (bal panel). Az oszlopdiagram az Annexin V-pozitív sejtek százalékos arányát mutatja az LSK-sejteken belül (jobb oldali panel, n=3). Az adatok átlag±s.d. *P<0,05 Student’s t-próbával. (b) A DDRGK1, BiP és CHOP relatív mRNS expressziós szintjének Q-PCR analízise a donorból származó kontroll és DDRGK1-knockdown LSK sejtekben a transzplantációt követően (n=3). Az adatok átlag ± s.d. **P<0,01 és ***P<0,001 Student’s t-próbával. (c) A p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK és ATF6 Western blot analízise a kontroll vagy DDRGK1-knockdown recipiens egerekből dúsított, donorból származó GFP+Lineage-c-Kit+ sejtekben. *Nem specifikus sávot jelöl. (d) Az XBP-1 splicing RT-PCR analízise a donorból származó kontroll és DDRGK1-knockdown LSK sejtekben a transzplantációt követően. A Tg-kezeléssel kezelt MEF sejtek XBP-1 splicing kontrollként szolgáltak.

Hogy megvizsgáljuk, hogy a DDRGK1-knockdown HSC-kben a károsodott HSC-funkció az ER stresszválasz aktiválódása miatt következett-e be, Q-PCR segítségével elemeztük a BiP és CHOP expressziós szintjét a kontroll és DDRGK-knockdown beültetett HSC-kben, az eredmények azt mutatták, hogy a BiP és CHOP mRNS-szintje jelentősen megnőtt a DDRGK1-knockdown HSC-kben (8b. ábra). Ezenkívül megvizsgáltuk az ER stressz szenzorok fehérjeszintjét a kontroll és a DDRGK-knockdown Lineage-c-Kit+ BM sejtekben. A rákos sejtvonalakban végzett megfigyeléssel összhangban a DDRGK1 knockdown az IRE1α és a p-IRE1α csökkent fehérjeszintjét és a p-PERK megnövekedett szintjét mutatta, míg az ATF6 szintje nem különbözött a kontroll és a DDRGK1-knockdown csoportokban (8c. ábra). Következésképpen az XBP1s szintje csökkent a donorból származó DDRGK1-knockdown LSK sejtekben (8d. ábra). Összességében ezek az eredmények azt jelzik, hogy a DDRGK1 kopogtatása csökkentette az IRE1α jelátvitelt, de aktiválta a PERK útvonalat, és tovább támasztják alá, hogy a DDRGK1 kritikus az ER homoosztázis megfelelő fenntartásához, és ezáltal elengedhetetlen a HSC-k túléléséhez és fenntartásához.