Construction du plasmide

Chaque scFv chimérique anti-HA testé dans cette étude a été construit en greffant six boucles CDR d’un anticorps anti-HA 12CA5 sur chaque échafaudage scFv sélectionné. Le plasmide \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{HA}}}}\) a été construit en deux étapes : (1) un gblock scFv greffé par une boucle CDR et un vecteur 15F11 mintbody H4K20me138 linéarisé par des sites de restriction EcoRI ont été ligaturés par assemblage Gibson (mélange maître préparé par House) ; (2) le lieur reliant le scFv et l’EGFP, ainsi que l’EGFP, ont été remplacés par un gblock codant pour un lieur flexible (G4S) × 5 et la mEGFP par assemblage Gibson à travers des sites de restriction NotI. Pour les quatre autres plasmides scFv chimériques, chaque gblock scFv greffé par une boucle CDR a été ligaturé dans le vecteur \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{HA}}}}\) linéarisé par des sites de restriction EcoRI par assemblage Gibson.

Le plasmide cible 1 × HA-mCh-H2B a été construit en remplaçant le sfGFP d’un plasmide Addgene sfGFP-H2B (Plasmid # 56367) par un gblock mCherry marqué par un épitope 1 × HA dans lequel un site de restriction NotI a été inséré entre l’épitope 1 × HA et le mCherry pour le clonage suivant. La construction 4 × HA-mCh-H2B a été réalisée en remplaçant l’étiquette 1 × HA de la construction 1 × HA-mCh-H2B par un bloc g 4 × HA-épitope à travers les sites de restriction AgeI et NotI. Le 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) a été construit en remplaçant l’étiquette 1 × HA de la construction 1 × HA-mCh-H2B par le smHA amplifié à partir d’un plasmide Addgene smHA-KDM5B-MS2 (Plasmide # 81085) en utilisant les amorces NZ-098 et 099 (toutes les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1). Le smHA-H2B a été construit en remplaçant le 1 × HA-mCh de la construction 1 × HA-mCh-H2B par le smHA amplifié à partir du plasmide smHA-KDM5B-MS2 en utilisant les amorces NZ-098 et 100.

Un autre plasmide cible 4 × HA-mCh-β-actine a été construit en remplaçant le H2B de la construction 4 × HA-mCh-H2B par un amplicon de β-actine via les sites de restriction BglII et BamHI. L’amplicon de β-actine a été amplifié à partir d’un plasmide Addgene smFlag-ActinB-MS2 (Plasmide # 81083) en utilisant les amorces NZ-073 et NZ-074.

Le plasmide 4 × HA-mRuby-Kv2.1 a été généré en amplifiant d’abord le tag 4 × HA de 4 × HA-mCh-H2B en utilisant les amorces NZ-105 et 106. Ensuite, l’amplicon 4 × HA a été introduit dans un plasmide publiéCMV-mRuby2-Kv2.161 (un don du Dr Michael Tamkun), qui avait été linéarisé par une digestion de restriction avec AgeI, en utilisant l’assemblage Gibson. Le plasmide smHA-Kv2.1 a été généré par amplification PCR de la séquence codante de Kv2.1 de rat à partir de pBK-Kv2.140 et par ligature ultérieure dans les sites de restriction AsiSI et PmeI sur le plasmide smHA-KDM5B-MS2 en utilisant les amorces Kv2.1-1 et 2.

La H2B-mCh-1 × HA a été construite en deux étapes : (1) remplacer l’étiquette 1 × HA de la 1 × HA-mCh-H2B par H2B par l’intermédiaire des sites AgeI et NotI, dans lequel le H2B a été amplifié à partir de la 1 × HA-mCh-H2B en utilisant les amorces NZ-092 et 093 ; (2) remplacer le H2B à l’extrémité C-terminale du mCherry par une étiquette 1 × HA par l’intermédiaire des sites BglII et BamHI, dans lequel l’étiquette 1 × HA a été synthétisée par PCR chevauchante avec les amorces NZ-094 et 095. Le Mito-mCh-1 × HA a été construit en remplaçant le H2B dans le H2B-mCh-1 × HA par le gblock23 de Mito via les sites AgeI et NotI. Le Mito-mCh-smHA a été construit en remplaçant le tag 1 × HA du Mito-mCh-1 × HA par le smHA amplifié à partir du smHA-KDM5B-MS2 en utilisant les amorces NZ-096 et 097. Le mCh-H2B a été généré en remplaçant le sfGFP du plasmide sfGFP-H2B par un gblock mCherry en utilisant l’assemblage Gibson.

Les plasmides FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP ont été construits en remplaçant la mEGFP de \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{HA}}}}\) par des gblocks mCherry, HaloTag, et SNAP-tag, respectivement.

pET23b-FB-GFP, le plasmide pour l’expression et la purification des frankenbody recombinants, a été assemblé par Gibson avec un amplicon FB-GFP et un plasmide publié pET23b-Sso7d62,63 linéarisé par les sites de restriction NdeI et NotI. L’amplicon FB-GFP a été amplifié à partir de \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{HA}}}}\) par PCR avec les amorces NZ-075 et 077.

Pour le test de traduction, les constructions rapporteurs smHA-KDM5B-MS2 et SunTag-kif18b ont été obtenues auprès d’Addgene (Plasmid # 81085 et # 74928), et le plasmide SunTag scFv (Plasmid # 60907) a été modifié en retirant l’épitope HA codé dans le linker. L’épitope HA a été retiré par mutagenèse dirigée par site avec QuikChange Lightning (Agilent Technologies) selon les instructions du fabricant en utilisant les amorces HAout-1 et 2.

Les blocs g ont été synthétisés par Integrated DNA Technologies et les plasmides recombinants ont été vérifiés en termes de séquence par Quintara Biosciences. Les séquences des amorces sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1. Tous les plasmides utilisés pour la traduction d’images ont été préparés par le kit NucleoBond Xtra Midi EF (Macherey-Nagel) avec une concentration finale d’environ 1 mg mL-1.

Culture cellulaire U2OS

Les cellules U2OS (ATCC HTB-96) ont été cultivées dans un incubateur à 37 °C, humidifié, avec 5% de CO2 dans un milieu DMEM (Thermo Scientific) complété par 10% (v/v) de sérum bovin fœtal (Altas Biologicals), 1 mM l-glutamine (Gibco) et 1% (v/v) de pénicilline-streptomycine (Gibco ou Invitrogen).

Transfection et chargement des billes

Pour le suivi de la localisation des protéines, les cellules ont été placées dans une chambre MatTek de 35 mm (MatTek) 2 jours avant l’imagerie et ont été transfectées transitoirement avec le réactif LipofectamineTM LTX avec le réactif PLUS (Invitrogen) selon les instructions du fabricant 18-24 h avant l’imagerie.

Pour l’imagerie de la traduction avec l’ARNm marqué par la protéine MCP-Halo, les cellules ont été placées dans une chambre MatTek de 35 mm (MatTek) le jour précédant l’imagerie. Le jour de l’imagerie, avant le chargement des billes, le milieu de la chambre MatTek a été changé en Opti-MEM (Thermo Scientific) avec 10% de sérum bovin fœtal. Un mélange de plasmides (smHA-KDM5B-MS2/FB) et la protéine MCP-HaloTag purifiée17 ont été chargés en billes comme décrit précédemment6,17,26. En bref, après avoir retiré l’Opti-medium de la chambre MatTek, 4 µL d’un mélange de plasmides (1 µg chacun) et de MCP-HaloTag (130 ng) dans du PBS ont été pipetés sur les cellules et des billes de verre de ~106 µm (Sigma Aldrich) ont été uniformément réparties sur le dessus. La chambre a ensuite été tapée fermement sept fois, et Opti-medium a été ajouté aux cellules. 3 h après le chargement des billes, les cellules ont été colorées dans 1 mL de 0,2 nM de ligand JF646-HaloTag48 dilué dans du DMEM complet sans phénol rouge. Après une incubation de 20 minutes, les cellules ont été lavées trois fois dans du DMEM complet sans phénol rouge pour éliminer les billes de verre et les colorants non liés. Les cellules étaient alors prêtes pour l’imagerie.

Pour l’imagerie de translation sans marquage ARNm, les cellules plaquées sur une chambre MatTek ont été transfectées transitoirement avec les plasmides nécessaires, smHA-KDM5B-MS2/FB avec ou sans SunTag-kif18b/Sun (avec l’épitope HA retiré), en utilisant le réactif LipofectamineTM LTX avec le réactif PLUS (Invitrogen) selon les instructions du fabricant le jour de l’imagerie. 3 h après la transfection, le milieu a été remplacé par du DMEM complet sans phénol rouge. Les cellules étaient alors prêtes pour l’imagerie.

Purification de FB-GFP

Les cellules E. coli BL21 (DE3) pLysS transformées avec pET23b-FB-GFP ont été cultivées à 37 °C jusqu’à une densité de OD600 0,6 dans un milieu 2xYT contenant de l’ampicilline (100 mg L-1) et du chloramphénicol (25 mg L-1) sous agitation. De l’isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG) a été ajouté pour induire l’expression des protéines à une concentration finale de 0,4 mM, et la température a été abaissée à 18 °C. Les cellules ont été récoltées après 16 h par centrifugation et remises en suspension dans un tampon PBS complété par 300 mM de NaCl, des inhibiteurs de protéase (ThermoFisher), 0,2 mM d’AEBSF (20 mL L-1 de culture) et lysées par sonication. Le lysat a été clarifié par centrifugation. Le surnageant a été chargé sur deux colonnes HisTrap HP de 5 mL (GE Healthcare) connectées, lavées et éluées par un gradient linéaire de 0-500 mM d’imidazole. Les fractions contenant le POI ont été regroupées, concentrées à l’aide d’un filtre centrifuge Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO (EMD Millipore) et chargées sur une colonne à exclusion de taille HiLoad Superdex 200 PG (GE Healthcare) dans un tampon à base de HEPES (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glycérol et 1 mM DTT). Les fractions contenant la protéine FB-GFP ont été collectées, concentrées et stockées à -80 °C après une congélation rapide par azote liquide.

Immunostaining

Les cellules U2OS ont été transfectées de manière transitoire avec 4 × HA-mCh-H2B ou 4 × HA-mCh-β-actine avec le réactif LipofectamineTM LTX avec le réactif PLUS (Invitrogen). 26 h après la transfection, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (Electron Microscopy Sciences) pendant 10 min à température ambiante, perméabilisées dans du Triton 100 à 1 % dans du PBS, pH 7,4 pendant 20 min, bloquées dans du Blocking One-P (Nacalai Tesque) pendant 20 min, et colorées à 4 °C pendant la nuit avec la protéine FB-GFP purifiée (0,5 µg mL-1 dans du tampon de blocage à 10 %). Le lendemain matin, les cellules ont été lavées avec du PBS, et la POI a été imagée par un microscope confocal à disque rotatif Olympus IX81 (tête CSU22) en utilisant un objectif à immersion d’huile ×100 (NA 1,40) dans les conditions suivantes : Imagerie séquentielle à 488 nm (0,77 mW ; mesurée au plan focal arrière de l’objectif ; dans le présent document, toutes les mesures de puissance laser correspondent au plan focal arrière de l’objectif) et 561 nm (0,42 mW) pour 50 points temporels sans délai, fréquence de rotation 2 × 2, temps d’exposition de 100 ms. Les images ont été acquises avec une caméra CCD Photometrics Cascade II utilisant le logiciel SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Les images d’immunomarquage ont été générées en faisant la moyenne des images de 50 points temporels pour chaque canal par Fiji64.

Western blots

Les cellules U2OS ont été transfectées transitoirement avec 4 × HA-mCh-H2B ou 4 × HA-mCh-β-actine avec le réactif LipofectamineTM LTX avec le réactif PLUS. 10 h après la transfection, les cellules ont été récoltées et lysées dans 120 µL de tampon RIPA avec l’inhibiteur de protéase cOmplete (Roche). 6,5 µL de chaque lysat cellulaire ont été chargés sur un gel protéique NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) et analysés pendant 60 minutes à 100 V et 25 minutes à 200 V. Les protéines ont été transférées sur un support PVDF. Les protéines ont été transférées sur une membrane PVDF (Invitrogen), bloquées dans un tampon de blocage (5 % de lait en poudre dans 0,05 % de TBS-Tween 20) pendant 1 h, et colorées pendant la nuit avec la protéine FB-GFP purifiée (0,5 µg mL-1 dans le tampon de blocage) ou l’anticorps parental anti-HA 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001 ; dilution 2000 fois avec une concentration finale de 0,5 µg mL-1 dans le tampon de blocage). Pour l’anticorps primaire 12CA5, une incubation supplémentaire pendant 1 h avec un anticorps anti-souris/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001 ; dilution 5000 fois dans un tampon de blocage) a été effectuée. Le POI a été détecté à partir de la fluorescence de la GFP pour la FB-GFP ou de l’Alexa 488 pour l’anticorps anti-HA à l’aide d’un Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) avec les conditions suivantes : longueur d’onde d’excitation 473 nm, filtre LPB (≥510 nm), tube photomultiplicateur 300 V et taille de pixel de 10 µm. Les western blots non rognés et non traités sont fournis dans la figure supplémentaire 3.

Récupération de la fluorescence après photoblanchiment

Pour étudier l’affinité de liaison de FB aux épitopes HA dans les cellules vivantes, des expériences FRAP ont été réalisées sur des cellules transfectées transitoirement avec 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) et FB-GFP (1,25 µg) 24 h avant la FRAP. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif Olympus IX81 (tête CSU22) couplé à une unité de photomanipulation Phasor (Intelligent Imaging Innovations) avec un objectif à immersion d’huile ×100 (NA 1,40). Avant le photoblanchiment, 20 ou 10 images ont été acquises avec un intervalle de temps de 1 ou 5 secondes. Les images ont été capturées à l’aide d’un laser de 488 nm (0,77 mW) avec un temps d’exposition de 100 ms, suivi d’un laser de 561 nm (0,42 mW) avec un temps d’exposition de 15 ms. Le disque rotatif a été réglé à une vitesse de rotation de 1 × 1. Après l’acquisition des images pré-FRAP, le laser p488 nm (de l’unité Phasor pour le photoblanchiment) à 17 mW avec un temps d’exposition de 100 ms, ou 4 mW avec un temps d’exposition de 500 ms, a été utilisé pour photoblanchir une région circulaire dans le noyau. Après le photoblanchiment, 30 images ont été capturées sans délai ou avec un délai de 500 ms, puis 100 images avec un délai de 1 s et 100 images avec un délai de 5 s ont été acquises en utilisant les mêmes paramètres d’imagerie que les images pré-FRAP. L’intensité de la fluorescence en fonction du temps de la tache photo-blanchie a été exportée à l’aide du logiciel Slidebook. L’intensité de fluorescence du noyau et du fond a été obtenue par Fiji64 après correction du mouvement cellulaire à l’aide du plugin StackReg Fiji65. La courbe FRAP et la moitié ont été obtenues à l’aide de easyFRAP-web66, conformément aux instructions du site Web. Figure 4b, d ont été générés par Mathematica (Wolfram Research).

purificationMCP

MCP-HaloTag a été purifié par chromatographie d’affinité métal immobilisé17. Brièvement, le MCP-HaloTag étiqueté His a été purifié à travers une colonne emballée Ni-NTA-agarose (Qiagen) selon les instructions du fabricant, avec des modifications mineures. E. coli exprimant la protéine intéressée a été lysée dans un tampon PBS avec un ensemble complet d’inhibiteurs de protéase (Roche) et 10 mM d’imidazole. La résine a été lavée avec un tampon à base de PBS contenant 20 et 50 mM d’imidazole. La protéine a ensuite été éluée dans un tampon PBS avec 300 mM d’imidazole. Le MCP étiqueté His élué a été dialysé dans un tampon à base de HEPES (10 % de glycérol, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % de détergent NP-40 et 1 mM DTT), congelé instantanément dans l’azote liquide, puis stocké à -80 °C.

Préparation des cellules pour le suivi des chaînes naissantes

Le plasmide rapporteur smHA-KDM5B-MS2 (plasmide Addgene #81085) et la construction FB ont été soit transfectés transitoirement sans la protéine MCP-HaloTag, soit chargés en billes avec la protéine MCP-HaloTag dans des cellules U2OS placées sur une chambre MatTek de 35 mm 4 à 6 h avant l’imagerie. 3 h plus tard, si la protéine MCP-HaloTag était chargée en billes, les cellules ont été colorées avec le ligand JF646-HaloTag, puis lavées avec du milieu DMEM complet sans phénol rouge. Si aucune protéine MCP-HaloTag n’était nécessaire, le milieu des cellules a été changé en milieu DMEM complet sans phénol-rouge 3 h après la transfection. Les cellules étaient alors prêtes pour l’imagerie.

Pour l’imagerie multiplexée, deux plasmides rapporteurs, smHA-KDM5B-MS2 et SunTag-kif18b, ainsi que deux sondes, FB-mCh et Sun-GFP (dont l’épitope HA a été retiré), ont été transfectés transitoirement dans des cellules U2OS placées sur une chambre MatTek 4 à 6 h avant l’imagerie. 3 h plus tard, le milieu des cellules a été changé pour un milieu DMEM complet sans phénol rouge. Les cellules étaient alors prêtes pour l’imagerie.

Condition d’imagerie pour les essais de traduction et de colocalisation

Pour imager les ARNm uniques et leur état de traduction avec FB, un microscope à fluorescence à grand champ personnalisé basé sur un schéma d’éclairage incliné (HILO) a été utilisé17,67. En bref, les faisceaux d’excitation, des lasers à solide de 488, 561 et 637 nm (Vortran), ont été couplés et focalisés hors axe sur le plan focal arrière de l’objectif (APON 60XOTIRF, Olympus). Toutes les puissances laser rapportées ont été mesurées au niveau du plan focal arrière de l’objectif. Les signaux d’émission ont été séparés par un miroir dichroïque ultra-plat de qualité imagerie (T660lpxr, Chroma). Les signaux d’émission les plus longs (rouge lointain) après division sont passés à travers un filtre passe-bande (FF01-731/137-25, Semrock). Les signaux d’émission plus courts (rouge et vert) après fractionnement sont passés à travers un filtre passe-bande pour le rouge (FF01-593/46-25, Semrock) ou un filtre passe-bande pour le vert (FF01-510/42-25, Semrock) installé dans une roue à filtres (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). Les signaux d’émission les plus longs (rouge lointain) et les plus courts (rouge et vert) ont été détectés par deux caméras EM-CCD séparées (iXon Ultra 888, Andor) par mise au point avec un objectif doublet achromatique de 300 mm (AC254-300-A-ML, Thorlabs). La combinaison de l’objectif ×60 d’Olympus, de la lentille tubulaire de 300 mm et de l’iXon Ultra 888 produit des images ×100 avec 130 nm pixel-1. Un incubateur à température (37 °C), humidité et 5% de CO2 (Okolab) est équipé d’une platine piézoélectrique (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) pour l’imagerie des cellules vivantes. Les lasers, les caméras, la platine piézoélectrique et la roue à filtres ont été synchronisés par un microcontrôleur open source, la carte Arduino Mega (Arduino). L’acquisition d’images a été réalisée à l’aide du logiciel libre Micro-Manager (1.4.22)68.

La taille de l’image a été fixée au centre 512 × 512 pixels2 (66,6 × 66,6 µm2), et le temps d’intégration de la caméra a été fixé à 53,64 ms. Le temps de lecture des caméras à partir de la combinaison de notre taille d’imagerie, du mode de lecture (30 MHz) et de la vitesse de décalage vertical (1,13 µs) était de 23,36 ms, ce qui donne notre taux d’imagerie de 13 Hz (70 ms par image). Les signaux rouge et vert ont été imagés alternativement. La position du filtre d’émission a été modifiée pendant le temps de lecture de la caméra. Pour minimiser les pertes, le signal rouge lointain a été imagé simultanément avec le signal vert. Pour capturer l’épaisseur totale des cellules, 13 piles z avec une taille d’étape de 500 nm (6 µm au total) ont été imagées à l’aide de la platine piézoélectrique. Cela nous a permis d’obtenir une vitesse d’imagerie cellulaire totale de 1 Hz pour l’imagerie des signaux rouges ou verts, et de 0,5 Hz pour l’imagerie des signaux rouges et verts indépendamment de l’imagerie rouge lointain.

Pour les figures 1c, d, 2a, e, un seul plan des cellules a été imagé en continu à 6,5 Hz pendant 100 points de temps et la moyenne a été calculée tout au long du temps (lasers : 488 nm, 130 µW ; 561 nm, 4 µW (Fig. 1c), 90 µW (Fig. 1d), 19 µW (Fig. 2a), 155 µW (Fig. 2e) ; 637 nm, 220 µW). Pour la Fig. 2b (gauche), la cellule a été imagée en continu à 0,5 Hz, avec les lasers 488 nm (100 µW) et 561 nm (10 µW), avec 13 z-stacks à chaque point de temps et une moyenne tout au long du temps. Les 13 piles z acquises et moyennées ont été déconvoluées à l’aide de Fiji. Pour les Fig. 6b, c, e et f, les cellules ont été imagées toutes les 10 s avec 13 z-stacks par point de temps (lasers : 488 nm, 13 µW (Fig. 6b), 18 µW (Fig. 6c) ; 561 nm, 172 µW (Fig. 6f) ; 637 nm, 150 µW (Fig. 6b, c), 35 µW (Fig. 6e)). Pour la Fig. 7b, la cellule a été imagée en continu à 0,5 Hz avec 13 z-stacks à chaque point de temps (lasers : 488 nm, 130 µW ; 561 nm, 172 µW). Pour la Fig. 8b, les cellules ont été imagées toutes les 14 s avec 13 piles z à chaque point temporel (laser : 488 nm, 70 µW). Pour la Fig. 8c, les cellules ont été imagées toutes les 40 s avec 13 piles z à chaque point temporel (laser : 488 nm, 130 µW). Pour la détermination de la vitesse des points de translation motorisés (Fig. 8e), les neurones ont été imagés en continu à 1 Hz avec 13 z-stacks à chaque point temporel.

Pour les Fig. 2b (droite) et 2c, la co-localisation a été imagée par le microscope confocal à disque tournant Olympus IX81 (tête CSU22) décrit précédemment en utilisant un objectif à immersion d’huile ×100 (NA 1,40) dans les conditions suivantes : Imagerie séquentielle à 488 nm (0,77 mW) et 561 nm (0,42 mW) pour cinq points temporels sans délai avec plusieurs tranches z pour couvrir l’ensemble du corps cellulaire pour chaque point temporel, vitesse de rotation 1 × 1, temps d’exposition ajusté en fonction de la luminosité des cellules. Les images ont été acquises avec une caméra CCD Photometrics Cascade II utilisant le logiciel SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Les images affichées dans les figures ont été générées en faisant la moyenne de cinq points de temps, puis une projection maximale de toutes les tranches z a été effectuée par Fiji64.

Pistage des particules des sites de translation

La détection et le suivi des sites de translation uniques ont été effectués sur les images de projection d’intensité maximale avec le code personnalisé Mathematica (Wolfram Research)17. Brièvement, les images ont été traitées avec un filtre passe-bande pour mettre en évidence les particules, puis binarisé pour détecter leurs centres d’intensité comme positions à l’aide de la routine intégrée Mathematica ComponentMeasurements. Les particules détectées ont été suivies et reliées dans le temps par une recherche du plus proche voisin. Les coordonnées précises (emplacements super-résolus) des ARNm et des sites de traduction ont été déterminées en ajustant (à l’aide de la routine intégrée NonlinearModelFit de Mathematica) les images originales à des gaussiennes 2D de la forme suivante :

où IBG est la fluorescence de fond, I l’intensité de la particule, (x0, y0) l’emplacement de la particule, et (σx, σy) les écarts de la particule. Le décalage entre les deux caméras a été enregistré à l’aide de la routine intégrée de Mathematica FindGeometricTransform pour trouver la fonction de transformation qui aligne le mieux les positions ajustées des perles Tetraspeck de 100 nm de diamètre réparties uniformément dans le champ de vision de l’image.

Pour les figures 6c, e, f, 7c, 8b, d, les particules ont été suivies par un code Mathematica personnalisé et ensuite tracées avec Mathematica. Pour la figure 7c, les déplacements quadratiques moyens moyens ont été calculés à partir des coordonnées ajustées de manière gaussienne (à partir d’images de projection d’intensité maximale en 2D). La constante de diffusion a été obtenue en ajustant les cinq premiers points temporels à une ligne avec une pente m = 4D, où D est le coefficient de diffusion. Les points de translation à moteur unique (Fig. 8e) ont été suivis par le plugin TrackMate69 de Fidji après une projection maximale, puis représentés avec Mathematica. Tout le code Mathematica est disponible sur demande.

Suivi de molécules uniques de protéines marquées 1×HA dans des cellules

Le jour précédant l’imagerie, les cellules ont été plaquées sur une chambre MatTek et transfectées transitoirement avec les 1 × HA-mCh-H2B et FB-Halo en utilisant le réactif LipofectamineTM LTX avec le réactif PLUS (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. 3 h après la transfection, le milieu a été changé en DMEM complet. Avant l’imagerie, les cellules ont été colorées avec le ligand Halo TMR (Promega)45 traité au borohydrure de sodium (NaBH4). En bref, 1 µL de colorant Halo ligand TMR 1 mM a été réduit pendant 10 minutes dans 200 µL de solution de NaBH4 50 mM (pré-dissous dans du PBS pendant 10 minutes, pH 7,4). Ensuite, 200 µL de TMR réduit ont été dilués dans 800 µL de DMEM sans phénol rouge pour produire 1 mL de milieu TMR réduit. Le milieu des cellules transfectées a été remplacé par le milieu TMR réduit et les cellules ont ensuite été placées dans un incubateur (5% CO2, 37 °C) pendant 30 min pour la coloration. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du DMEM sans phénol rouge. Entre les lavages, les cellules ont été incubées pendant 5 minutes dans un incubateur (5% de CO2, 37 °C).

Les cellules ont été imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ construit sur mesure et basé sur un schéma d’illumination incliné (HILO)17,67. Le champ d’imagerie a été réglé à 256 × 256 pixels2 (33,3 × 33,3 µm2), et le temps d’intégration de la caméra a été réglé à 30 ms. Les cellules ont été imagées avec un laser 561 nm de 7,7 mW à une vitesse d’imagerie de 43,8 ms par image pour un total de 10 000 points temporels (7,3 min). Pendant l’imagerie, un laser de 6,2 mW 405 nm a été activé pendant 50 ms toutes les 10 s pour photoactiver le ligand réduit Halo-TMR. Les molécules uniques ont été suivies à l’aide du plugin TrackMate69 de Fidji. Pour s’assurer que les pistes représentent FB-Halo lié à 1 × HA-mCh-H2B, elles ont été filtrées dans Mathematica. Le filtre a éliminé les pistes d’une longueur inférieure à 16 images. En outre, tous les sauts entre les images devaient être inférieurs à 220 nm. Ce critère a été utilisé par d’autres pour distinguer les facteurs de transcription qui sont liés à la chromatine de ceux qui ne le sont pas46. Enfin, dans Mathematica, les pistes ont été codées en couleur soit en fonction du moment où elles ont été acquises (comme dans la figure supplémentaire 5), soit en fonction de la taille moyenne des sauts entre les images (comme dans la figure 5).

Traitement à la puromycine

Les cellules U2OS transfectées de manière transitoire avec smHA-KDM5B-MS2 et FB ou chargées de billes avec smHA-KDM5B-MS2, FB et MCP-HaloTag ont été imagées comme ci-dessus avec des intervalles de 10 s entre les images. Après l’acquisition de 5 ou 10 points temporels comme images de prétraitement, les cellules ont été traitées avec une concentration finale de 0,1 mg mL-1 de puromycine juste avant l’acquisition du 6ème ou 11ème point temporel. Après l’ajout de la puromycine, les cellules ont été imagées dans les mêmes conditions que celles utilisées pour l’imagerie de prétraitement jusqu’à la disparition des taches de translation.

Culture de neurones et transfection

Les neurones corticaux de rat ont été obtenus à partir des cortex écartés de fœtus de jour embryonnaire (E)18 qui ont été préalablement disséqués pour obtenir l’hippocampe, et congelés dans du milieu Neurobasal (ThermoFisher Scientific) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS, Atlas Biologicals) et 10% de DimethylSulfoxide (Sigma-Aldrich, D8418) dans de l’azote liquide. Les neurones corticaux de rat cryoconservés ont été plaqués à une densité de ∼15 000-30 000 cellules par cm2 sur des boîtes MatTek (MatTek) et cultivés dans du milieu Neurobasal contenant 2% de supplément B27 (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alanine/l-glutamine et 1% de FBS (Atlas Biologicals). Les transfections ont été réalisées après 5-7 jours de culture en utilisant la Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) selon les instructions du fabricant. Les neurones co-exprimant 4 × HA-mRuby-Kv2.1 et FB-GFP ont été imagés 1 à 2 jours après la transfection (Fig. 2b). Les neurones co-exprimant smHA-Kv2.1 et FB-GFP ont été imagés 1 à 7 jours après la transfection (figure supplémentaire 2, à gauche). Pour les essais de traduction, les neurones ont été imagés 4 à 12 heures après la transfection. Toutes les expériences d’imagerie neuronale ont été réalisées dans un environnement à température contrôlée (37 °C), humidifié et contenant 5 % de CO2, dans un milieu Neurobasal sans rouge de phénol (ThermoFisher Scientific). L’identité neuronale a été confirmée en suivant les processus émanant du corps cellulaire à imager sur des centaines de microns pour s’assurer qu’il s’agissait de véritables neurites.

Suivi du développement du poisson zèbre

Toutes les expériences sur le poisson zèbre ont été approuvées par le comité de sécurité des expériences génétiques de Tokyo Tech (I2018001) et la manipulation des animaux est opérée conformément aux directives. Pour visualiser la FB-GFP dans l’embryon de poisson zèbre, des ARNm pour la FB-GFP et la N × HA-mCh-H2B ont été préparés. Les fragments d’ADN codant la FB-GFP et la N × HA-mCh-H2B ont été insérés dans un plasmide contenant le promoteur T7 et le poly A70. Les plasmides suivants (T7-FB-GFP et T7-N × HA-mCh-H2B) ont été linéarisés avec le site de restriction XbaI pour une transcription in vitro à l’aide du kit mMESSAGE mMACHINE (ThermoFisher Scientific). L’ARN a été purifié à l’aide du kit de nettoyage RNeasy Mini Elute (QIAGEN) et remis en suspension dans l’eau. Avant la micro-injection, les œufs de poisson zèbre (AB) ont été déchorionés par trempage dans 2 mg mL-1 de pronase (Sigma Aldrich ; P5147) dans 0,03% de sel marin pendant 10 min. Un mélange (~0,5 nL) contenant de l’ARNm (200 pg chacun pour FB-GFP et N × HA-mCh-H2B) a été injecté dans le vitellus (près de la partie cellulaire) d’embryons au stade de 1 cellule. Pour un contrôle négatif, l’ARNm HA-mCh-H2B a été omis. 5-10 min après l’injection de l’ARNm, un Fab spécifique de l’acétylation endogène de l’histone H3 Lys9 marqué au Cy5 (CMA310)25 a été injecté (100 pg dans ~0,5 nL). Les embryons injectés ont été incubés à 28 °C jusqu’au stade de quatre cellules et incorporés dans de l’agarose à 0,5 % (Sigma Aldrich, A0701) dans du sel marin à 0,03 %, le pôle de l’animal vers le bas sur un plat à fond de verre de 35 mm (MatTek). Les images de fluorescence ont été recueillies à l’aide d’un microscope confocal (Olympus ; FV1000) équipé d’une platine chauffante (Tokai Hit) réglée à 28 °C et d’un objectif à immersion d’huile de silicone UPLSAPO ×30 (NA 1,05), commandé par le logiciel intégré FV1000 FLUOVIEW ver.4.2. Trois images couleur ont été acquises séquentiellement toutes les 5 min à l’aide de lasers 488, 543 et 633 nm (640 × 640 pixels ; 0,662 µm pixel-1, sténopé 800 μm ; 2,0 μs pixel-1) sans calcul de moyenne. Les projections d’intensité maximale ont été créées à partir de 20 piles z à 5 μm.

Les noyaux au sein des embryons de poisson zèbre ont été suivis en 4D à l’aide du plugin TrackMate69 de Fidji. Les résultats ont été post-traités et tracés avec Mathematica. Pour quantifier le nombre et la surface des noyaux et l’intensité nucléaire, cytoplasmique et nucléaire:cytoplasmique moyenne dans le temps, l’intensité de tous les noyaux dans les projections d’intensité maximale a été mesurée à l’aide de la fonction intégrée ComponentMeasurements de Mathematica. ComponentMeasurements nécessite des masques binaires des objets à mesurer. Les masques binaires des noyaux ont été réalisés à l’aide de la fonction Mathematica intégrée Binarize avec un seuil d’intensité approprié pour mettre en évidence uniquement les noyaux dans les images de Fab marqués au Cy5 (spécifique de l’acétylation endogène de l’histone H3 Lys9). Les masques du cytoplasme autour de chaque noyau ont été réalisés en dilatant les masques nucléaires de 4 pixels (à l’aide de la commande intégrée Dilation), puis en soustrayant du masque dilaté les masques nucléaires originaux dilatés de 1 pixel. Cela crée des masques en forme d’anneau autour de chaque noyau, à partir desquels l’intensité cytoplasmique moyenne a été mesurée.

Résonance plasmonique de surface

La cinétique de liaison des BF purifiés à l’étiquette épitope HA a été mesurée par résonance plasmonique de surface (OpenSPR, Nicoyalife). Après que le peptide HA marqué à la biotine ait été capturé par une puce de détection à la streptavidine (Nicoyalife), la FB-GFP purifiée diluée dans un tampon de fonctionnement PBS, pH 7,4, a été lentement écoulée sur la puce de détection pendant 5 min pour permettre l’interaction. On a ensuite laissé le tampon circuler pendant 10 minutes pour recueillir les données de dissociation. La courbe de liaison non spécifique a été obtenue en faisant couler la même concentration de FB-GFP dans le même tampon sur une autre puce à streptavidine (Nicoyalife). Les données du contrôle ont été recueillies exactement comme dans l’expérience. Pour 100 et 30 nM de FB-GFP, la réponse de liaison était significativement plus élevée que le contrôle, avec une interaction de liaison non spécifique négligeable. Par conséquent, nous avons choisi ces deux concentrations pour l’ajustement de la cinétique de liaison. Après avoir soustrait le contrôle, la courbe de la réponse du signal en fonction du temps a été obtenue, comme le montre la figure supplémentaire 4. Les paramètres de cinétique de liaison ont été obtenus en ajustant la courbe à un modèle de liaison univoque à l’aide du logiciel TraceDrawer (Nicoyalife) (figure supplémentaire 4).

Résumé du rapport

Des informations supplémentaires sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.