Optimisation du test IFN-γ ELISpot après stimulation des PBMC avec des antigènes CMV IE-1 et pp65 activés par des T

Des PBMC fraîchement isolées ont été utilisées pour le test ELISpot. Pour éviter toute perte de fonctionnalité des cellules T, due par exemple à l’activation des granulocytes, les échantillons de sang hépariné ont été traités sans autres additifs dans les 8 heures. Un nombre total de 2 × 105 PBMC par puits a été choisi pour le développement du protocole de test ELISpot, car ce nombre de cellules est inférieur à la confluence et peut généralement être obtenu à partir d’échantillons de moins de 15 ml de sang total. La protéine précoce immédiate IE-1 du CMV et la protéine tégumentaire tardive pp65 représentent des antigènes de cellules T immunodominants bien caractérisés. L’IE-1 complète et un fragment C-terminal de 181 acides aminés de la pp65 ont été produits et formulés en présence d’urée (T-activation®) pour augmenter leur capacité de stimulation de différents types de cellules effectrices de l’immunité à médiation cellulaire réagissant au CMV. La concentration optimale de l’antigène T-activated® a d’abord été déterminée en réalisant des expériences dose-réponse. Des PBMC fraîchement isolées d’un donneur sain séropositif au CMV ont été stimulées avec 31,6 fg/ml à 31,6 μg/ml de T-activated® pp65 ou avec 0,01 à 31,6 μg/ml de T-activated® IE-1, et le nombre de cellules sécrétant de l’IFN-γ a été déterminé par IFN-γ ELISpot. La pp65 T-activated® a révélé une capacité beaucoup plus forte à stimuler les cellules effectrices sécrétrices d’IFN-γ que l’IE-1 T-activated®, atteignant un plateau de réactivité entre 0,316 et 3,16 ng/ml de pp65 contre environ 31,6 μg/ml pour l’IE-1 (Fig. 1). En conséquence, des concentrations d’antigène T-activé® de 3 μg/ml de pp65 et de 15 μg/ml d’IE-1 ont été sélectionnées pour d’autres stimulations de PBMC et des tests ELISpot.

La sensibilité et la spécificité des tests ont été déterminées en stimulant des PBMC isolées à partir de 10 donneurs sains CMV-séropositifs et CMV-séronégatifs chacun avec les concentrations d’antigène T-activé® définies de pp65 et d’IE-1. Le nombre de cellules effectrices réactives a été quantifié par IFN-γ ELISpot. Une stimulation significative a été définie à l’aide d’un test U de Mann-Whitney comme une différence statistiquement significative entre les valeurs SFC des conditions non stimulées et stimulées par l’antigène CMV (chacune en quadruple exemplaire). La pp65 T-activated® et l’IE-1 ont induit une activation significative des cellules effectrices réactives dans 10 préparations sur 10 et 9 préparations sur 10 de PBMC provenant de donneurs individuels séropositifs pour le CMV, respectivement (Fig. 2). Dans ce collectif, la pp65 activée par le T a montré une plus grande capacité à activer les cellules réactives avec une médiane de 399 SFC/200 000 PBMC (fourchette de 12 à 864 SFC/200 000 PBMC), par rapport à l’IE-1 activée par le T avec une médiane de 26 SFC/200 000 PBMC (fourchette de 1,3 à 96 SFC/200 000 PBMC). Néanmoins, une réponse substantielle allant jusqu’à 96 SFC/200 000 PBMC a été détectée en réponse au T-activated® IE-1 dans des échantillons individuels de donneurs séropositifs pour le CMV (Fig. 2). Les 10 échantillons de PBMC (100 %) provenant de différents donneurs séronégatifs pour le CMV ont tous présenté des résultats négatifs après stimulation par la pp65 (médiane de 0,3 SFC/200 000 PBMC ; plage de 0 à 2,8), tandis que 9 échantillons de PBMC sur 10 (90 %) provenant de personnes séronégatives pour le CMV étaient négatifs après stimulation par l’IE-1 (médiane de 2,9 SFC/200 000 PBMC ; plage de 0,3 à 6,8). Le nombre de spots dans les PBMC CMV-séronégatifs stimulés par l’IE-1 était plus élevé que dans les PBMC CMV-séronégatifs stimulés par la pp65, mais ne dépassait pas 7 SFC/200 000 PBMC (Fig. 2).

IfN-γ a été montré comme étant sécrété de manière continue pendant la stimulation antigénique. Ainsi, l’intensité du signal dans l’IFN-γ ELISpot dépend de la durée de la stimulation . La durée de stimulation de l’antigène dans l’IFN-γ ELISpot rapportée dans la littérature varie généralement de 16 à 24 h . Afin d’étudier l’influence de la durée d’incubation sur les résultats du test, des tests IFN-γ ELISpot ont été réalisés sur des PBMC provenant de 3 donneurs sains indépendants séropositifs pour le CMV après stimulation avec les antigènes pp65 et IE-1 activés par T® pendant 17, 19 et 21 h. Aucune différence statistiquement significative dans le nombre de SFC n’a été détectée entre les 3 conditions (Fig. 3), démontrant la stabilité du signal dans cette plage de temps. Ainsi, un temps d’incubation de 19 h a été choisi pour le test ELISpot optimisé.

De nombreuses variables du protocole peuvent affecter les résultats du test ELISpot. Par exemple, le milieu utilisé pour la culture de cellules primaires comprend souvent du sérum qui contient diverses molécules bioactives non caractérisées dépendant du lot à différentes concentrations . Afin de définir des conditions de culture cellulaire standardisées, l’impact sur les performances du test de différents milieux contenant du sérum (RPMI 1640 complété par 5 % de FCS, d’AB humain, de NTA synthétique ou de NTS synthétique) et de milieux sans sérum (AIM-V®, UltraCulture) a été étudié. Les milieux sans sérum ont donné les meilleures réponses des cellules effectrices, comparables à celles du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 5% de FCS (Fig. 4a). En outre, AIM-V® a présenté les signaux de fond les plus faibles dans des conditions non stimulées (Fig. 4b), maximisant ainsi le rapport signal/bruit. Par conséquent, le protocole ELISpot a été établi plus avant en utilisant le milieu sans sérum AIM-V®.

Les tests ELISpot peuvent être réalisés avec différents matériaux de membrane, notamment la nitrocellulose (NC), l’ester de cellulose mixte (MCE) et le fluorure de polyvinylidène (PVDF). Nous avons comparé les résultats d’IFN-γ ELISpot obtenus à partir d’échantillons de PBMC de six individus sains (quatre répliques chacun, deux préparations par donneur) en utilisant les plaques MCE, les plaques PVDF et les bandes PVDF de Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) les plus couramment utilisées. Les membranes PVDF nécessitent une étape d’activation avec de l’éthanol avant la fixation de l’anticorps de capture. En outre, des étapes de lavage plus rigoureuses avant le développement des spots ont été nécessaires avec les plaques à base de PVDF par rapport aux plaques MCE, afin d’éviter une coloration de fond indésirable des membranes. Néanmoins, la résolution des spots détectés en termes de netteté et d’homogénéité était meilleure sur les membranes PVDF (non montré), ce qui a permis d’obtenir un nombre de spots plus élevé que sur les membranes MCE (jusqu’à 10 fois plus dans le cas des stimulations IE-1, avec un SFC médian de 155 contre 13/200 000 PBMC, respectivement ; Fig. 5). Étant donné que les bandes de 8 puits en PVDF étaient plus performantes et que leur utilisation pourrait permettre de réduire les coûts, en particulier lorsque des échantillons de patients uniques sont testés en routine clinique, le format de bande de 8 puits en PVDF a été choisi pour le développement optimisé du test.

Le revêtement optimal des plaques de microtitration avec l’anticorps de capture est crucial pour une performance robuste du test. La densité de l’anticorps de capture de l’IFN-γ lié à la membrane PVDF ne doit pas être limitative et, en particulier, doit permettre la détection fiable d’un nombre élevé de spots. Des bandes PVDF ont été recouvertes de concentrations croissantes (2,5 à 7,5 μg/ml) d’anticorps anti-IFN-γ. Des PBMC provenant de cinq donneurs séropositifs pour le CMV ont été ensemencés dans les puits enduits et laissés non stimulés ou stimulés avec IE-1 ou pp65 activés par le T. Dans la fourchette de 2,5 à 7,5 μg/ml, l’augmentation des concentrations d’anticorps n’a eu aucun effet sur la coloration de fond des PBMC non stimulées (SFC médian de 0 à 0,5/200 000 PBMC quelle que soit la concentration de l’anticorps de capture IFN-γ ; figures 6a-b). De même, les niveaux de SFC faibles à modérés spécifiques de l’IE-1 (médianes de 19 à 26 SFC/200 000 PBMC) étaient comparables dans toutes les conditions d’enrobage-anticorps (Fig. 6a). Il en était de même pour les réponses spécifiques à la pp65 jusqu’à ~300 SFC/200 000 PBMC (donneurs d032, d120 et d241 ; Fig. 6c). En revanche, chez les donneurs individuels présentant un nombre de spots plus élevé (par exemple, d172, d202 ; Fig. 6c), la détection des cellules réactives à la pp65 a augmenté de manière dose-dépendante avec la concentration d’anticorps de capture IFN-γ utilisée pour l’enrobage, notamment entre 2,5 et 5 μg/ml d’anticorps. À des concentrations d’anticorps de 5 μg/ml et au-delà, le nombre de spots est resté stable (figures 6b-c). Sur la base de ces résultats, une concentration de 5 μg/ml d’anticorps de capture IFN-γ a été choisie pour l’enrobage dans le protocole ELISpot optimisé.

Les tests ELISpot reposent sur la détection de cytokines capturées par des anticorps spécifiques aux cytokines, qui peuvent être soit directement couplés à une enzyme rapporteur (développement du test en une étape), comme la phosphatase alcaline (AP), soit une combinaison d’un anticorps secondaire biotinylé et d’une enzyme rapporteur conjuguée à la streptavidine (développement du test en deux étapes). Le développement d’un test en une étape permet de gagner du temps de manipulation et d’éviter les erreurs d’opérateur. Le mAb conjugué à l’AP (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Allemagne) a été utilisé comme conjugué de détection pour le protocole ELISpot standardisé. Différents paramètres d’incubation (par exemple, 0,5 à 3 heures à 37 °C, 2 heures à température ambiante) ont été testés. Le nombre de spots était comparable dans toutes les conditions. Cependant, la morphologie des spots et donc la détection correcte étaient meilleures lors de l’incubation avec le conjugué AP pendant 2 h à température ambiante, par rapport aux autres conditions (non montré). L’augmentation de la concentration du conjugué de détection de 0,025 à 0,4 U/ml a entraîné des valeurs médianes de CFS légèrement élevées pour la pp65, et le nombre maximal de taches a dépassé celui généré par le développement du test en deux étapes (non montré). Par conséquent, un développement de test en une étape pendant 2 h à RT avec 0,4 U/ml de conjugué de détection a été choisi.

Enfin, la normalisation de la réaction de coloration SFC a été abordée pour compléter l’optimisation du test. La durée d’incubation avec le substrat AP affecte la taille des taches et/ou le niveau de fond, et est donc critique pour une énumération fiable des taches. Un substrat de phosphatase alcaline chromogène en une étape NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) a été utilisé comme solution de coloration, et des temps d’incubation allant de 2 à 13 minutes dans l’obscurité ont été évalués. Le nombre de SFC était comparable dans toutes les conditions. Cependant, des temps d’incubation plus courts ont entraîné un diamètre de tache plus petit, tandis que des temps d’incubation plus longs ont produit des niveaux de fond plus élevés (données non présentées). Par conséquent, une durée de coloration de six minutes dans l’obscurité a été définie pour le protocole ELISpot optimisé.

Linéarité et précision du test ELISpot CMV optimisé

Le protocole ELISpot optimisé a été utilisé pour déterminer la plage de travail des PBMC qui assurent la linéarité du test. Les PBMC d’un donneur sain séropositif pour le CMV ont été ensemencées à une densité allant de 2 × 104 à 2,5 × 105 PBMC par puits. Pour les nombres de cellules compris entre 6 × 104 et 2 × 105 PBMC par puits, le nombre de taches ELISpot était directement proportionnel au nombre de PBMC ensemencées, après stimulation par IE-1 (analyse de régression linéaire ; R2 = 0,97) ou pp65 (R2 = 0,99) (figure 7a). En raison du nombre généralement plus faible de spots résultant de la stimulation par IE-1, l’utilisation de 2 × 105 PBMC par puits a été choisie pour l’essai ELISpot standardisé, afin d’assurer des valeurs de SFC suffisantes.

Pour vérifier davantage la linéarité entre le nombre de cellules effectrices réagissant au CMV et le SFC dénombré, des nombres croissants de PBMC provenant d’un donneur sain séropositif au CMV ont été ensemencés et le nombre total de PBMC a été ajusté à 2 x 105 par puits en utilisant des PBMC provenant d’un donneur séronégatif au CMV. Deux paires de donneurs (d034 + d219, d204 + d067) qui n’ont montré aucune allo-réactivité dans une co-culture de 19 heures ont été choisies pour ces expériences. En raison du faible nombre de SFC (inférieur à 20 SFC/200 000 PBMC), les résultats de la stimulation de l’IE-1 ont montré une variabilité accrue par rapport à la pp65 et n’ont pas permis un calcul de linéarité fiable (valeurs R2 inférieures à 0,96 ; données non présentées). Les résultats du test ELISpot après stimulation de la pp65 ont montré une bonne corrélation linéaire pour les deux paires de donneurs, avec des valeurs R2 de 0,99 (d034 + d219) et 0,98 (d204 + d067) dans l’analyse de régression linéaire (Fig. 7b).

La précision et la répétabilité du test optimisé ont été évaluées en calculant la variabilité intra-essai, inter-essai, inter-opérateur et inter-site. Dans chaque cas, les PBMC de trois donneurs sains séropositifs pour le CMV ont été testés en quadruple exemplaire, et la variabilité a été évaluée en calculant le coefficient de variation (CV), défini comme le rapport entre l’écart-type et la moyenne. Le CV pour les valeurs ELISpot < 10 SFC/200 000 PBMC n’a pas été calculé (voir le calcul du seuil de positivité ci-dessous). Le CV intra-essai a atteint 14% pour la stimulation de l’IE-1 et 6% pour la stimulation de la pp65 (Additional File 1 : Table S1). Le CV inter-essai n’a pas dépassé 17% pour IE-1 et 22% pour pp65 (Additional File 1 : Table S2). Le CV inter-opérateur était inférieur à 13 % et 18 % pour l’IE-1 et la pp65 respectivement (Additional File 1 : Table S3). Enfin, la variation intersite, qui est essentielle pour la validation du test à des fins de diagnostic, a été évaluée. Des échantillons de sang total ont été prélevés simultanément chez trois donneurs sains séropositifs pour le CMV et expédiés (dans des conditions constantes à température ambiante) à quatre laboratoires différents en Allemagne. Les PBMC ont été fraîchement isolées et les tests ELISpot réalisés selon le protocole optimisé par un total de 7 opérateurs. Le CV inter-site a atteint un maximum de 39% pour IE-1 et de 28% pour pp65 (Additional File 1 : Table S4).

L’évaluation d’au moins quatre mesures indépendantes a été recommandée pour obtenir des résultats ELISpot statistiquement significatifs . Pour aborder l’influence des variations intra-répliques sur le résultat du test, nous avons comparé les résultats ELISpot des mesures quintuples et quadruples de chaque contrôle et des stimulations antigéniques. Aucune variation significative des résultats du test n’a été constatée (données non présentées). Par conséquent, les mesures quadrupliques des conditions non stimulées et stimulées par l’activation T® IE-1 et pp65 permettent la fiabilité du test, ainsi que la praticabilité en combinaison avec l’utilisation de bandes à 8 puits.

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est un superantigène puissant, et la phytohémagglutinine (PHA) un mitogène puissant, tous deux induisant une sécrétion massive d’IFN-γ par les cellules T . Ainsi, le SEB et la PHA sont des contrôles positifs appropriés pour la viabilité des cellules, la stimulation réussie de la sécrétion de cytokines et la fonctionnalité globale des cellules T. Cela est particulièrement important pour l’interprétation des résultats lorsque l’on utilise des méthodes de détection de l’ADN. Ceci est particulièrement important pour l’interprétation des résultats lorsqu’on s’attend à une faible fréquence de cellules T, par exemple chez les receveurs de greffes de cellules souches allogéniques. Dans le test ELISpot optimisé, les stimulations des échantillons à tester avec SEB ou PHA sont effectuées en double.

En outre, un contrôle opérateur indépendant des cellules effectrices a été établi pour valider la bonne performance du test. Ce contrôle opérateur est basé sur la détection de l’IFN-γ recombinant lors de l’incubation directe avec l’anticorps de capture immobilisé anti-human-IFN-γ mAb (1-D1K). Ce contrôle, également effectué en double, doit donner une coloration sombre homogène de la membrane PVDF.

Validation technique du test : définition d’un seuil de positivité

Pour faciliter l’interprétation des résultats du test IFN-γ ELISpot et maximiser la spécificité (c’est-à-dire éviter les faux positifs dans les conditions non stimulées et dans les conditions stimulées chez les individus CMV-séronégatifs), un seuil technique a été défini. Les tests IFN-γ ELISpot ont été réalisés selon le protocole optimisé sur des PBMC provenant de 45 donneurs sains, dont 32 étaient CMV IgG-séropositifs (tableau 1).

La médiane et la plage des valeurs de SFC provenant de PBMC non stimulées de personnes CMV-séronégatives et CMV-séropositives étaient comparables . Le nombre de spots dans les PBMC stimulées par l’IE-1 et la pp65 de sujets séronégatifs pour le CMV était faible. Chez les individus séropositifs pour le CMV, les niveaux de SFC dans les PBMC stimulées par l’IE-1 et la pp65 atteignaient 1114 et 954 spots/200 000 PBMC (médiane de 22 et 265 respectivement ; Fig. 8). Pour la détermination d’un seuil technique, on a pris en compte les numérations ponctuelles dans le contrôle non stimulé ainsi que dans les conditions de stimulation par la pp65 et l’IE-1 activées par le T chez les individus CMV-séronégatifs et CMV-séropositifs. Le seuil de positivité a été déterminé en utilisant des statistiques z (niveau α = 0,05) sur les valeurs moyennes géométriques transformées en log10. Les valeurs = 0 ont été remplacées par des valeurs proches de la limite de détection, qui a été supposée être de 0,5. L’écart-type (ET) des mesures ELISpot pour le contrôle non stimulé, la stimulation IE-1 et la stimulation pp65 était respectivement de 0,234, 0,192 et 0,136. En considérant un écart-type de 0,2 et en supposant que 4 réplicats sont mesurés pour chaque contrôle négatif et chaque échantillon testé, un critère selon lequel le rapport des moyennes géométriques des valeurs stimulées et non stimulées est d’au moins 2,5 a été calculé. D’autre part, des profils de précision ont été générés à partir des résultats des tests spécifiques à l’IE-1 et à la pp65, un coefficient de variation (CV) ne dépassant pas 40 % ayant été utilisé comme limite d’acceptation de la validité du test pour déterminer la limite de quantification (LQ) respective. Les profils de précision pour les résultats des tests ELISpot spécifiques de l’IE-1 et de la pp65 provenant des 45 donneurs sains ont donné des valeurs de LdQ de 8,6 et 7,1 respectivement (fichier supplémentaire 2). Il convient de noter qu’une analyse similaire effectuée sur une cohorte de 124 patients hémodialysés a fourni des valeurs SD comparables dans des conditions non stimulées et stimulées par l’antigène (plage de 0,199 à 0,240) et a donné des valeurs LoQ de 7,8 (IE-1) et 8,3 (pp65). Sur la base de ces analyses, un seuil de 10 SFC/200 000 PBMC a été choisi pour définir les résultats positifs du test.

Au total, en utilisant les antigènes T-activated® pp65 et IE-1 et le test ELISpot IFN-γ optimisé, les résultats des tests sont considérés comme positifs si la moyenne géométrique des spots résultant des stimulations pp65 ou IE1 est ≥ 10 SFC/200 000 PBMC et si le rapport entre les moyennes géométriques des conditions stimulées et non stimulées est ≥ 2.5. Selon ces définitions, le collectif de 45 donneurs sains (32 CMV IgG-séropositifs, 13 CMV IgG-séronégatifs) a révélé une sensibilité (définie comme la concordance positive avec la CMV IgG-sérologie, utilisée comme procédure de mesure de référence primaire) de 97% et une spécificité (concordance négative avec la CMV IgG-sérologie) de 85% (Fig. 8).

Validation du test fonctionnel : Les antigènes activés par le T stimulent un large spectre de cellules effectrices cliniquement pertinentes réagissant au CMV

Les protéines recombinantes formulées en urée (T-activated®) sont traitées par les voies de traitement et de présentation des antigènes exogènes (CMH de classe II) et endogènes (CMH de classe I) . La stimulation des PBMC par les protéines T-activated® reproduit donc plus fidèlement une infection naturelle, ce qui peut entraîner l’activation d’un large éventail de cellules réactives au CMV (par exemple, les cellules Th, CTL, NK, NKT), ce qui pourrait contribuer à la sensibilité élevée du test IFN-γ ELISpot. Afin de caractériser davantage les cellules ciblées par les antigènes IE-1 et pp65 activés par le T et d’étudier l’éventuelle variabilité interindividuelle de la réponse des cellules effectrices, des colorations intracellulaires à l’IFN-γ et des analyses par cytométrie de flux ont été réalisées parallèlement aux tests IFN-γ ELISpot. Des PBMC fraîchement isolées de six donneurs sains séropositifs pour le CMV ont été stimulées avec les protéines IE-1 et pp65 activées par T® pendant 19 h et les cellules productrices d’IFN-γ ont été dénombrées selon le test ELISpot optimisé. Les mêmes préparations de PBMC (4 réplicats chacune) ont été stimulées pendant 6 h avec le même lot de protéines T-activated® IE-1 et pp65 en présence d’anticorps co-stimulateurs anti-CD28 et anti-CD49d. Les marqueurs de surface (CD3, CD4, CD8, CD56) et la coloration IFN-γ intracellulaire ont été analysés par cytométrie en flux, comme décrit dans la section Méthodes. Les sous-populations IFN-γ+ de lymphocytes CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (NKT-like) et CD3-CD56+ (NK) ont été dénombrées selon la stratégie de marquage illustrée dans le fichier supplémentaire 3. Les six donneurs différaient dans leur capacité à déclencher une réponse dépendante de l’IE-1 et/ou de la pp65 dans le test ELISpot IFN-γ. L’intensité de la réponse était également hétérogène entre les six donneurs, avec des valeurs allant de 7 à 1 054 SFC (stimulation IE-1) et de 28 à 780 SFC (stimulation pp65) pour 200 000 PBMC (Fig. 9a). De même, la fréquence et le rapport des diverses sous-populations cellulaires étudiées par cytométrie de flux différaient d’un donneur à l’autre (Fig. 9b). Il est intéressant de noter que les individus sains séropositifs pour le CMV dont le nombre de spots était plus faible (d120, d300, d343 ; Fig. 9a) présentaient également des fréquences plus faibles de lymphocytes IFN-γ+ par cytométrie de flux (Fig. 9b), ce qui souligne la capacité du test ELISpot à distinguer les répondeurs faibles des répondeurs élevés. L’activation de chaque sous-population lymphocytaire étudiée a été détectée chez certains donneurs, mais pas tous. Par exemple, une activation faible à forte des cellules T CD4+ a été détectée chez 4 des 6 donneurs (d120, d172, d300, d343) en réponse à l’IE-1, à la pp65 ou aux deux. De même, 5 des 6 donneurs (d172, d290, d300, d343, d361) ont montré une activation des cellules T CD8+ dans l’une ou les deux conditions de stimulation. Les CD3-CD56+ (cellules NK) étaient apparents chez un seul donneur (d120) en réponse aux deux antigènes. Les cellules CD3+CD56+ (de type NKT) étaient faiblement activées chez 4 des 6 individus (d120, d172, d300, d361) en réponse à la fois à l’IE-1 et à la pp65 (Fig. 9b). Il est remarquable qu’une forte activation CD4+ spécifique de la pp65 à d172 ait été corrélée à une forte réponse spécifique de la pp65 dans l’ELISpot, et qu’une forte activation CD8+ spécifique de la pp65 (d290) et de l’IE-1 (d361) ait été associée à un nombre élevé de spots dans l’ELISpot correspondant (Figs. 9a-b), ce qui suggère que ces cellules effectrices réactives au CMV contribuent de manière significative aux signaux détectés dans l’ELISpot. Dans l’ensemble, ces données démontrent la capacité des protéines IE-1 et pp65 activées par T® à stimuler un large éventail de cellules effectrices spécifiques du CMV. Ces expériences ont également révélé la grande hétérogénéité des réponses parmi les individus sains séropositifs pour le CMV. Notamment, l’observation que certains individus répondent soit à l’IE-1 soit à la pp65 souligne l’importance d’évaluer la réponse aux deux antigènes. La surveillance des réponses spécifiques à l’IE-1 et à la pp65 dans le test ELISpot IFN-γ optimisé pourrait améliorer la sensibilité globale du test.

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