DDRGK1 est nécessaire à l’homéostasie du RE

Pour comprendre la fonction cellulaire de DDRGK1, nous avons examiné les effets du knockdown de DDRGK1 en utilisant un mélange de deux siRNA comme décrit précédemment21. Nous avons constaté que le knockdown de DDRGK1 induisait une mort cellulaire apoptotique dans les cellules MCF7 et HepG2, caractérisée par la coloration de l’Annexin V/PI (Fig. 1a), l’activation de la caspase-3 et le clivage de PARP (Fig. 1b). Il convient de noter que nous pouvons détecter le clivage de la caspase-3 dans les cellules HepG2 induit par le knockdown de DDRGK1, mais pas dans les cellules MCF7, car ces dernières sont déficientes en caspase-322. L’analyse par PCR quantitative en temps réel (Q-PCR) a montré que l’élimination de DDRGK1 augmentait l’expression des gènes pro-apoptotiques BAX, BAK, NOXA, DR5 et Bid, tandis que l’expression du gène anti-apoptotique Bcl-2 diminuait (Fig. 1c,d). De manière importante, nous avons constaté que le knockdown de DDRGK1 dans les cellules MCF7 et HepG2 induit des réponses de stress ER, avec une augmentation de l’expression des gènes spécifiques du stress ER de BiP, HSPA8 et CHOP (Fig. 1e,f).

(a) Les cellules MCF7 et HepG2 ont été transfectées avec un siRNA de contrôle ou un siRNA ciblant DDRGK1 pendant 72 h. Les cellules ont ensuite été colorées avec de l’Annexin V et du PI et soumises à une analyse par cytométrie de flux suivie de la quantification des cellules apoptotiques (Annexin V+). (b) Analyse Western blot de la PARP et de la caspase-3 clivée dans les cellules MCF7 et HepG2 témoins et celles ayant fait l’objet d’une réduction de la DDRGK1 décrites en a. (c,d) Analyse Q-PCR des niveaux d’expression relatifs de l’ARNm de BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 et Bcl-2 dans les cellules MCF7 et HepG2 témoins et celles ayant fait l’objet d’une réduction de la DDRGK1. (e,f) Analyse par Q-PCR des niveaux d’expression relatifs de l’ARNm de BiP, HSPA8 et CHOP dans les cellules MCF7 et HepG2 contrôlées et réduites par DDRGK1. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne±s.d. de trois expériences. *P<0,05, **P<0,01 et ***P<0,001 par test t de Student.

Pour confirmer davantage que DDRGK1 est impliqué dans la réponse au stress du RE, nous avons déterminé l’effet de DDRGK1 sur la survie des cellules après traitement avec les inducteurs de stress du RE que sont la thapsigargin (Tg) et la tunicamycine (Tm). Le knocking down de DDRGK1 a augmenté l’apoptose induite par le stress du RE lors du traitement par Tg dans les cellules HepG2 et MCF7, tel qu’évalué par la coloration Annexin V/PI et le clivage de la caspase-3 et de la PARP (Fig. 2a-c et Fig. 1A-C supplémentaire). En revanche, la surexpression de DDRGK1 a réduit la mort cellulaire induite par le stress ER dans les cellules HepG2 (fig. 2d-f). En outre, la viabilité des cellules MCF7 a été évaluée par le test MTT, et les résultats ont montré que le knockdown de DDRGK1 rendait les cellules plus sensibles au traitement par Tg ou Tm, avec une viabilité cellulaire réduite (figure supplémentaire 1D), tandis que la surexpression de DDRGK1 favorisait la survie cellulaire après le traitement par Tg ou Tm (figure supplémentaire 1E). Pris ensemble, nos résultats suggèrent que DDRGK1 joue un rôle vital dans la régulation de l’homéostasie du RE.

(a). Les cellules HepG2 ont été transfectées avec un siRNA témoin ou avec un siRNA contre DDRGK1 pendant 72 h, puis les cellules ont été traitées avec du DMSO (véhicule témoin) ou du Tg (2,5 μM) pendant 24 h avant d’être récoltées. Les cellules ont été colorées avec de l’Annexin V et du PI, suivi d’une analyse cytométrique en flux. (b). Quantification des cellules apoptotiques (Annexin V+) dans a. (c) Analyse Western blot de PARP et de caspase-3 clivée dans les cellules HepG2 décrites dans a. (d) Les cellules HepG2 ont été transfectées avec le vecteur contrôle ou DDRGK1 pendant 36 h, et les cellules ont été traitées avec du DMSO ou Tg (2,5 μM) pendant 24 h avant d’être récoltées. Les cellules ont été colorées avec de l’Annexin V et du PI, suivi d’une analyse cytométrique en flux. (e) Quantification des cellules apoptotiques (Annexin V+) dans d. (f) Analyse Western blot de PARP et de caspase-3 clivée dans les cellules HepG2 décrites dans d. Toutes les données sont présentées en tant que moyenne±s.d. de trois expériences. **P<0,01 et ***P<0,001 par test t de Student.

DDRGK1 module l’UPR

Pour comprendre comment DDRGK1 régule l’homéostasie du RE, nous avons d’abord analysé les changements dans les niveaux de protéines de trois capteurs de l’UPR et de leurs cibles en aval dans les cellules déplacées par DDRGK1. Les résultats ont montré que le knockdown de DDRGK1 dans les cellules MCF7 et HepG2 réduisait significativement les niveaux d’IRE1α total mais diminuait faiblement l’IRE1α phosphorylé (p-IRE1α), ce qui peut être dû aux niveaux réduits d’IRE1α total (Fig. 3a). Les niveaux d’ATF6 et d’ATF6 clivé n’ont pas été affectés (Fig. 3a). Fait intéressant, le knockdown de DDRGK1 n’a pas affecté les niveaux de PERK total, mais les niveaux de PERK phosphorylé (p-PERK) et de BiP ont augmenté de manière significative (Fig. 3a). Nous avons ensuite examiné les effets de la déplétion de DDRGK1 sur le substrat XBP1 de l’IRE1α. Les résultats ont montré que XBP1s, une forme épissée de XBP1, était significativement diminué dans les cellules MCF7 privées de DDRGK1 de manière dépendante du temps (Fig. 3b), ce qui était corrélé avec les changements dans les niveaux de protéine IRE1α (Fig. 2A supplémentaire). En outre, la déplétion de DDRGK1 a augmenté les niveaux de phosphorylation d’eIF2α (p-eIF2α) et l’expression de CHOP dans les cellules MCF7 et HepG2 (figure supplémentaire 2B). Ces résultats indiquent que la déplétion de DDRGK1 réprime la signalisation UPR-IRE1α et active la voie apoptotique UPR-PERK, ce qui déclenche par conséquent l’apoptose, comme observé dans les Figs 1 et 2. Cependant, le niveau d’IRE1α était augmenté dans les cellules surexprimant DDRGK1 de manière dose-dépendante (Fig. 3c), tandis que les niveaux de p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP et la forme épissée de XBP1 n’étaient pas significativement modifiés (Fig. 3c ; Fig. 2C et D supplémentaires). Afin d’explorer la relation fonctionnelle entre DDRGK1 et l’UPR, nous avons évalué les changements dynamiques d’IRE1α et de PERK dans les cellules MCF7 dénuées de DDRGK1 et dans les cellules témoins après le traitement par Tg à différents moments. Le traitement par Tg a augmenté les niveaux d’IRE1α et de p-IRE1α, de p-PERK et de BiP dans les cellules témoins, comme prévu. Cependant, les niveaux totaux d’IRE1α ont été significativement diminués (0-24 h), tandis que les niveaux de p-IRE1α ont été modestement diminués (4-24 h) dans les cellules appauvries en DDRGK1 par rapport aux cellules témoins (Fig. 3d). De façon concomitante, le niveau de XBP1s a diminué dans les cellules dépourvues de DDRGK1 par rapport aux cellules témoins (4-12 h) (Fig. 3e). Les niveaux de PERK total n’ont pas été modifiés, mais le niveau de p-PERK a augmenté de manière significative dans les cellules dépourvues de DDRGK1 (0-12 h) (Fig. 3d). Des résultats similaires ont été obtenus dans les cellules HepG2 (figures supplémentaires 2E et F). Pris ensemble, nos résultats suggèrent que la déplétion de DDRGK1 provoque la dégradation d’IRE1α et l’activation de PERK.

(a) Les cellules MCF7 et HepG2 ont été transfectées avec un siRNA témoin ou un siRNA ciblant DDRGK1 pendant 72 h. Les niveaux de protéines de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 et BiP ont été déterminés par western blot. (b) Les cellules MCF7 ont été transfectées avec un siRNA de contrôle ou un siRNA contre DDRGK1, et les cellules ont été récoltées aux moments indiqués pour une analyse par RT-PCR de l’épissage de XBP-1. (c) Les cellules MCF7 et HepG2 ont été transfectées avec des vecteurs de contrôle ou DDRGK1 à différentes doses pendant 36 h. Les niveaux de protéines de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK et ATF6 ont été déterminés par western blot. (d) Les cellules MCF7 ont été transfectées avec un siRNA de contrôle ou un siRNA ciblant DDRGK1 pendant 72 h. Les cellules ont été collectées pour le western blot après traitement avec 2,5 μM Tg aux temps indiqués. (e) Analyse RT-PCR de l’épissage de XBP-1 en d. *Représente une bande non spécifique.

DDRGK1 régule l’UPR en ciblant IRE1α

L’UPR est déclenché par les capteurs de stress du RE lors du stress du RE pour réguler l’homéostasie du RE8. Il a été signalé que la délétion spécifique aux hépatocytes d’IRE1α chez les souris entraînait l’activation de la voie UPR-PERK23. Pour déterminer si l’induction de p-PERK observée dans les cellules dépourvues de DDRGK1 était médiée par une diminution des niveaux d’IRE1α, nous avons examiné les niveaux de p-PERK, de PERK et de ses cibles en aval dans les cellules dépourvues d’IRE1α. Les résultats ont montré que le knockdown d’IRE1α augmentait significativement les niveaux de protéines de p-PERK et de p-eIF2α dans les cellules MCF7 et HepG2 (Fig. 4a), de manière similaire à ceux observés dans les cellules dépourvues de DDRGK1 (Fig. 3a ; Fig. 2B supplémentaire). Ces résultats indiquent que DDRGK1 régule l’UPR en ciblant IRE1α. Nous avons ensuite étudié comment DDRGK1 régule IRE1α. Nos résultats ont montré que les niveaux de protéine IRE1α, mais pas les niveaux d’ARNm (Fig. 3A supplémentaire), étaient considérablement réduits dans les cellules dont le DDRGK1 a été coupé (Fig. 3a). Le traitement des cellules avec l’inhibiteur de protéasome MG132 a bloqué la réduction de la protéine IRE1α médiée par DDRGK1 (Fig. 4b ; Fig. 3B supplémentaire). De plus, nous avons observé que la déplétion de DDRGK1 réduisait considérablement la demi-vie d’IRE1α dans un essai de poursuite au cycloheximide (Fig. 4c). Conformément à ces observations, nous avons constaté que l’expression ectopique d’IRE1α améliorait la survie cellulaire des cellules MCF7 et HepG2 déplétées par DDRGK1 par rapport aux cellules témoins, caractérisée par la coloration à l’Annexin V/PI et l’activation de la caspase-3 (Fig. 4d,e ; Fig. 3C et D supplémentaires). Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que DDRGK1 régule la stabilité d’IRE1α et régule ainsi l’UPR.

(a). Les cellules MCF7 et HepG2 ont été transfectées avec un siRNA témoin ou un siRNA ciblant IRE1α pendant 72 h. Les niveaux de protéines de p-PERK, PERK, p-eIF2α et eIF2α ont été déterminés par western blot. (b). Analyse par western blot d’IRE1α dans des cellules MCF7 témoins et DDRGK1-knockdown traitées avec ou sans MG132 (20 μM, 8 h). (c). Analyse par Western blot de la décroissance d’IRE1α dans les cellules MCF7 témoins et DDRGK1-knockdown après traitement avec 100 μg ml-1 de cycloheximide pendant les temps indiqués. Le graphique représente la quantification des niveaux de protéines IRE1α. (d) Les cellules MCF7 ont été transfectées avec un siRNA témoin ou un siRNA ciblant DDRGK1 pendant 72 h. Avant la récolte, les cellules DDRGK1-knockdown ont été transfectées avec des vecteurs témoins ou IRE1α pendant 36 h. Les cellules ont ensuite été colorées avec de l’Annexin V et du PI et soumises à une analyse cytométrique en flux, suivie d’une quantification des cellules apoptotiques (Annexin V+). Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne±s.d. de trois expériences. *P<0,05 par le test t de Student. (e) Analyse Western blot d’IRE1α dans les cellules MCF7 en d.

DDRGK1 interagit avec IRE1α

Pour comprendre comment DDRGK1 régule la stabilité d’IRE1α, nous avons testé si DDRGK1 interagit avec IRE1α via un test d’immunoprécipitation (IP) réciproque dans des cellules HEK293T. Les résultats ont montré que Flag-IRE1α exprimé de manière exogène interagissait spécifiquement avec DDRGK1 et BiP endogènes (Fig. 5a). De même, Flag-DDRGK1 exprimé de manière exogène interagit spécifiquement avec IRE1α endogène et la protéine C53 associée à DDRGK1 (réf. 14). Cependant, nous n’avons pas pu détecter BiP dans les immunoprécipités de Flag-DDRGK1 (Fig. 5b), ce qui suggère que DDRGK1 ne peut pas interagir directement avec BiP. IRE1α, en tant que substrat endogène de la dégradation associée au RE (ERAD), est dégradé par l’association entre IRE1α et le complexe ERAD Sel1L-Hrd1 de manière BiP-dépendante24. Par conséquent, nous avons examiné si BiP est impliqué dans l’interaction entre DDRGK1 et IRE1α. Les résultats ont montré que l’interaction entre DDRGK1 et IRE1α n’était pas affectée par le knockdown de BiP (Fig. 4 supplémentaire). Pour confirmer davantage l’interaction de DDRGK1 avec IRE1α, nous avons réalisé des expériences de coloration par immunofluorescence. Les résultats ont montré que ces deux protéines sont co-localisées dans le RE (Fig. 5c). Pour cartographier la région impliquée dans l’interaction d’IRE1α avec DDRGK1, nous avons co-transfecté des mutants de type sauvage et de troncature Flag-IRE1α avec DDRGK1 dans des cellules HEK293T, et les résultats de l’IP ont montré que le domaine kinase cytoplasmique d’IRE1α était nécessaire pour son interaction avec DDRGK1 (Fig. 5d). Pour comprendre les changements dynamiques de l’interaction entre DDRGK1 et IRE1α dans des conditions de stress ER, les cellules HEK293T ont été transfectées avec Flag-DDRGK1 et traitées avec Tg pendant différents points de temps. Comme prévu, nous avons observé que l’IRE1α total, le p-IRE1α et le BiP étaient significativement augmentés sous stress ER. De manière intéressante, nous avons constaté que DDRGK1 interagissait spécifiquement avec IRE1α non phosphorylé, mais pas avec p-IRE1α, dans les immunoprécipités (Fig. 5e). Ces résultats suggèrent que DDRGK1 interagit avec et maintient la stabilité de l’IRE1α non phosphorylé.

(a). Analyse par Western blot des immunoprécipités du gel d’affinité Flag M2 dans des cellules HEK293T transfectées avec les vecteurs Flag-Vector ou Flag-IRE1α pendant 36 h. (b). Analyse par transfert Western des immunoprécipités du gel d’affinité du Flag M2 dans des cellules HEK293T transfectées avec le vecteur Flag ou le Flag-DDRGK1 pendant 36 h. (c). Les cellules MCF7 ont été doublement immunocolorées avec l’anticorps anti-DDRGK1 (vert) et l’anticorps anti-IRE1α (rouge). Les noyaux des cellules ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). La co-localisation entre les deux protéines endogènes DDRGK1 et IRE1α est montrée dans le panneau de fusion. Barre d’échelle, 20 μm. (d) Schémas des constructions IRE1α de type sauvage et tronquées et analyse par western blot des immunoprécipités sur gel d’affinité Flag M2 dans des cellules HEK293T transfectées avec Flag-Vector ou Flag-IRE1α de type sauvage et tronqué. (e) Analyse par transfert Western des immunoprécipités du gel d’affinité du Flag M2 dans des cellules HEK293T exprimant le Flag-Vecteur ou le Flag-DDRGK1, traitées par mock ou Tg (2,5 μM).

L’ufm1 est nécessaire pour l’interaction de DDRGK1 et IRE1α

Une étude récente a démontré que DDRGK1 est un substrat d’ufmylation et est nécessaire pour l’ufmylation d’ASC115,20. Afin de déterminer si l’ufmylation est impliquée dans la régulation de la stabilité d’IRE1α par DDRGK1, nous avons examiné si la déplétion d’Ufm1 affecte l’expression de la protéine IRE1α. Comme pour la déplétion de DDRGK1, nous avons observé que l’élimination de l’expression d’Ufm1 réduisait considérablement les niveaux de protéine IRE1α (Fig. 6a), ce qui indique que DDRGK1 régule IRE1α par l’ufmylation. De même, nous avons constaté que la surexpression de DDRGK1 n’a pas permis de stabiliser la protéine IRE1α dans les cellules MCF7 dont l’expression a été réduite par l’Ufm1, par rapport aux cellules témoins (Fig. 6b). De plus, les niveaux de protéine IRE1α ont considérablement diminué dans les cellules MCF7 ayant subi un clonage par Ufm1 en l’absence et en présence de Tg (Fig. 6c), ce qui suggère que l’ufmylation est nécessaire à la régulation de la stabilité de la protéine IRE1α par DDRGK1. Nous nous sommes ensuite demandé si IRE1α est soumis à une modification par ufmylation. Pour répondre à cette question, nous avons détecté l’ufmylation d’IRE1α dans des cellules exprimant DDRGK1 et Ufm1 ainsi que UBA5 (E1), UFC1 (E2) et UFL1 (E3), comme décrit précédemment20. Cependant, nous n’avons pu détecter aucune ufmylation de la protéine IRE1α, alors que l’ufmylation de la protéine DDRGK1 était facilement détectable, comme décrit précédemment (données non présentées)15,20,25, ce qui suggère que IRE1α pourrait ne pas être une cible de l’ufmylation. Fait intéressant, nous avons constaté que l’association entre DDRGK1 et IRE1α était significativement réduite dans les cellules HEK293T dont l’Ufm1 a été désactivé, par rapport aux cellules témoins (Fig. 6d). Conformément à cette observation, nous avons constaté que l’interaction de DDRGK1 K267R (un mutant de DDRGK1 déficient en ufmylation, dans lequel le résidu lysine 267 est remplacé par un résidu arginine)15 avec IRE1α était considérablement réduite par rapport au DDRGK1 de type sauvage (Fig. 6e), ce qui indique que l’ufmylation de DDRGK1 est nécessaire pour l’association entre DDRGK1 et IRE1α. En outre, DDRGK1 K267R n’a pas réussi à stabiliser la protéine IRE1α par rapport à DDRGK1 de type sauvage (Fig. 6f). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l’ufmylation de DDRGK1 à K267 est requise pour son interaction avec IRE1α et la régulation de la stabilité de la protéine IRE1α.

(a) Les cellules MCF7 ont été transfectées avec soit un siRNA témoin, soit un siRNA ciblant Ufm1 pendant 72 h. Les niveaux de protéines d’IRE1α ont été déterminés par western blot. (b) Analyse par western blot d’IRE1α dans des cellules MCF7 témoins et des cellules MCF7 désactivées par Ufm1 exprimant le vecteur ou DDRGK1. (c) Le niveau de protéine d’IRE1α a été déterminé par western blot dans des cellules MCF7 témoins et Ufm1-knockdown après traitement avec 2,5 μM Tg pendant les temps indiqués. (d) Analyse par transfert Western des immunoprécipités sur gel d’affinité du Flag M2 dans des cellules HEK293T témoins et Ufm1-knockdown exprimant le Flag-Vector ou le Flag-DDRGK1. (e) Analyse par transfert Western des immunoprécipités sur gel d’affinité du Flag M2 dans des cellules HEK293T transfectées avec le vecteur Flag, le Flag-DDRGK1 WT ou le mutant K267R. (f) Analyse Western blot d’IRE1α dans les cellules MCF7 transfectées avec Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT ou mutant K267R.

DDRGK1 est nécessaire pour la capacité de reconstitution des CSH chez la souris

Une étude récente a suggéré que les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont extrêmement sensibles au stress ER26. Cela nous a amenés à supposer que la DDRGK1 pourrait être essentielle à la fonction des CSH. Nous avons d’abord déterminé le niveau d’expression de DDRGK1 dans plusieurs lignées hématopoïétiques de souris de type sauvage âgées de deux mois. La Q-PCR a révélé un niveau d’expression significativement plus élevé de DDRGK1 dans les CSH, y compris les CSH à long terme (CSH-LT), les CSH à court terme (CSH-TT) et les progéniteurs multipotents (PPM) (figure 7a). De plus, le niveau de protéine de DDRGK1 était fortement exprimé dans les cellules de moelle osseuse (MO) Lineage-c-Kit+ enrichies en CSH par rapport aux cellules MO Lineage+c-Kit- (Fig. 7b). Ces observations suggèrent un rôle important du DDRGK1 dans les cellules souches. Pour examiner le rôle de DDRGK1 dans la fonction des CSH, des expériences de transplantation compétitive ont été réalisées avec des CSH après le knockdown lentiviral de DDRGK1 (fig. 7c). Les cellules Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) provenant de souris donneuses CD45.1 ont été transduites avec le lentivirus de contrôle ou le lentivirus de désactivation de DDRGK1 et transplantées dans des souris receveuses CD45.2 irradiées de façon létale. L’analyse cytométrique en flux a montré que le pourcentage de cellules du sang périphérique (PB) dérivées du donneur était considérablement réduit dans le groupe DDRGK1-knockdown par rapport au groupe témoin, ce qui indique que le knockdown de DDRGK1 a considérablement réduit la capacité de reconstitution compétitive des CSH (Fig. 7d). Bien que dans une expérience de transplantation non compétitive, les souris receveuses transplantées avec des CSH désactivées par le DDRGK1 étaient toujours en vie 3 mois après la transplantation, cela suggère que la désactivation du DDRGK1 ne faisait que compromettre la capacité de reconstitution compétitive des CSH. Pour exclure les effets hors cible, nous avons conçu un autre shRNA ciblant DDRGK1 et observé des résultats similaires (figure supplémentaire 5A). Trois mois après la transplantation, les souris receveuses ont été euthanasiées pour une analyse de la MO et des essais de formation de colonies in vitro. L’analyse cytométrique en flux a montré que le knockdown de DDRGK1 a considérablement réduit le maintien des CSH transduites sans affecter leur potentiel de lignage (c’est-à-dire les lignages myéloïde, B et T), comme l’indique la diminution de la fréquence des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques dérivées du donneur, ainsi que des cellules hématopoïétiques différenciées dans la BM et la PB (figure 7e). Un résultat similaire a été observé dans une expérience indépendante utilisant un autre shRNA ciblant DDRGK1 (figure supplémentaire 5B). De plus, nous avons isolé les cellules CD34-Flt3-LSK dérivées du donneur (LT-HSC) des souris receveuses et avons effectué un essai de formation de colonies unicellulaires. Les résultats ont montré que l’élimination de DDRGK1 réduisait la capacité des CSH à former des colonies intermédiaires et de grande taille (figure 7f). Dans l’ensemble, ces données suggèrent que DDRGK1 est nécessaire au maintien de la fonction des CSH.

(a) Analyse par Q-PCR des niveaux d’expression relatifs de l’ARNm de DDRGK1 dans les sous-populations indiquées de BM de jeunes souris de type sauvage (2 mois, n=3). L’expression relative de DDRGK1 a été normalisée par rapport à la GAPDH. Les données sont présentées sous forme de moyenne±s.d. (b) Analyse Western blot de DDRGK1 dans les cellules enrichies Lineage+ c-Kit- et Lineage- c-Kit+ de jeunes souris de type sauvage (2 mois). (c) Schéma expérimental de l’essai de reconstitution. (d) Schéma FACS représentatif montrant le pourcentage de cellules GFP-positives dans les cellules PB dérivées du donneur, témoins (sh-Vecteur) ou DDRGK1-knockdown (sh-DDRGK1) (panneau de gauche). Les valeurs représentent les pourcentages normalisés de cellules GFP+ issues du donneur dans la prise de greffe totale (panneau de droite, n=3). Les données sont présentées sous forme de moyennes±s.d. **P<0,01 et ***P<0,001 par le test t de Student. (e) Les valeurs représentent les pourcentages de cellules GFP+ dérivées du donneur dans les LT-HSC (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, populations de cellules des lignées T et myéloïdes dans la BM de souris receveuses primaires 12 semaines après la transplantation (n=3). Les données sont présentées sous forme de moyenne±s.d. ***P<0,001 par le test t de Student. (f) Les LT-HSC GFP+ dérivées d’un donneur unique provenant de souris receveuses ont été triées dans des plaques à 96 puits et cultivées pendant 14 jours in vitro. Le pourcentage de colonies a été calculé en divisant le nombre de colonies par le nombre original de cellules individuelles ensemencées. Les données sont présentées sous forme de moyenne±s.d. **P<0,01 par le test t de Student.

Pour examiner si l’altération de la fonction des CSH était due à une efficacité réduite du homing, nous avons étiqueté avec un colorant fluorescent (violet) des cellules LSK purifiées à partir de souris de 2 mois, contrôlées ou transduites par lentiviral sh-DDRGK1, et les avons injectées à des receveurs irradiés de façon létale. Le pourcentage de cellules LSK marquées présentes dans la MO du receveur 18 heures après la transplantation a été analysé par cytométrie de flux. Les résultats ont montré que la capacité d’orientation des cellules LSK neutralisées par la DDRGK était comparable à celle des cellules témoins (figures supplémentaires 6A et B). Pour déterminer si l’élimination de DDRGK1 avait un effet sur le cycle cellulaire des cellules LSK, nous avons coloré les cellules LSK dérivées de donneurs et celles ayant fait l’objet d’une élimination de DDRGK1 avec le marqueur de prolifération Ki67 et le DAPI et nous n’avons constaté aucune différence significative dans les profils de cycle cellulaire entre les CSH ayant fait l’objet d’une élimination de DDRGK1 et les CSH témoins (figure supplémentaire 7A). Nous avons ensuite examiné l’effet de la désactivation du DDRGK1 sur l’apoptose des CSH à l’aide de la coloration de l’Annexin V et avons constaté une fréquence d’apoptose significativement plus élevée dans les cellules LSK dérivées du donneur et désactivées par le DDRGK1, comparativement aux cellules LSK témoins ; ce phénomène a été observé avec les deux shRNA ciblant le DDRGK1 (figure 8a ; figure supplémentaire 7B). Ensuite, nous avons examiné les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les CSH transduites. Les résultats ont montré que le niveau de ROS était comparable entre le groupe témoin et le groupe DDRGK1-knockdown (figure supplémentaire 7C). Sur la base des observations ci-dessus, nous avons conclu que le knockdown de DDRGK1 dans les CSH induisait une mort cellulaire apoptotique, altérant ainsi la fonction des CSH.

(a) Schéma FACS représentatif montrant le pourcentage de cellules positives à l’Annexin V au sein des cellules LSK témoins dérivées du donneur et des cellules DDRGK1-knockdown après la transplantation (panneau de gauche). Le graphique à barres montre le pourcentage de cellules positives à l’annexine V dans les cellules LSK (panneau de droite, n=3). Les données sont présentées sous forme de moyenne±s.d. *P<0,05 par le test t de Student. (b) Analyse par Q-PCR des niveaux d’expression relatifs de l’ARNm de DDRGK1, BiP et CHOP dans les cellules LSK dérivées du donneur, témoins et désactivées par DDRGK1, après transplantation (n=3). Les données sont présentées sous forme de moyenne±s.d. **P<0,01 et ***P<0,001 par le test t de Student. (c) Analyse Western blot de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK et ATF6 dans les cellules GFP+Lineage-c-Kit+ dérivées du donneur et enrichies à partir de souris receveuses témoins ou DDRGK1-knockdown. *Représente une bande non spécifique. (d) Analyse par RT-PCR de l’épissage de XBP-1 dans les cellules LSK contrôlées dérivées du donneur et dans les cellules DDRGK1-knockdown après la transplantation. Les cellules MEF avec traitement Tg ont servi de contrôle de l’épissage de XBP-1.

Pour étudier si la fonction altérée des CSH était due à l’activation de la réponse au stress du RE dans les CSH de DDRGK1-knockdown, nous avons analysé les niveaux d’expression de BiP et de CHOP par Q-PCR dans les CSH greffées de contrôle et de DDRGK-knockdown, les résultats ont montré que les niveaux d’ARNm de BiP et de CHOP étaient significativement augmentés dans les CSH de DDRGK1-knockdown (figure 8b). De plus, nous avons examiné les niveaux de protéines des capteurs de stress du RE dans les cellules BM Lineage-c-Kit+ témoins et celles ayant fait l’objet d’un débrayage par le DDRGK. Conformément à l’observation faite dans les lignées cellulaires cancéreuses, le knockdown de DDRGK1 a montré une diminution des niveaux de protéines d’IRE1α et de p-IRE1α et une augmentation du niveau de p-PERK, tandis que les niveaux d’ATF6 ne différaient pas dans les groupes de contrôle et de knockdown de DDRGK1 (Fig. 8c). De même, le niveau de XBP1s a diminué dans les cellules LSK dérivées de donneurs dont le DDRGK1 a été désactivé (Fig. 8d). Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que le knockdown de DDRGK1 a altéré la signalisation IRE1α mais a activé la voie PERK et soutiennent davantage que DDRGK1 est critique pour le maintien correct de l’homéostasie du RE et donc essentiel pour la survie et le maintien des CSH.