Junction Melting

Comme première étape pour évaluer l’applicabilité du modèle 3SPN.2 pour prédire les propriétés thermodynamiques de masse de la jonction de Holliday, nous évaluons les propriétés de fusion de la jonction à partir de simulations du modèle 3SPN.2 et les comparons avec nos expériences d’absorption. Nous simulons la fusion de la jonction par dynamique moléculaire à échange de répliques (REMD, voir méthodes) pour améliorer l’échantillonnage des états partiellement fondus. L’échantillonnage précis de la fraction relative des configurations de jonction intactes, fondues et partiellement fondues n’est pas actuellement possible en utilisant une représentation tout-atome.

La figure 2 montre la fraction de brin unique α en fonction de T sur une gamme de concentrations de sel à la fois pour le modèle 3SPN.2 et les mesures d’absorbance. Voir les méthodes pour la définition de α dans les simulations. La similitude entre les simulations et les expériences est frappante. Les simulations et les expériences montrent que la température de fusion augmente avec la concentration en sel et que la transition devient de plus en plus nette, ou  » coopérative « . Les données peuvent être bien décrites par la loi d’action de masse, ou relation de van’t Hoff46,

Propriétés de fusion de la jonction J34.

Comparaison de la fraction de brin unique α à partir de (a) simulations et (b) expériences. Nous ajustons les données en utilisant l’équation de van’t Hoff (équation 1), indiquée par les lignes pleines. Suivant la convention, nous définissons TM comme la température à laquelle α = 0,5.

où K est la constante d’équilibre pour la fusion de la jonction, ΔH et ΔS sont la différence d’enthalpie et d’entropie entre la jonction fondue et intacte, qui sont supposées être constantes sur cette plage de température et C est la concentration totale des brins (la concentration de chaque brin est C/4). Notez que ΔS contrôle la netteté de la transition de fusion. Nous discuterons du comportement de ΔH et ΔS ci-dessous, qui sont déterminés à partir de données d’ajustement dans la plage 0,1<α<0,9.

La température de fusion TM est une métrique thermodynamique utile de la stabilité de la jonction et est communément définie comme la température à laquelle α = 1/2. La figure 3 montre les valeurs expérimentales et simulées de TM en fonction de la concentration en sel. Comme prévu à partir des courbes de fusion, les simulations reflètent étroitement la dépendance expérimentale de TM. La similitude quantitative est également remarquable. Les résultats de la simulation sont systématiquement décalés vers une T plus élevée de 5 à 8 K, soit une différence de moins de 3 %. Pour les expériences et les simulations, la température de fusion est presque indépendante de la concentration en sel pour ≥ 200 mM. Cette indépendance est liée à l’écrantage des interactions électrostatiques à des concentrations élevées en sel ; en conséquence, la figure 3 montre également la longueur d’écrantage de Debye utilisée dans le modèle 3SPN.2 pour l’approximation de Debye-Hückel des interactions électrostatiques. La longueur d’écran est <6 Å à une concentration élevée de sel, rendant la répulsion électrostatique insignifiante. La correspondance entre les valeurs de TM de l’expérience et de la simulation valide le traitement approximatif de l’électrostatique dans le modèle 3SPN.2. Étant donné que le modèle 3SPN.2 n’a été paramétré que pour imiter la fusion de l’ADN B duplex, les données de fusion de la jonction suggèrent que le modèle 3SPN.2 est transférable à la thermodynamique de structures d’ADN plus complexes. En même temps, ce résultat n’est pas entièrement imprévu, puisque la fusion de chaque bras devrait être très similaire à celle de l’ADN duplex ordinaire.

Dépendance de la concentration en sel de la température de fusion de la jonction TM.

À toutes les concentrations, TM diffère de <3% entre les simulations 3SPN.2. simulations (cercles verts) et les expériences d’absorption (diamants rouges). Les lignes sont uniquement destinées à guider l’œil. La figure montre également la longueur d’écran de Debye utilisée par le modèle 3SPN.2 dans l’approximation de Debye-Hückel pour les interactions électrostatiques. Le plateau de la température de fusion coïncide avec un fort criblage des interactions électrostatiques.

L’ajustement des données à l’aide de la relation de van’t Hoff (équation 1) permet d’estimer l’enthalpie et l’entropie de fusion. Les valeurs de ΔH et ΔS de cet ajustement sont du bon ordre de grandeur qui serait attendu sur la base des paramètres thermodynamiques déterminés par SantaLucia et ses collaborateurs47,48. L’encart de la figure 4 montre que les simulations surestiment modestement les valeurs de ΔH et de ΔS, par rapport aux expériences, et que ΔH varie presque linéairement avec ΔS. Cette relation linéaire est parfois qualifiée de relation de  » compensation « . En fait, l’équation de van’t Hoff implique une relation spécifique entre ΔH et ΔS

Thermodynamique de la fusion des jonctions.

L’entropie ΔS et l’enthalpie ΔH de la fusion obtenues en ajustant les expériences (diamants rouges) et les simulations (cercles verts) à l’équation de van’t Hoff (équation 1). L’encart montre une relation linéaire approximative de compensation entropie-enthalpie. Les données expérimentales et simulées montrent un meilleur accord avec l’équation de van’t Hoff évaluée à TM (éq. 2, ligne bleue).

qui découle de l’éq. 1 en fixant α = 1/2 à TM. La figure 4 démontre la cohérence avec cette relation et clarifie le fait que la compensation linéaire entre ΔH et ΔS n’est qu’approximative ; si les valeurs de TM variaient plus significativement avec la concentration, les écarts de linéarité entre ΔH et ΔS seraient plus apparents, alors que l’éq. 2 devrait rester valide. Plus important d’un point de vue pratique est que ces résultats démontrent l’efficacité du modèle 3SPN.2 à reproduire les caractéristiques énergétiques et thermodynamiques des jonctions qui sont en accord étroit avec les données expérimentales.

Abondances conformationnelles et structure

Pour sonder davantage la capacité du modèle 3SPN.2 à prédire les propriétés expérimentales des jonctions, nous examinons la population relative des conformations des jonctions. Expérimentalement, on sait que la forme plane ouverte est prédominante à faible concentration en sel, et, à plus forte concentration en sel, les jonctions adoptent des conformations empilées (Fig. 1). À une concentration relativement élevée = 50 mM et T = 298 K, les expériences indiquent une abondance relative de 23/77% des isoformes I/II empilées, respectivement15. Ici, nous utilisons le modèle 3SPN.2 pour examiner une large gamme de concentrations de sel à T = 300 K pour valider le modèle et fournir une prédiction pour la dépendance globale de la concentration de sel des populations de jonction. Notez que nous examinons l’effet de Na+, plutôt que Mg2+, qui donne des résultats similaires16,45.

Comme Thirumalai et ses collègues l’ont souligné26, la correspondance entre une moyenne temporelle et la moyenne d’ensemble (ergodicité) pour les jonctions à quatre voies peut être rompue sur des échelles de temps d’observation assez grandes, en raison du taux de conversion entre les conformations de la jonction. Ainsi, pour estimer les populations relatives des conformères empilés, nous avons besoin d’un ensemble significatif de simulations. En conséquence, pour chaque concentration de sel, nous effectuons 100 simulations indépendantes, chacune partant de la configuration ouverte, puisque cette conformation se convertit rapidement et aléatoirement en iso-I ou iso-II. Chaque simulation est exécutée pendant 2 μs, ce qui donne un total de 200 μs de données de trajectoire pour chaque concentration de sel, réparties entre 100 échantillons indépendants. Cela fournit une estimation initiale de la population relative de chaque conformation. Sur la base de cette estimation, nous effectuons 100 autres simulations en utilisant un ratio de configurations initiales ouvertes, iso-I ou iso-II conformes à l’estimation préliminaire de la population, afin de voir si nos résultats sont sensibles au fait de commencer à partir de l’état ouvert. Nous constatons que les estimations de population restent stables dans les limites de notre incertitude statistique, de sorte que nous ne trouvons pas d’effets significatifs dus au démarrage à l’état ouvert. Nos résultats sont affectés si nous utilisons soit toutes les configurations initiales iso-I ou toutes les configurations initiales iso-II, en raison de l’inter-conversion relativement lente de ces états.

Pour évaluer les populations de jonction, nous devons identifier une métrique qui distingue avec précision les trois conformations primaires de la jonction. Expérimentalement, les études FRET utilisent généralement la distance entre les extrémités des bras sélectionnés (qui définit l’angle inter-duplex) pour distinguer les états conformationnels. Nous avons d’abord examiné l’angle inter-duplex, mais nous avons constaté (comme nous le verrons plus loin) que l’IDA fluctue considérablement dans chaque isoforme, ce qui rend difficile la distinction sans ambiguïté des conformations. Au lieu de cela, nous avons trouvé que les séparations inter-bases près du cœur de la jonction fournissent un indicateur plus fiable de la conformation de la jonction. Ces distances devraient également être accessibles expérimentalement en utilisant une paire d’analogues de bases nucléotidiques fluorescents, tels que la 6-méthyl isoxanthoptérine (6-MI) ou la 2-aminopurine, placés judicieusement près du centre de la jonction. Les panneaux inférieurs de la figure 1 montrent les huit bases au cœur de la jonction dans les conformères iso-I et iso-II, ainsi que dans la forme ouverte. Dans le conformateur iso-I, la séparation dTT des bases T (sur les brins X et H) et la séparation dCC des bases C (également sur les brins X et H) sont beaucoup plus petites que les séparations dAG des bases A et G (sur les brins B et R) ; dans le conformateur iso-II, l’empilement inverse conduit au comportement opposé des distances relatives. Dans la forme ouverte, toutes ces distances sont similaires, mais plus grandes que les distances des conformères iso-I et II empilés.

On devrait donc pouvoir distinguer les iso-I et II simplement sur la base de ces séparations inter-bases. Pour confirmer cela, dans la figure 5, nous traçons la distribution de fréquence normalisée des distances inter-bases P(dTT ∪ dCC) et P(dAG), qui démontre la présence de deux pics distincts pour toutes les concentrations ≥50 mM. Pour P(dAG) (figure 5a), le pic à faible séparation indique les états de conformation iso-II et le pic à plus grande séparation est dû aux conformations iso-I ou ouvertes. Pour P(dTT ∪ dCC) (Fig. 5b), le pic à faible distance indique les états iso-I et le pic à plus grande distance est dû soit à des conformations iso-II, soit à des conformations ouvertes. Nous adoptons une coupure de 12 Å de séparation, l’emplacement approximatif du minimum des distributions, pour distinguer les jonctions comme étant le conformère iso-I ou iso-II empilé. Les configurations qui sont identifiées comme n’étant ni iso-I ni II sont classées comme des conformères ouverts. Conformément à l’attente que la conformation ouverte domine à faible concentration de sel, aucune des deux distributions n’a un pic pour une petite séparation et donc presque toutes les configurations à faible concentration de sel sont identifiées avec la conformation ouverte.

Critère pour distinguer les conformations de jonction.

Distribution de la séparation inter-bases au milieu de la jonction pour (a) les bases AG, où une petite séparation identifie le conformateur iso-II et (b) les paires TT ou CC, où une petite séparation identifie le conformateur iso-I. Le pic de distance le plus long à faible concentration en sel est dû à des conformations ouvertes ; à plus forte concentration en sel, il provient principalement de la forme complémentaire empilée. La ligne pointillée verticale indique le critère de coupure que nous utilisons pour identifier ultérieurement les états conformationnels des configurations individuelles.

En utilisant ces critères pour distinguer les conformères, nous identifions les configurations individuelles avec l’un des trois isomères et montrons des séries temporelles représentatives des conformations de jonction pour cinq simulations à = 300 mM dans la figure 6a. La figure 7a montre des configurations représentatives de ces conformères. Les données des séries temporelles montrent qualitativement que la conformation ouverte est extrêmement courte et agit comme un état de transition entre les conformères iso-I et iso-II à longue durée de vie. Ceci a déjà été déduit d’expériences sur des molécules uniques8,15,16,50 et dans cette étude, nous observons et confirmons explicitement le mécanisme de transition entre les états de conformation à l’équilibre. Nous démontrons quantitativement le rôle de la conformation ouverte comme intermédiaire en évaluant les neuf probabilités de transition (y compris les transitions vers la même conformation) entre les trois conformères. La figure 6b montre que les probabilités de transition pour Iso I→II et II→I sont vanishingly petites à l’échelle de ces graphiques (zéro, dans les limites de l’incertitude de notre calcul). Par conséquent, le seul chemin entre les conformères empilés passe par le conformère ouvert, l’établissant comme l’état de transition. La figure 6c montre comment les probabilités de transition entre les conformères empilés et ouverts varient avec la concentration en sel, les transitions vers l’état ouvert étant dominantes à faible concentration en sel. Les cinq séries temporelles de la figure 6a montrent également que la moyenne temporelle des données varie d’un échantillon à l’autre. Il est clair que 2 μs est inadéquat pour un échantillonnage ergodique des abondances conformationnelles et nécessite notre approche consistant à utiliser un ensemble de simulations. Cette approche est possible pour le modèle à gros grains, mais dépasse les ressources informatiques actuelles pour un modèle tous atomes. Cette « ergodicité brisée » est similaire à la découverte expérimentale que l’échantillonnage conformationnel est non-ergodique sur de grandes échelles de temps26. Cependant, nous devons prendre soin de souligner que l’ergodicité brisée ici est entièrement due à la nature stochastique de l’échantillonnage conformationnel, alors que dans les expériences de la réf. 26, les variations de la liaison des ions aux jonctions individuelles jouent également un rôle.

Variations d’une molécule à l’autre de l’échantillonnage conformationnel et des probabilités de transition conformationnelle.

(a) Exemple de séries temporelles de conformations de jonctions pour cinq des 100 membres de l’ensemble à = 300 mM. L’isoforme ouverte est de courte durée et agit comme un état de transition entre l’iso-I et l’iso-II. (b) Matrice des probabilités de transition d’un état de départ donné à l’état final à = 300 mM. Les probabilités de transition vers le même état (éléments diagonaux) ne sont pas représentées, car la tendance à rester dans l’état actuel domine l’échelle des autres probabilités de transition49. Notez que les probabilités de transition pour iso I→II (et vice-versa) sont presque nulles. (c) Dépendance de la concentration en sel des quatre probabilités de transition clés.

Conformations de la jonction, abondance et structure.

(a) Conformations représentatives observées dans nos simulations ; seul le squelette de l’ADN est représenté, par souci de simplicité. (b) L’abondance relative des isoformes primaires en fonction de la concentration en sel. Les identités des isoformes sont définies par les séparations des bases à l’intérieur de la jonction, comme décrit dans le texte. (c) Angle inter-duplex (IDA) pour chaque conformation. Notez que la conformation plane ouverte n’est prédominante qu’à faible concentration en sel. A plus haute teneur en sel, la petite fraction de conformations ouvertes échantillonnées adopte (en moyenne) une conformation tétraédrique.

Sur la base des données de séries temporelles pour la conformation de la jonction, nous évaluons directement la fraction de configurations dans les conformations ouvertes, iso-I ou iso-II en fonction de la concentration en sel (Fig. 7b). Comme nous nous y attendions, pour de faibles concentrations en sel (= 10 mM), nous n’observons essentiellement que l’état plan ouvert à géométrie carrée. À toutes les concentrations de sel plus élevées, les conformères empilés sont préférés, avec une moyenne de ≈58% dans l’iso-II et 36% dans l’iso-I (pour ≥200 mM). Nos simulations prédisent que, sauf pour des concentrations en sel plutôt faibles, la fraction relative des conformères ne dépend pas significativement du sel. La dominance des conformations empilées à haute concentration en sel peut être attendue en raison du fort criblage des interactions électrostatiques, similaire à la dépendance de la température de fusion à la concentration en sel. Cependant, ce filtrage n’explique pas le biais vers la conformation iso-II empilée. La différence dans la population d’isomères doit être due à des effets de séquence de base près du noyau de la jonction, comme observé expérimentalement16,17. Le fait que le modèle reproduise le biais connu expérimentalement vers l’iso-II indique le degré de réussite du modèle à gros grains à capturer la structure dépendante de la séquence. Nous trouvons également une petite fraction, 6 %, de configurations de jonction à l’état ouvert à haute teneur en sel. Comme discuté ci-dessus, ces conformations sont de courte durée et facilitent les transformations entre les conformations empilées. Comparé aux expériences de Ha et de ses collègues15 à des concentrations de sel relativement élevées, le modèle 3SPN.2 sous-prévoit le biais vers l’iso-II d’environ 15 %. Cette différence peut être due en partie à la différence entre les critères expérimentaux et informatiques utilisés pour définir les isoformes ; plus précisément, nous examinons les séparations des bases à l’intérieur de la jonction, alors que les expériences FRET utilisent des marqueurs qui sont sensibles à la séparation des extrémités des bras R et X de la jonction (en fait l’IDA). Pour les conformations de type H avec un centre de jonction ouvert (observé expérimentalement en présence d’endonucléases12), ces approches alternatives différeraient systématiquement dans leur classification : (i) sur la base des extrémités de la jonction, les conformations H seraient classées comme iso-I ou II ; (ii) à l’inverse, sur la base de la séparation au cœur de la jonction, les conformations H seraient classées comme ouvertes, de sorte que nos critères donneront toujours une fraction empilée plus petite.

Puisque nos critères nous permettent de catégoriser les conformations des configurations de jonction individuelles, nous pouvons également évaluer directement la structure moyenne de chacune de ces conformations. Nous caractérisons la structure de la jonction par l’angle inter-duplex (IDA), que nous définissons par l’angle formé par les bras XR et RH avec le sommet de la jonction51. En conséquence, l’IDA de l’iso-II devrait être sensiblement plus petit que celui de l’iso-I. La figure 7c confirme cette attente, l’IDA de l’iso-II approchant 90° à une concentration élevée en sel et l’IDA de l’iso-I près de 140°. Une valeur de 90° pour l’iso-II est importante par rapport aux estimations expérimentales, qui sont de l’ordre de 40-60° sur la base des mesures FRET à l’équilibre41,44,45, un point sur lequel nous reviendrons. Nous devons également préciser que 90° pour l’iso-II n’implique pas une configuration plane, ce qui est visuellement apparent dans les configurations représentatives présentées sur la figure 7a ; en raison de la structure tridimensionnelle, même une structure empilée peut adopter un angle proche de 90°. Aux concentrations de sel les plus faibles, nous ne pouvons pas estimer l’angle pour les conformations empilées, car elles ne sont essentiellement pas échantillonnées. À = 10 mM, nous trouvons que l’IDA de la jonction ouverte est de 95°, ce qui est cohérent avec une jonction presque plane, ce qui est également visuellement apparent dans la Fig. 7a. À des concentrations de sel plus élevées, la petite fraction de configurations ouvertes adopte un angle un peu plus grand de ≈105°. Cet angle plus important est cohérent avec une configuration presque tétraédrique (Fig. 7a), qui devrait peut-être être considérée comme distincte de la configuration ouverte planaire à faible concentration en sel. Ainsi, nos résultats suggèrent que les états de transition entre les conformères empilés sont principalement des conformations tétraédriques ouvertes, plutôt que planaires. De tels intermédiaires de type tétraédrique ont été observés précédemment dans des simulations23. En effet, la possibilité d’une multitude de conformations de jonction a été déduite de l’analyse de données de molécules uniques26.

Comparaisons de structures de jonction

Comme dernier point de comparaison, nous examinons comment l’IDA évalué à partir du modèle 3SPN.2 se compare aux mesures expérimentales et à celui estimé à partir de notre simulation AMBER tout atome. Les mesures FRET ont estimé que l’IDA de l’iso-II est de 43 ± 8° à T = 283 K et à une concentration en sel = 200 mM45. Par conséquent, nous simulons les modèles AMBER et 3SPN.2 dans les mêmes conditions, en commençant par une configuration initiale de l’iso-II avec un IDA de 43° (voir Fig. 1b). Pour les modèles 3SPN.2 et AMBER, la jonction s’ouvre à un IDA plus grand et se stabilise à une valeur stable après ≈50 ns (encart Fig. 8). Le panneau principal de la figure 8 montre les valeurs IDA échantillonnées par chaque modèle dans l’état d’équilibre. Le modèle 3SPN.2 présente des fluctuations plus importantes de l’IDA que le modèle AMBER, bien que l’IDA moyen soit similaire dans les deux modèles. Quantitativement, pour le modèle AMBER, l’IDA moyen est de 85,3° avec un écart type de 12,3° ; pour le modèle 3SPN.2, l’IDA moyen est de 95,7° avec un écart-type de 24,1°.

Comparaison de la structure de jonction entre les modèles tout atome et à gros grains.

L’IDA pour le modèle tout atome AMBER (noir) et le modèle à gros grains 3SPN.2 (rouge). (rouge) à T= 283 K et = 200 mM. Le panneau principal montre la distribution des valeurs IDA échantillonnées ; les lignes pleines correspondent à la fréquence calculée et les lignes pointillées à une distribution normale avec la même moyenne et le même écart-type que les données. L’encart montre la série chronologique originale pour chaque modèle, à partir de laquelle les distributions sont déterminées. Notez que pour le modèle 3SPN.2, nous disposons de 2 μs de données, qui ne sont pas toutes montrées dans l’encart.

Les simulations montrent toutes deux un IDA sensiblement plus grand que celui anticipé à partir des mesures FRET et des études cristallographiques45,52. Cela peut suggérer qu’aucun modèle ne fournit une estimation précise de l’IDA, ou que les approximations qui doivent être faites pour estimer l’IDA à partir des données FRET sous-estiment l’IDA. Il est certain que dans les expériences FRET en vrac, la présence des colorants externes, de leurs lieurs associés et de leur orientation relative peut introduire une erreur considérable dans la détermination de la distance. Les différences entre les déterminations actuelles de l’IDA et celles mesurées par cristallographie pourraient peut-être provenir de certaines contraintes du réseau cristallin. En comparant les modèles tout-atome et à gros grains, le quasi-doublement de l’écart-type montre clairement que les bras de jonction sont plus flexibles dans le modèle à gros grains. Cela peut être dû en partie à l’absence de solvant explicite, puisque l’eau solvante dans la représentation tout-atome entrave nécessairement la flexibilité des bras de jonction.