Isolement bactérien et identification par RdFucI

Une colonie qui s’est développée dans le milieu contenant du l-fucoidan provenant de Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) comme seule source de carbone a été isolée d’un intestin d’ormeau récolté en Corée du Sud (fichier additionnel 1 : Fig. S1). La comparaison de l’identité de séquence basée sur l’ARN ribosomal 16S avec la base de données NCBI a révélé que l’isolat était phylogénétiquement proche des membres du genre Raoultella (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1). Ainsi, la souche isolée a été identifiée comme Raoultella sp. KDH14. Après avoir effectué le séquençage complet du génome, RdFucI a été identifié à partir de Raoultella sp. KDH14 sur la base de l’identité de la séquence du gène.

RdFucI est composé de 595 acides aminés avec une masse moléculaire de 65,5 kDa et un point isoélectrique de 5,5. Les résultats de l’outil de recherche d’alignement local de base (BLAST) ont indiqué l’identité de séquence élevée de RdFucI (> 90%) avec d’autres l-FucI de diverses bactéries appartenant aux familles Raoultella, Klebsiella et Citrobacter.

Le RdFucI identifié a été surproduit dans E. coli BL21(DE3) avec le tag hexa-histidine N-terminal et purifié par chromatographie d’affinité his-tag. Lorsqu’elle a été analysée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE), la bande unique est apparue autour de 65 kDa, ce qui correspond à la masse moléculaire calculée de la sous-unité monomère.

La réaction catalysée par RdFucI favorise la formation de l-fucose

Pour examiner l’activité isomérase de RdFucI, la réaction enzymatique a été réalisée avec l-fucose ou l-fuculose comme substrat (figure 2). Les activités enzymatiques pour les réactions avant (l-fucose vers l-fuculose) et arrière (l-fuculose vers l-fucose) ont été déterminées. La production de l-fuculose à partir de l-fucose a été confirmée par la chromatographie sur couche mince (CCM) et l’analyse par chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (CG/SM) (fichier supplémentaire 2 : figure S2). Dans l’interconversion entre le l-fucose et le l-fuculose, aucun produit secondaire n’a été observé, ce qui signifie qu’un substrat donne un produit (fichier supplémentaire 2 : Fig. S2). Ainsi, nous considérons qu’il est raisonnable d’utiliser la quantité calculée de concentration de l-fuculose en mesurant expérimentalement la quantité de l-fucose.

Conversion enzymatique de a l-fucose en l-fuculose (réaction directe) et b l-fuculose en l-fucose (réaction inverse) par RdFucI. La réaction enzymatique a été réalisée par 3 µg de RdFucI avec soit a l-fucose ou b l-fuculose à 10 mM comme substrat de départ à 30 °C pendant 10 min dans 20 mM de phosphate de sodium (pH 7,0) en présence de 1 mM de Mn2+. La concentration de l-fucose a été mesurée expérimentalement et la concentration de l-fuculose a été calculée en soustrayant la concentration de l-fucose déterminée expérimentalement de la concentration totale de sucre (10 mM). Les données expérimentales représentent les moyennes ± les écarts types de trois répétitions

La réaction inverse était 6,6 fois plus rapide que la réaction directe, et l’activité spécifique pour le l-fuculose (63,9 U/mg) était supérieure à celle du l-fucose (9,6 U/mg). Dans les deux réactions, le rapport d’équilibre entre le l-fucose et le l-fuculose, qui a été déterminé expérimentalement, était d’environ 9:1, ce qui donne une constante d’équilibre (Keq) de 0,11. La valeur de Keq a également été déterminée théoriquement comme étant de 0,23, sur la base de la relation thermodynamique entre le changement d’énergie libre de Gibbs standard de la réaction et Keq à l’équilibre, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{\text{eq}}\), où R et T représentent respectivement la constante des gaz (8,314 J/mol K) et la température (K). \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }\) représente le changement d’énergie libre de Gibbs standard pour la réaction du l-fucose en l-fuculose (0,859993 kcal/mol), qui est répertorié dans la base de données BioCyc (https://biocyc.org). Il y avait une certaine divergence entre les valeurs expérimentales et théoriques de Keq. Un Keq < 1 indique que la réaction inverse est favorisée. L’isomérisation catalysée par RdFucI a favorisé la réaction inverse, produisant du l-fucose à partir de l-fuculose avec un rendement d’environ 90 % à 30 °C et à pH 7.

Effet de la température et du pH sur l’activité de RdFucI et l’équilibre

Des réactions enzymatiques ont été réalisées à diverses températures allant de 10 à 80 °C et à des pH allant de 4 à 11 en utilisant le l-fuculose comme substrat (figure 3). L’isomérisation du l-fuculose en l-fucose par RdFucI dépendait fortement de la température, et des activités maximales ou quasi-maximales (> 80% du maximum) ont été présentées à des températures allant de 30 à 50 °C (Fig. 3a). Pour étudier l’effet de la température sur l’équilibre de l’isomérisation du l-fucose en l-fuculose, le rapport d’équilibre a été étudié à 30, 40 et 50 °C où des activités maximales ou quasi-maximales (> 80 % du maximum) ont été présentées. En conséquence, il n’y avait pas de différence significative dans le rapport d’équilibre entre les trois températures (l-fucose/l-fuculose = 9:1 ; p > 0,05). En d’autres termes, le l-fucose a été synthétisé à partir du l-fuculose avec un rendement d’environ 90 % à toutes les températures testées (fichier supplémentaire 3 : figure S3a).

Effet de a température et b pH sur l’activité relative de RdFucI contre le l-fuculose. Les réactions enzymatiques ont été réalisées a à différentes températures allant de 10 à 80 °C et b à différents pH allant de 4 à 11. Les tampons utilisés étaient les suivants : acétate de sodium 50 mM (pH 4, 5 et 6), phosphate de sodium 50 mM (pH 6, 7 et 8), Tris-HCl 50 mM (pH 7, 8 et 9) et glycine-NaOH 50 mM (9, 10 et 11). Les données expérimentales représentent les moyennes ± les écarts types de trois répétitions

L’effet du pH a été étudié. Des activités élevées de RdFucI (> 70% du maximum) ont été observées à des pH alcalins et presque neutres (pHs 9, 10 et 11 et pHs 6, 7 et 8). En dessous de pH 6, l’activité enzymatique a fortement diminué, avec peu d’activité observée à pH 4. Malgré les activités spécifiques élevées dans des conditions alcalines, le rendement en l-fucose à l’équilibre (incubation de 60 minutes) était beaucoup plus faible à pH 10 (54 %) qu’à pH 7 (88 %) (fichier supplémentaire 3 : figure S3b). Les activités relatives à pH 7, 8 et 9 étaient beaucoup plus faibles dans le tampon Tris-HCl que les activités dans le tampon acétate de sodium ou glycine-NaOH, ce qui implique que le Tris inhibe fortement l’activité enzymatique de RdFucI. Les expériences enzymatiques précédentes dans cette étude ont été réalisées dans des mélanges réactionnels contenant du Tris à 1 mM, qui provenait de l’étape de changement de tampon après la purification de l’enzyme. Pour examiner si le Tris dans le mélange réactionnel pouvait inhiber RdFucI, les activités d’isomérisation des réactions se produisant en l’absence et en présence de 1 mM de Tris ont été comparées (fichier supplémentaire 4 : Fig. S4). Aucune différence significative n’a été mise en évidence dans les activités enzymatiques des deux réactions, ce qui indique que 1 mM de Tris n’a pas inhibé l’activité de RdFucI.

Effet des ions métalliques sur l’activité de RdFucI

Les sucres isomérases, y compris les l-fucose isomérases, nécessitent des cations divalents, tels que Mn2+ et Co2+, comme cofacteurs pour leurs activités d’isomérisation . Pour étudier l’effet des cations divalents sur l’activité catalytique de RdFucI sur le l-fuculose, l’activité enzymatique a été testée en l’absence et en présence de 1 mM de divers ions métalliques ou d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (Tableau 1). L’enzyme RdFucI native non exposée aux ions métalliques ou à l’EDTA a montré une faible activité, et la chélation des métaux par l’EDTA a réduit l’activité enzymatique. Parmi les ions métalliques testés, Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ et Zn2+ ont entraîné une augmentation prononcée de l’activité enzymatique. En particulier, l’ajout de Mn2+ a augmenté au maximum l’activité de RdFucI d’environ 7,4 fois. En revanche, Ca2+, Cu2+, et Fe3+ ont plutôt inhibé l’activité de RdFucI.

Spécificité du substrat et paramètres cinétiques de RdFucI

En général, les sucres et les sucres phosphates isomérases affichent une large spécificité envers divers substrats . Pour évaluer si l’activité favorisant le cétose de RdFucI montrée avec l-fuculose était également évidente avec d’autres substrats, la spécificité du substrat de RdFucI a été étudiée contre divers sucres aldose (l-fucose, d-arabinose, d-altrose, d-galactose, d-mannose et d-glucose) et leurs sucres cétose correspondants (l-fuculose, d-ribulose, d-psicose, d-tagatose et d-fructose) (Fig. 4). Parmi tous ces substrats, y compris les sucres aldose et cétose, les activités les plus élevées ont été observées avec le l-fuculose (115,3 U/mg) et le d-ribulose (127,3 U/mg), qui sont tous deux des sucres cétose. Les activités de RdFucI pour le l-fuculose et le d-ribulose étaient beaucoup plus élevées que celles pour les autres substrats. Parmi les sucres aldoses, l’activité pour le l-fucose était la plus élevée (21,0 U/mg), les autres substrats produisant des activités spécifiques allant de 4,7 à 7,9 U/mg. Les sucres cétoniques autres que le l-fuculose et le d-ribulose ont présenté des activités spécifiques de 0,0 à 10,8 U/mg. Ainsi, le l-fuculose et le d-ribulose étaient les substrats préférés de RdFucI et l’activité favorisant le cétose de RdFucI a été montrée uniquement avec le l-fuculose et le d-ribulose.

Spécificité du substrat de RdFucI. Les réactions enzymatiques ont été réalisées contre 10 mM de divers substrats d’aldose et de cétose à 40 °C et à pH 10. Pour les substrats d’aldose, le l-fucose, le d-arabinose, le d-altrose, le d-galactose, le d-mannose et le d-glucose ont été utilisés. Pour les substrats de cétose, on a utilisé le l-fuculose, le d-ribulose, le d-psicose, le d-tagatose et le d-fructose. Les données expérimentales représentent les moyennes ± les écarts types de trois répliques

Les paramètres cinétiques ont été déterminés en utilisant le l-fuculose et le d-ribulose comme substrats (fichier additionnel 5 : tableau S1). Les valeurs de Km (constante de Michaelis) et de kcat (nombre de rotation du substrat) pour le l-fuculose étaient 1,9- et 1,2-fois plus faibles, respectivement, que celles pour le d-ribulose. L’efficacité catalytique de RdFucI, représentée par kcat/Km, pour le l-fuculose, était 1,5 fois plus élevée que celle du d-ribulose, indiquant que le l-fuculose est préféré comme substrat de RdFucI.

Structure cristalline globale de RdFucI

Pour mieux comprendre la fonction moléculaire, nous avons déterminé la structure cristalline de RdFucI (fichier additionnel 6 : tableau S2). La carte de densité électronique de RdFucI était bien définie à partir des résidus Ser5-Arg591 pour six sous-unités dans l’unité asymétrique. Le monomère RdFucI est constitué de 19 α-hélices et 23 β-brins comprenant les domaines N1, N2 et C (Fig. 5a). Le domaine N1 (Ser5-Met172) adopte un pli α/β et est impliqué dans la reconnaissance du substrat de la formation hexamérique de RdFucI. Les domaines N2 (Lys173-Leu352) et C (Thr353-Arg591) contiennent les résidus de liaison métallique impliqués dans l’activité catalytique (Fig. 5a). Dans l’unité asymétrique, les sous-unités de RdFucI forment la formation hexamérique arrangée comme un dimère de trimères avec une pseudo-symétrie D3h (Fig. 5b). Ceci est cohérent avec le résultat de la chromatographie d’exclusion de taille analytique dans laquelle RdFucI a été révélé pour exister comme un homohexamère en solution (fichier supplémentaire 7 : Fig. S5).

Structure globale de RdFucI. a Représentation cartoon du monomère RdFucI. Le monomère RdFucI est composé des domaines N1- (jaune), N2- (rose) et C-(vert). b Représentation de surface de l’hexamère RdFucI. Les sous-unités A, B, C, D, E et F sont colorées en jaune, rose, cyan, violet, vert et orange, respectivement. Un site de liaison métallique sur un site de poche de liaison au substrat est indiqué par un point rouge

Dans la formation hexamérique, la sous-unité A (surface totale : 23011.7 Å2) interagit avec quatre sous-unités différentes B (résidus dans l’interface : 47/surface brute : 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2) et E (34/1086,2 Å2). La sous-unité A n’interagit pas avec la sous-unité F restante (Fig. 5b). La sous-unité A de RdFucI a une surface totale enterrée de 2569.1 Å2, représentant 27.45% de la surface totale. Cette interface enterrée est stabilisée par une interaction impliquant 59 liaisons hydrogène et 26 ponts salins provenant d’autres sous-unités (fichier supplémentaire 8 : tableau S3, fichier supplémentaire 9 : tableau S4, fichier supplémentaire 10 : tableau S5, fichier supplémentaire 11 : tableau S6).

Site de liaison du substrat et site actif de RdFucI

La poche de liaison du substrat est formée par les domaines N2 et C de la sous-unité A et le domaine N1 de la sous-unité B (Fig. 6a-c) et comporte un total de six sites de liaison du substrat dans l’homohexamère RdFucI. L’entrée de la poche de liaison du substrat, où le substrat s’approche, est d’environ 11 × 12,5 Å (Fig. 6a). La poche de fixation du substrat, où le site de fixation du métal est formé, a une surface chargée négativement d’environ 4 × 5 Å (Fig. 6b). La distance entre le site de liaison au métal et la surface de la poche de liaison au substrat est d’environ 16,7 Å (Fig. 6d), ce qui implique que le centre actif est situé profondément dans une poche. Cela indique que la chaîne ouverte et la forme cyclique du substrat sont toutes deux accessibles au centre du site actif et que, inversement, un saccharide en vrac ne serait pas accessible au site actif existant à l’intérieur de la poche de liaison du substrat.

Poche de liaison au substrat et site actif de RdFucI. a La poche de liaison au substrat est formée par assemblage par les sous-unités A et C. b Surface électrostatique de la poche de liaison au substrat. c Présentation du facteur B de la surface de liaison du substrat. d Vue en coupe de la surface de la poche de liaison du substrat. e Carte de densité électronique 2Fo-F (maille grise, contour à 1,0 σ) sur les sites de liaison du métal de RdFucI trempé dans une solution contenant 10 mM de Mn2+. f Analyse géométrique des sites de liaison Mn2+ de RdFucI

RdFucI nécessite des ions métalliques divalents pour son activité catalytique pour la réaction d’isomérisation en utilisant le mécanisme ene-diol . Le site de liaison métallique de RdFucI devrait être coordonné avec Mn2+ par les résidus conservés Glu337, Asp359, et His528 (fichier additionnel 12 : Fig. S6). Cependant, il n’y a pas de carte de densité électronique Fo-Fc (comptée à > 5σ) qui est suspectée d’être liée au Mn2+ en tant que métal essentiel pour la liaison du substrat (Additional file 13 : Fig. S7a). L’analyse du facteur B a révélé que le facteur de température de Mn2+ (70,53 Å2) est plus élevé que le facteur de température moyen de la protéine (36.22 Å2), indiquant que Mn2+ est présent sur RdFucI avec une faible occupation. Cette constatation est cohérente avec le résultat de l’analyse biochimique dans laquelle l’enzyme native a montré un faible niveau d’activité. D’autre part, l’ajout de Mn2+ a considérablement augmenté l’activité catalytique de RdFucI (Tableau 1). Ainsi, nous avons supposé que l’ajout de Mn2+ au cristal de RdFucI augmenterait l’occupation de la liaison du Mn2+. Après avoir trempé les cristaux de RdFucI dans une solution de Mn2+ 10 mM, une densité électronique Fo-Fc fiable (> 6σ) sur le site de liaison du métal a été observée où la position du Mn2+ a été clarifiée dans toutes les sous-unités (Fig. 6e et fichier additionnel 13 : Fig. S7b). Cependant, le facteur B de température du Mn2+ (76,56 Å2) était plus élevé que celui de la protéine entière (60,69 Å2), ce qui implique que l’ion Mn2+ n’est pas encore entièrement occupé dans le site de liaison au métal. Mn2+ était coordonné par les atomes OE1 (distance moyenne : 2,62 Å) et OE2 (2,65 Å) de Glu337, les atomes OD1 (2,72 Å) et OD2 (2,72 Å) de Asp361, l’atome NE2 (2,52 Å) de His528, et la molécule d’eau (2,79 Å) (Fig. 6e). Les angles de liaison moyens de Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2), et Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) étaient respectivement de 127,32°, 86,25°, et 73,96°. L’angle de liaison entre les ligands et Mn2+ a montré une coordination octaédrique distordue.

Comparaison structurelle avec d’autres l-FucIs

Le serveur DALI a été utilisé pour rechercher des homologues structurels. Cette recherche a révélé que RdFucI est similaire aux l-FucIs de E. coli (EcFucI, code PDB 1FUI, score Z : 60,6, rmsd : 0,3 pour 587 atomes Cαs), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, score Z : 56.6, rmsd : 0,7 pour 580 atomes Cαs), et Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, score Z : 55,9, rmsd : 0,7 pour 585 atomes Cαs). La superposition de la poche de liaison au substrat a montré que les résidus de liaison au métal Glu337, Asp361 et His528 (numérotés dans RdFucI) sont positionnellement identiques aux autres protéines, alors que les résidus de reconnaissance du substrat (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 et Asn524) présentent une légère différence conformationnelle dans leurs chaînes latérales (figure 7a). En particulier, la boucle α7-α8 de chaque l-FucI, qui se trouve à la surface de la poche de liaison du substrat, a une conformation différente. L’alignement des séquences des l-FucIs a montré une grande similarité, mais la séquence de la boucle α7-α8 de chaque l-FucI était très variable (Fig. 7b). Comme la boucle α7-α8 est impliquée dans la formation de l’architecture de la poche de liaison au substrat, chaque l-FucI forme une poche de liaison au substrat unique (Fig. 7c). Les l-FucIs ont généralement une surface chargée négativement autour du site de liaison au métal, mais la surface de la poche de liaison au substrat présente différents états de charge (Fig. 7c). Par conséquent, les différences structurelles de la boucle α7-α8 entraîneront des différences dans la spécificité du substrat des l-FucIs.

Comparaison structurelle de RdFucI avec d’autres l-FucIs. Superposition a du site actif et b de la surface de liaison du substrat de RdFucI avec EcFucI (code PDB : 1FUI), ApFucI (3A9R) et SpFucI (4C20). Vue rapprochée de la grande différence de conformation des boucles α8-α9 des l-FucIs (à gauche). c Alignement partiel des séquences pour la région des boucles α8-α9 pour le RdFucI et EcFucI, ApFucI et SpFucI. d Représentation de la surface électrostatique du RdFucI, EcFucI, ApFucI et SpFucI. La poche profonde de liaison au substrat et les régions de boucle α8-α9 sont indiquées par des lignes de points orange et noirs, respectivement. Un site de liaison métallique est indiqué par un astérisque jaune

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