Informations de base
La transfection d’ADN par électroporation est une technique établie qui est applicable à peut-être tous les types de cellules. Elle donne une fréquence élevée de transformants stables et présente une efficacité élevée d’expression transitoire des gènes. Il a été démontré que l’électroporation est efficace pour délivrer de l’ADN plasmidique in vivo à une variété de types de tissus. L’électroporation utilise le fait que la membrane cellulaire agit comme un condensateur électrique incapable de laisser passer le courant (sauf par les canaux ioniques). L’exposition des membranes à un champ électrique à haute tension entraîne leur rupture temporaire et la formation de pores suffisamment larges pour permettre aux macromolécules (ainsi qu’aux molécules plus petites comme l’ATP) d’entrer ou de sortir de la cellule. La refermeture des pores de la membrane est un processus de décroissance naturelle qui est retardé à 0°C.
Pendant le temps où les pores sont ouverts, l’acide nucléique peut entrer dans la cellule et finalement dans le noyau. L’ADN linéaire à extrémités libres est plus recombinogène et plus susceptible d’être intégré dans le chromosome hôte pour donner des transformants stables. L’ADN super enroulé est plus facilement emballé dans la chromatine et est généralement plus efficace pour l’expression transitoire de gènes.
L’utilisation de chocs électriques à haute tension pour introduire de l’ADN dans les cellules a été réalisée pour la première fois par Wong et Neumann en utilisant des fibroblastes (Wong et Neumann, 1982 ; Neumann et al., 1982). La technique a ensuite été généralisée (Potter et al., 1984) à tous les types de cellules, même celles telles que les lymphocytes qui, contrairement aux fibroblastes, ne peuvent être transfectées par d’autres procédures (par ex,
Oliver Smithies et ses collègues ont ensuite utilisé l’électroporation pour introduire de l’ADN dans des cellules souches embryonnaires (ES) et ont conçu des vecteurs de ciblage qui permettent à l’ADN introduit de se recombiner avec des régions homologues du génome et d’introduire soit un gène modifié, soit une séquence perturbatrice pour générer des cellules ES avec un gène spécifique « knocked in » ou « knocked out ». Les cellules ES modifiées ont ensuite été utilisées pour générer les souris knockin ou knockout correspondantes. L’électroporation était nécessaire pour ces applications de transfert de gènes car elle introduit l’ADN dans les cellules sous une forme nue qui peut facilement participer à la recombinaison homologue. Cette extension de l’électroporation a valu au Dr Smithies de partager le prix Nobel de médecine ou de physiologie 2007. La méthodologie d’électroporation des cellules ES est essentiellement la même que pour les autres cellules de mammifères. Si l’on souhaite remplacer un gène homologue, il faut concevoir des vecteurs qui permettent un dépistage « positif-négatif » (Bronson et Smithies, 1994 ; Joyner 2000), de sorte qu’une première sélection permette de récupérer toutes les cellules dans lesquelles l’ADN électroporé s’est inséré dans le génome, et que la seconde sélection porte sur les clones ES dans lesquels l’ADN s’est inséré de façon aléatoire. Des souris knockin/out peuvent ensuite être générées en fusionnant les cellules ES clonées sélectionnées avec des embryons, en réimplantant pour permettre le développement, et en reproduisant les chimères résultantes pour générer des souris dans lesquelles toutes les cellules portent le gène altéré.
Bien que des plantes entières ou des tissus foliaires aient été signalés comme pouvant être transfectés par électroporation, les cellules végétales doivent généralement être transformées en protoplastes avant que l’ADN puisse y être facilement introduit (protocole alternatif ; Fromm et al., 1985 ; Ou-Lee et al., 1986). Comme les cellules de mammifères, les protoplastes végétaux peuvent être électroporés dans diverses conditions électriques (paramètres critiques). La haute tension avec une faible capacité (courte durée d’impulsion) ou la basse tension avec une forte capacité (longue durée d’impulsion) ont été utilisées pour réussir le transfert de gènes (Chu et al., 1991). La PE in vivo a été utilisée à l’origine pour administrer des agents chimiothérapeutiques à des tumeurs solides et a progressé depuis les études précliniques jusqu’aux essais cliniques (Gothelf, et al., 2003). L’administration in vivo d’ADN plasmidique par électroporation a été rapportée pour la première fois au début ou au milieu des années 1990 (Titomarov, et al., 1991 ; Heller, et al., 1996 ; Nishi, et al., 1996). Il s’agissait d’une avancée logique basée sur le succès des transfections in vitro par électroporation et sur la démonstration que la procédure pouvait être réalisée en toute sécurité in vivo pour l’administration de petites molécules telles que les agents chimiothérapeutiques. L’utilisation de l’électroporation in vivo pour la délivrance d’ADN plasmidique a connu une croissance énorme du nombre d’études précliniques menées et a récemment été traduite en clinique (Heller, et al., 2006a et Bodles-Brakhop, et al.,2009).
La large utilisation de l’électroporation a été rendue possible en grande partie par la disponibilité d’appareils commerciaux qui sont sûrs et faciles à utiliser et qui donnent des résultats extrêmement reproductibles. Les conceptions de ces machines varient considérablement, mais se répartissent en deux catégories de base qui utilisent différents moyens de contrôler la durée et la tension des impulsions (les deux paramètres électriques qui régissent la formation des pores). L’une utilise un système de décharge de condensateur pour générer une impulsion de courant à décroissance exponentielle, et l’autre génère une véritable onde carrée (ou une approximation de celle-ci). Les instruments à décharge de condensateur chargent leur condensateur interne à une certaine tension, puis le déchargent à travers la suspension cellule-ADN. La taille du condensateur et la tension peuvent toutes deux être modifiées. Étant donné que l’impulsion de courant est une fonction à décroissance exponentielle (1) de la tension initiale, (2) du réglage de la capacité de l’instrument et (3) de la résistance du circuit (y compris l’échantillon), la modification de la taille du condensateur pour permettre le stockage d’une plus grande (ou d’une plus petite) charge à la tension entraînera des temps de décroissance plus longs (ou plus courts) et donc une durée d’impulsion effective différente. En revanche, les générateurs d’ondes carrées contrôlent à la fois la tension et la durée de l’impulsion à l’aide de dispositifs de commutation à semi-conducteurs. Ils peuvent également produire des impulsions à répétition rapide. Pour les applications in vivo, les générateurs d’ondes carrées sont préférables. Outre la durée et l’amplitude des impulsions, le nombre d’impulsions et la configuration des électrodes influencent également l’efficacité de la délivrance.
La plupart de nos expériences d’électroporation in vitro ont utilisé le Gene Pulser de Bio-Rad, un dispositif à décharge de condensateur, mais elles sont directement applicables à d’autres dispositifs à décharge de condensateur, et avec quelques ajustements aux générateurs d’ondes carrées. Des appareils à décharge de condensateur sont également disponibles auprès de GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific et International Biotechnologies (voir l’appendice 4 pour les adresses des fournisseurs). Ces appareils, qu’ils soient constitués d’une seule unité ou de composants additionnels, peuvent fournir une variété de conditions d’électroporation adaptées à la plupart des applications. Les générateurs d’ondes carrées sont disponibles auprès de BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan et IGEA et offrent un grand contrôle de la largeur d’impulsion, permettent des impulsions multiples et rapides, et peuvent être plus efficaces pour les cellules très sensibles ou difficiles à transfecter. L’utilisation de l’électroporation pour réaliser une thérapie génique sur des animaux ou des humains vivants nécessite également un bon contrôle des paramètres d’électroporation pour assurer un transfert d’ADN efficace avec un minimum de dommages aux tissus, ce qui nécessite généralement des générateurs à ondes carrées. Les générateurs sont disponibles pour administrer des impulsions à tension constante ou à courant constant. Outre les générateurs à ondes carrées, ces fournisseurs proposent également des électrodes adaptées à l’électroporation in vivo. Ces machines sont généralement plus coûteuses. Il est devenu apparent que les impulsions de courant alternatif à ~100 kHz peuvent être la forme d’onde la plus efficace pour l’électroporation et éventuellement l’électrofusion (Chang, 1989).
La majorité de nos expériences in vivo ont utilisé des générateurs d’ondes carrées BTX T820 ou T830. Ces expériences ont utilisé des électrodes disponibles dans le commerce, telles qu’un réseau de 2 aiguilles, des électrodes à étrier et des électrodes à pince, ainsi que des électrodes conçues sur mesure. Comme mentionné ci-dessus, les principaux fournisseurs d’équipement d’électroporation proposent une variété d’électrodes pénétrantes et non pénétrantes. Les générateurs d’ondes carrées permettent un meilleur contrôle des paramètres d’impulsion, ce qui est particulièrement important lors de l’administration in vivo. La croissance de l’utilisation de l’électroporation in vivo est directement liée à l’efficacité de son administration dans le muscle. L’application de l’administration intramusculaire de gènes par électroporation a été particulièrement importante à des fins de vaccination (Abdulhagg, et al., 2008). Il a également été démontré que le muscle est un excellent dépôt pour les applications de remplacement des protéines par des gènes (Trollet, et al., 2006). L’administration dans les muscles peut également être utilisée pour l’administration de vaccins anticancéreux (Bodles-Brakhop, et al., 2009). L’administration à la peau a également été acceptée comme une cible polyvalente. La délivrance à la peau peut être utilisée pour traiter directement les maladies cutanées, délivrer des protéines dans la circulation pour la thérapie systémique, la thérapie du cancer et pour délivrer des vaccins ADN (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
L’électroporation peut être plus facile à réaliser que les techniques alternatives, c’est pourquoi elle est de plus en plus utilisée. Son inconvénient pour une utilisation avec l’analyse transitoire est qu’il faut presque cinq fois plus de cellules et d’ADN qu’avec la transfection médiée par le phosphate de calcium ou le DEAE-dextran (UNITES 9.1, 9.2 &16.12). La principale différence entre les procédures d’électroporation et de coprécipitation au phosphate de calcium est l’état de l’ADN intégré après sélection dans des milieux antibiotiques appropriés. Dans le cas du phosphate de calcium, la quantité d’ADN absorbée et intégrée dans le génome de chaque cellule transfectée est de l’ordre de 3 × 106 pb. Par conséquent, l’ADN transfecté s’intègre souvent sous forme de grands réseaux en tandem contenant de nombreuses copies de l’ADN transfecté. C’est un avantage lorsqu’on souhaite transfecter de l’ADN génomique dans des cellules réceptrices et sélectionner un changement phénotypique tel qu’une transformation maligne ; dans ce cas, une grande quantité d’ADN intégré par cellule réceptrice est essentielle. En revanche, l’électroporation peut être ajustée pour obtenir une à plusieurs copies d’ADN inséré par cellule réceptrice. Ceci serait un avantage pour les études d’expression génétique, car l’identité de la copie particulière responsable de l’expression du gène peut être contrôlée, et, comme discuté ci-dessus, est essentiel pour le ciblage génétique des cellules ES pour générer des souris transgéniques.