Types d’hémocytes chez les grillons

La figure 1A montre une image de microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) d’hémocytes de grillons, montrant des cellules de différentes tailles et formes. Pour une identification précise de ces hémocytes, environ 1 000 cellules ont été classées selon leur taille et leur morphologie (données non présentées) en six types (Fig. 1B~G). Comme le montre la figure 1B, le granulocyte typique a été observé dans l’hémolymphe. Les granulocytes étaient généralement de forme ronde ou ovale, et de nombreux granules polymorphes étaient observés dans le cytoplasme. De petits pseudopodes ou filopodes ont été observés sur la membrane plasmique des granulocytes (Fig. 1B, indiqués par des flèches blanches). La cellule représentée sur la figure 1C a été considérée comme un plasmatocyte en raison de sa forme fusiforme typique et des longues structures capillaires observées aux deux extrémités de la membrane plasmique (indiquées par des flèches blanches). La figure 1D montre un prohémocyte, qui sont les plus petites cellules rondes observées dans l’hémolymphe des insectes. Les noyaux sont grands par rapport à la taille de la cellule et sont situés au milieu de la cellule (Fig. 1D). Ainsi, le cytoplasme et le noyau des prohémocytes étaient souvent indiscernables. La figure 1E représente un coagulocyte contenant divers granules cytoplasmiques. Les membranes plasmiques des coagulocytes étaient lisses, sans aucune structure, et leurs noyaux étaient grands et facilement observables. Les oenocytoïdes étaient le plus grand type d’hémocyte observé et étaient rares dans l’hémolymphe (Fig. 1F). Les oenocytoïdes avaient généralement une forme d’œuf frit rond avec de nombreux granules cytoplasmiques. La figure 1G montre un sphérulocyte, qui était rond et de taille moyenne avec de nombreux petits granules sombres ou brillants dans le cytoplasme. Comme le montre la figure 1D~G, aucune structure n’était visible sur les membranes plasmatiques des prohémocytes, des coagulocytes, des oenocytoïdes ou des sphérulocytes, qui étaient optiquement très lisses.

Les six types d’hémocytes observés dans le sang des grillons. Forme générale et taille relative des hémocytes dans l’hémolymphe (A). Les six types d’hémocytes trouvés chez G. bimaculatus ont été classés en granulocytes (B ; GR), plasmatocytes (C ; PL), prohémocytes (D ; PR), coagulocytes (E ; CO), oenocytoïdes (F ; OE), et sphérulocytes (G ; AD) en fonction de leur taille et de leur morphologie. Les structures en éventail ou en amibes sur la membrane plasmique des granulocytes et des plasmatocytes sont indiquées par des flèches blanches (B et C). Barre d’échelle = 25 µm (A) ou 10 µm (B~G).

Nodulation et encapsulation par les hémocytes

Chez les insectes, les réponses immunitaires cellulaires telles que la nodulation, l’encapsulation et la phagocytose sont réalisées par des hémocytes immunitaires tels que les granulocytes et les plasmatocytes. Après une exposition à un pathogène, ces hémocytes changent de forme et développent de grandes structures en forme d’amibe ou d’éventail dans leur membrane plasmique. Pour observer ces changements morphologiques rapides en temps réel, nous avons développé une technique qui nous permet de cultiver des hémocytes d’insectes pendant 7 jours tout en préservant l’activité physiologique (décrite dans les Matériaux et Méthodes). Bien que nous n’ayons pas pu établir des lignées d’hémocytes stables pouvant être passées pendant plusieurs années, nous avons pu observer la morphologie des hémocytes en réponse aux pathogènes in vitro. Le film supplémentaire C montre uniquement les hémocytes après 12 heures d’incubation. La plupart des cellules cultivées étaient en mouvement actif. Certaines cellules présentaient des filets autour de la membrane cellulaire pendant la culture et étaient attachées aux lames de culture. Les hémocytes se sont rarement agrégés ou ont formé de grandes grappes.

La figure 2A montre des hémocytes cultivés avec E. coli (voir également le film supplémentaire 1). On a observé que certains hémocytes étaient plus agrégés et en mouvement. Au fur et à mesure que le temps d’incubation augmentait, des filets (poils de type amibe ou pièges extracellulaires) étaient produits par des hémocytes spécifiques, et divers hémocytes étaient rassemblés par ces filets pour former de grandes grappes (Fig. 2A-1~A-6 ; poils de type amibe ou pièges extracellulaires indiqués par des flèches noires). Comme le montre la figure 2A-1, trois groupes d’hémocytes (indiqués par des cercles noirs) ont finalement été rassemblés en un seul amas par les filets (figures 2A-5 et A-6).

Images de cellules vivantes d’hémocytes de grillons infectés par E. coli ou des billes de Sephadex. (A) Images au microscope optique montrant des hémocytes cultivés avec E. coli. Au fur et à mesure que le temps d’incubation augmente, des filets (poils de type amibe ou pièges extracellulaires ; indiqués par des flèches noires) sont produits par des hémocytes spécifiques. Les six types d’hémocytes ont été agrégés en grands groupes par ces filets (A-1~A-6 ; indiqués par des boîtes noires). Film disponible comme le film 1 (temps en minutes post-inoculation). (B) Images au microscope optique montrant des hémocytes cultivés avec des billes de Sephadex. Les billes de Sephadex autour des hémocytes ont été étiquetées au hasard SP1, SP2, SP3, SP4 et SP5. Au fil du temps, les billes de Sephadex (SP1, SP2, SP3 et SP4) ont été entourées d’hémocytes et encapsulées par différents types de filets (B-1~B-9 ; indiqués par des flèches noires). Film disponible comme Film 2 (temps en minutes post-inoculation). Barre d’échelle = 25 µm (A et B). Le film C montre des hémocytes cultivés seuls, sans perles de Sephadex. La plupart des hémocytes sont en mouvement actif. Quelques cellules étaient attachées aux lames de culture par des filets de membrane plasmique. Cependant, de grandes grappes d’hémocytes n’ont pas été observées.

Il n’a cependant pas été possible de déterminer si le rassemblement des hémocytes décrit ci-dessus était déclenché par E. coli. Pour répondre à cette question, les hémocytes ont été activés avec des billes de Sephadex (120 μm de diamètre), qui peuvent être facilement observées avec un microscope DIC (Fig. 2B, Supplementary Movie 2). Comme le montre la figure 2A, les billes de Sephadex ont été capturées par les réseaux générés par des hémocytes spécifiques (figure 2B ; réseaux indiqués par des flèches noires dans les cases jaunes). Les billes de Sephadex autour des hémocytes ont été étiquetées au hasard SP1, SP2, SP3, SP4 et SP5. Comme on peut le voir en comparant les figures 2B-2 et B-3, SP1, SP2 et SP3 ont été rassemblées dans la zone indiquée par la boîte jaune. De plus, SP1 a fini par être complètement entouré de divers hémocytes (Fig. 2B-9). La bille étiquetée SP4 a également été incorporée dans l’amas avec SP1, SP2 et SP3 (Fig. 2B-4~B-9 ; indiqué par la boîte jaune). Au fil du temps, toutes les billes de Sephadex (SP1, SP2, SP3 et SP4) ont été entourées de nombreux hémocytes. En revanche, des hémocytes individuels ont été observés en contact avec la SP5, mais celle-ci n’a pas été attirée dans la zone indiquée par la boîte jaune, même si elle se trouvait dans une position similaire à celle de la SP1. Par conséquent, la nodulation par les hémocytes semblait se produire de manière aléatoire.

Activation des granulocytes par des billes de latex polystyrène modifiées par des carboxylates

Puis, nous avons cherché à savoir quels hémocytes produisaient les filets et participaient aux différentes étapes de la réponse immunitaire, notamment l’encapsulation et la nodulation. À cette fin, des billes de latex de polystyrène modifiées par des carboxylates, qui peuvent être facilement observées avec un microscope DIC, ont été utilisées à la place des agents pathogènes, et des images en temps réel des hémocytes ont été recueillies. La figure 3A montre des hémocytes stimulés par des billes de latex polystyrène modifiées par des carboxylates pendant 12 heures (film supplémentaire 3). Les filets produits par les hémocytes (indiqués par des flèches noires) se déplacent activement autour des billes de latex (indiquées par des flèches rouges) (Fig. 3A-1). Au fil du temps, les perles ont été englouties par les filets et ont finalement pu être vues dans le cytoplasme des hémocytes (Fig. 3A-2~A-4). Cependant, toutes les billes de latex polystyrène modifiées par des carboxylates qui ont rencontré un filet n’ont pas été phagocytées. Ainsi, le mouvement des hémocytes activés ne semblait pas correspondre précisément au mouvement des billes.

Images de cellules vivantes de granulocytes stimulés avec des billes de latex polystyrène modifiées par des carboxylates. (A) Images au microscope optique montrant des hémocytes cultivés avec des billes de latex polystyrène modifiées par des carboxylates pendant 12 h. A-1~A-4, hémocytes cultivés après 12~18 min. On peut voir les filets produits par les hémocytes (flèches noires) se former autour des billes de latex (indiquées par des flèches rouges). Les billes de latex ont été englouties par les filets et ont finalement été capturées dans le cytoplasme des hémocytes (A-4). Film disponible comme le film 3 (temps en minutes post-stimulation). Barre d’échelle = 40 µm. (B) Images agrandies. (B-1) Après 4 heures, de nombreuses billes de latex polystyrène modifiées par des carboxylates ont été capturées par les hémocytes (billes de latex, flèches rouges ; et hémocytes spécifiques, cercles blancs). (B-2~B-6) Granulocytes en culture à 0, 2, 4, 12 et 48 heures après la stimulation. (B-2) Granulocytes au repos, de forme ronde ou ovale. (B-3) 2 heures après la stimulation, les granulocytes commencent à présenter des changements morphologiques, et on peut voir des structures de membrane plasmique en forme d’éventail ou d’amibe (flèches blanches). (B-4 et -5) Un grand nombre de billes de latex se sont accumulées dans le cytoplasme des granulocytes à 4 et 12 h post-infection. (B-6) 48 heures après l’infection, de nombreuses billes de latex s’étaient accumulées dans le cytoplasme des granulocytes, mais les filets n’étaient plus observés et de nombreux granulocytes semblaient être inertes. Barre d’échelle = 15 µm (B-1) ou 10 µm (B-2~B-6).

Des observations détaillées ont été réalisées à l’aide d’un microscope confocal à fort grossissement (figure 3B). À 4 h post-infection, les billes de latex de polystyrène modifiées par des carboxylates ont pu être observées à l’intérieur de certains hémocytes (Fig. 3B-1 ; les billes sont indiquées par des flèches rouges, et les hémocytes spécifiques par des cercles blancs). Nous avons ensuite observé plus en détail quelles cellules spécifiques ont englouti les billes de latex (Fig. 3B-2~B-6). La figure 3B-2 montre des granulocytes au repos, qui étaient généralement de forme ronde ou ovale, avec de nombreux granules sombres polymorphes dans le cytoplasme. Deux heures après la stimulation par des billes de latex polystyrène modifiées par des carboxylates, les granulocytes ont commencé à présenter des modifications morphologiques, notamment des protubérances de la membrane plasmique en forme d’éventail ou d’amibe (figure 3B-3 ; indiquées par des flèches blanches). Des billes de latex de polystyrène modifiées par des carboxylates ont été observées dans le cytoplasme des granulocytes 4 heures après la stimulation, et un grand nombre de billes de latex s’étaient accumulées dans le cytoplasme de nombreux granulocytes 12 heures après la stimulation (Fig. 3B-4 et B-5 ; les billes sont indiquées par des flèches rouges, et les réseaux par des flèches blanches). En outre, on a observé que les filets devenaient plus grands et plus larges au fil du temps (Fig. 3B-4 et B-5). 48 heures après la stimulation, de nombreuses billes de latex s’étaient accumulées dans le cytoplasme des granulocytes, mais les filets n’étaient plus visibles et de nombreux granulocytes semblaient inertes (Fig. 3B-6 ; billes indiquées par des flèches rouges).

Comme le montre la Fig. 2, les granulocytes semblaient se fixer non seulement à d’autres granulocytes, mais aussi à différents types d’hémocytes en utilisant ces filets. Nous n’avons pas observé de phagocytose dans aucun autre type de cellule, à l’exception d’un petit nombre de plasmatocytes (données non présentées). De plus, nous n’avons pas observé d’activité immunologique ou de changements morphologiques dans aucun autre type de cellule que les granulocytes et un petit nombre de plasmatocytes.

Les lysosomes des granulocytes ont été activés par l’injection de particules E. coli

Pour étudier si les vacuoles observées au sein des granulocytes étaient des phagosomes liés à des agents pathogènes, des grillons ont été injectés avec des particules d’E. coli, qui sont principalement utilisées comme marqueurs de la phagocytose et qui fluorescent en vert lorsqu’elles atteignent des organelles acidifiées telles que les lysosomes intracellulaires. En même temps, les hémocytes totaux ont été colorés avec le rouge LysoTracker, qui marque les lysosomes. Comme le montre la figure 4A-1, un signal fluorescent vert (particules d’E. coli phagocytées) a été observé dans le cytoplasme des granulocytes immédiatement après l’injection des particules. En même temps, un signal fluorescent rouge, qui indique la formation activée de lysosomes, a également été observé (Fig. 4A-2). 4 h après l’injection, des vacuoles hautement polymorphes ont pu être observées dans de nombreux granulocytes (Fig. 4A-4 et A-5). Des images fusionnées du signal fluorescent vert (particules d’E. coli phagocytées) et du signal fluorescent rouge (lysosomes activés) sont présentées (Fig. 4A-6). 12 heures après l’injection, le signal fluorescent vert a commencé à diminuer, tandis que le signal fluorescent rouge est resté (Fig. 4A-7~A-9). 24 heures après l’injection, les deux signaux fluorescents avaient diminué (Fig. 4A-10~A-12). Cependant, le signal fluorescent rouge dans les granulocytes a été observé à nouveau 48 heures après l’injection (Fig. 4A-13~A-15). La figure 4Aa~Ao montre les inserts des panneaux A-1~A-15 (indiqués par des cases blanches) à un plus fort grossissement. Les grillons qui ont été injectés avec le tampon PBS uniquement étaient négatifs pour la fluorescence rouge et verte à tous les points de temps après l’injection (Fig. 4B).

Marquage au rouge LysoTracker des lysosomes des granulocytes chez les grillons injectés avec des particules E. coli fluorescentes vertes. (A) Développement des lysosomes granulocytaires à 0 h, 4 h, 12 h, 24 h et 48 h après l’injection de particules d’E. coli. (A-1, A-4, A-7, A-10, et A-13) Les particules d’E. coli, qui sont utilisées comme marqueurs de la phagocytose, deviennent vertes lorsqu’elles atteignent des organelles acidifiées comme les lysosomes intracellulaires. (A-2, A-5, A-8, A-11 et A-14) Images au microscope confocal à fluorescence de granulocytes colorés avec du rouge LysoTracker (un marqueur lysosomal). (A-1 et A-2) Les signaux fluorescents verts et rouges ont pu être observés dans le cytoplasme des granulocytes à partir de 1 h après l’injection. (A-4 et A-5) De nombreux granulocytes ont montré une fluorescence verte et rouge dans les vacuoles hautement polymorphes des granulocytes à 4 h post-injection. (A-7 et -8) A 12 h post-injection, le signal fluorescent vert s’était estompé mais le signal fluorescent rouge subsistait. (A-10 et A-11) 24 heures après l’injection, les signaux fluorescents vert et rouge avaient presque tous deux disparu. (A-13 et A-14) 48 heures après l’injection, le signal fluorescent vert avait complètement disparu mais le signal fluorescent rouge était à nouveau observé. Des images fusionnées des signaux fluorescents verts et rouges sont montrées (A-3, A-6, A-9, A-12, et A-15). (a~o) Les inserts des panneaux A-1 ~A-15 (indiqués par des boîtes blanches) à plus fort grossissement. (B) Le signal fluorescent rouge dans les granulocytes des grillons qui ont été injectés avec du PBS (contrôle négatif). (C) Analyse cytométrique en flux 1 h~48 h après l’injection. (C-1 et C-2) Le signal fluorescent vert était de 2,08% à 1 h post-injection et a augmenté à 24,6% à 4 h post-injection. (C-3~C-5) Le signal fluorescent vert a progressivement diminué, pour atteindre 10,87 % à 12 h, 3,98 % à 24 h et 1,74 % à 48 h. (C-1-1~C-4-1) Le signal fluorescent rouge a augmenté à 69,54 % à 12 h post-injection et a diminué à 5,78 % à 24 h post-infection. (C-5-1) Le signal fluorescent rouge a augmenté de nouveau, à 30,25 %, à 48 h après l’injection. (C-1-2~C-5-2) Le signal fluorescent rouge dans les granulocytes des grillons qui ont été injectés avec le tampon PBS seulement. (D) Les analyses par cytométrie en flux ont été répétées trois fois.

Pour quantifier les signaux de fluorescence verte et rouge dans les grillons stimulés par PBS ou E. coli, les hémocytes ont été analysés par cytométrie en flux de 0~48 h post-injection (Fig. 4C). A 0 h post-injection, 2,08% des hémocytes étaient positifs pour la fluorescence verte, et ceci a augmenté à 24,36% à 4 h post-injection (Fig. 4C-1 et C-2). Le signal fluorescent vert a progressivement diminué pour atteindre 10,87 % des hémocytes à 12 heures, 3,98 % à 24 heures et 1,74 % à 48 heures (Fig. 4C-3~C-5). Ces résultats indiquent que les particules d’E. coli ont été activement englouties et digérées par les granulocytes et ont été complètement éliminées 48 heures après l’injection. 12 heures après l’injection, 69,54% des hémocytes étaient positifs pour la fluorescence rouge, et le signal a diminué à 5,78% des hémocytes à 24 heures après l’injection (Fig. 4C-1-1~C-4-1). Conformément à nos observations microscopiques, le signal fluorescent rouge a augmenté à 30,25 % des hémocytes 48 heures après l’injection. En revanche, les grillons qui ont été injectés avec du PBS étaient négatifs pour la fluorescence verte et rouge à tous les points de temps (Fig. 4C-1-2~C-5-2). L’analyse par cytométrie de flux a été répétée trois fois (Fig. 4D).

Réactivation des lysosomes granulocytaires à 48 h post-infection

La réactivation des lysosomes granulocytaires à 48 h post-infection a été étudiée plus en détail par observation microscopique (Fig. 5A et B). Comme le montre la figure 4A, le signal fluorescent vert (particules d’E. coli phagocytées) et le signal fluorescent rouge (lysosomes activés) ont été observés 4 heures après l’injection (figures 5A-1~A-3). Les signaux fluorescents se sont atténués 24 heures après l’infection (Fig. 5A-4~A-6). 24 heures après l’infection, nous avons observé que des cellules pouvaient être vues dans le cytoplasme des granulocytes (Fig. 5A-4~A-6 ; indiquées par des flèches blanches). Ce phénomène était plus apparent 48 heures après l’infection (Fig. 5A-7~A-9 ; indiqué par des flèches blanches). En outre, les lysosomes autour de ces cellules englouties 48 heures après l’infection étaient activés (Fig. 5A-8). Comme le montrent les figures 4A-14, 4C-5-1, ces observations microscopiques semblent expliquer l’augmentation du signal fluorescent rouge à 48 h post-infection. Pour confirmer cela, les noyaux des granulocytes ont été colorés avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 48 h post-infection. Comme le montre la figure 5B-1, des granulocytes avec deux noyaux ont été fréquemment observés. Occasionnellement, des granulocytes contenant plus de deux noyaux, ou des noyaux déformés, ont également été observés (Fig. 5B-2 et B-3 ; indiqués par des flèches blanches).

Réactivation des lysosomes des granulocytes à 48 h post-injection. (A) Images au microscope fluorescent de granulocytes à 4 h, 24 h et 48 h post-injection. (A-1 et A-2) Les granulocytes ont montré des signaux fluorescents verts et rouges dans les vacuoles hautement polymorphes à 4 h post-injection. (A-4 et A-5) 12 h après l’injection, le signal fluorescent vert s’est atténué, mais le signal fluorescent rouge est resté. De plus, quelques cellules ont été observées dans le cytoplasme des granulocytes (flèches blanches). (A-7 et A-8) Ce phénomène était plus fréquemment observé à 48 h post-injection. De plus, les lysosomes entourant ces cellules englouties étaient activés (A-8). Des images fusionnées des signaux fluorescents verts et rouges sont présentées (A-3, A-6 et A-9). (B) Granulocytes colorés avec du DAPI 48 heures après l’injection. (B-1) Deux noyaux ont été observés dans le cytoplasme des granulocytes. (B-2 et B-3) Occasionnellement, deux ou plusieurs noyaux, ou des noyaux déformés, ont été observés dans le cytoplasme des granulocytes (indiqués par des flèches blanches). Barre d’échelle = 10 µm (A) ou 20 µm (B).

Mort cellulaire des granulocytes liée à la nécrose à 48 h post-infection

Comme le montrent les figures 3B-6 et 5A-8, l’accumulation de phagosomes dans les granulocytes a modifié leur forme et induit la mort cellulaire. 48 h après l’infection, les hémocytes ont été colorés avec de l’annexine V conjuguée à de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et de l’iodure de propidium (PI) pour confirmer la mort cellulaire apoptotique ou nécrotique (Fig. 6A). Le signal fluorescent vert (annexine V) n’a que légèrement augmenté entre 12 h et 48 h (figures A-10, A-7 et A-10), mais le signal fluorescent rouge (PI) a montré une forte coloration à 12 h post-infection (figures 6A-5). À 24 et 48 h post-infection, le signal fluorescent rouge a persisté (Fig. 6A-8 et A-11). Des images fusionnées du signal fluorescent rouge (PI) et des images DIC sont montrées (Fig. 6A-3, A-6, A-9, et A-12). La figure 6Aa~Ad montre les inserts des panneaux A-3, A-6, A-9 et A-12 indiqués par les cases à un grossissement plus élevé. Ces résultats indiquent que l’accumulation de phagosomes dans les granulocytes n’a pas induit une mort cellulaire apoptotique typique mais une mort cellulaire liée à la nécrose. Pour quantifier la coloration PI, les hémocytes ont été colorés et examinés par cytométrie de flux à 0 h, 12 h, 24 h et 48 h post-infection. 12 heures après l’infection, 71,29 % des granulocytes étaient marqués par l’IP, contre 13,52 % à 0 heure (Fig. 6B-1 et B-2). 24 heures après l’infection, la coloration par l’IP avait légèrement diminué, à 45,97 %, mais a de nouveau augmenté à 76,24 % à 48 heures (Fig. 6B-3 et B-4). L’analyse par cytométrie en flux a été répétée trois fois (Fig. 6C).