FRAP peut également être utilisée pour surveiller les protéines en dehors de la membrane. Après que la protéine d’intérêt soit rendue fluorescente, généralement par expression en tant que protéine de fusion GFP, un microscope confocal est utilisé pour photoblanchir et surveiller une région du cytoplasme, du fuseau mitotique, du noyau ou d’une autre structure cellulaire. La fluorescence moyenne dans la région peut alors être tracée en fonction du temps écoulé depuis la photoblanchiment, et la courbe résultante peut donner des coefficients cinétiques, tels que ceux des réactions de liaison de la protéine et/ou le coefficient de diffusion de la protéine dans le milieu où elle est suivie. Souvent, les seules dynamiques prises en compte sont la diffusion et les interactions de liaison/déliaison, mais, en principe, les protéines peuvent aussi se déplacer par flux, c’est-à-dire subir un mouvement dirigé, subir un mouvement dirigé, et cela a été reconnu très tôt par Axelrod et al. Cela peut être dû à l’écoulement du cytoplasme ou du nucléoplasme, ou au transport le long de filaments dans la cellule tels que les microtubules par des moteurs moléculaires.

L’analyse est plus simple lorsque la récupération de la fluorescence est limitée soit par le taux de diffusion dans la zone blanchie, soit par le taux auquel les protéines blanchies se délient de leurs sites de liaison dans la zone blanchie, et sont remplacées par une protéine fluorescente. Examinons ces deux limites, pour le cas courant du blanchiment d’une protéine de fusion GFP dans une cellule vivante.

Récupération de la fluorescence limitée par la diffusionEdit

Pour une tache de blanchiment circulaire de rayon w {\displaystyle w}.

et une récupération dominée par la diffusion, la fluorescence est décrite par une équation dérivée par Soumpasis (qui implique des fonctions de Bessel modifiées I 0 {\displaystyle I_{0}}.

et I 1 {\displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

with τ D {\displaystyle \tau _{D}}

l’échelle de temps caractéristique de la diffusion, et t {\displaystyle t}

est le temps. f ( t ) {\displaystyle f(t)}

est la fluorescence normalisée (passe à 1 lorsque t {\displaystyle t}

passe à l’infini). L’échelle de temps de diffusion pour une tache blanchie de rayon w {\displaystyle w}

est τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, avec D le coefficient de diffusion.

Notez que ceci est pour un blanchiment instantané avec un profil de fonction d’étape, c’est-à-dire que la fraction f b {\displaystyle f_{b}}.

de protéines supposées être blanchies instantanément au temps t = 0 {\displaystyle t=0}.

est f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}.

, et f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, pour r {\displaystyle r}

est la distance du centre de la zone blanchie. On suppose également que la récupération peut être modélisée par une diffusion en deux dimensions, qui est également à la fois uniforme et isotrope. En d’autres termes, que la diffusion se produit dans un milieu uniforme de sorte que la constante de diffusion effective D est la même partout, et que la diffusion est isotrope, c’est-à-dire qu’elle se produit à la même vitesse le long de tous les axes dans le plan.

En pratique, dans une cellule, aucune de ces hypothèses ne sera strictement vraie.

1. Le blanchiment ne sera pas instantané. En particulier si un fort blanchiment d’une grande surface est nécessaire, le blanchiment peut prendre une fraction significative de l’échelle de temps de diffusion τ D {\displaystyle \tau _{D}}.
   

   . Alors une fraction significative de la protéine blanchie diffusera hors de la région blanchie effectivement pendant le blanchiment. Ne pas en tenir compte introduira une erreur significative dans D.

2. Le profil blanchi ne sera pas une fonction radiale en escalier. Si le point blanchi est effectivement un pixel unique, alors le blanchiment en fonction de la position sera typiquement limité par la diffraction et déterminé par l’optique du microscope confocal à balayage laser utilisé. Ce n’est pas une fonction d’étape radiale et elle varie également le long de l’axe perpendiculaire au plan.
3. Les cellules sont bien sûr tridimensionnelles et non bidimensionnelles, tout comme le volume blanchi. Négliger la diffusion hors du plan (nous prenons celui-ci pour le plan xy) ne sera une approximation raisonnable que si la fluorescence se rétablit principalement par diffusion dans ce plan. Cela sera vrai, par exemple, si un volume cylindrique est blanchi avec l’axe du cylindre le long de l’axe z et avec ce volume cylindrique traversant toute la hauteur de la cellule. Dans ce cas, la diffusion le long de l’axe z ne provoque pas de récupération de la fluorescence, car toutes les protéines sont blanchies uniformément le long de l’axe z, et le fait de la négliger, comme le fait l’équation de Soumpasis, est donc inoffensif. Cependant, si la diffusion le long de l’axe z contribue à la récupération de la fluorescence, alors elle doit être prise en compte.
4. Il n’y a aucune raison de s’attendre à ce que le cytoplasme ou le nucléoplasme de la cellule soit complètement uniforme dans l’espace ou isotrope.

Donc, l’équation de Soumpasis est juste une approximation utile, qui peut être utilisée lorsque les hypothèses énumérées ci-dessus sont de bonnes approximations de la situation réelle, et lorsque la récupération de la fluorescence est effectivement limitée par l’échelle de temps de la diffusion τ D {\displaystyle \tau _{D}}.

. Notez que le fait que la Soumpasis puisse être ajustée de manière adéquate aux données n’implique pas nécessairement que les hypothèses sont vraies et que la diffusion domine la récupération.

Récupération limitée par la réactionEdit

L’équation décrivant la fluorescence en fonction du temps est particulièrement simple dans une autre limite. Si un grand nombre de protéines se lient à des sites dans un petit volume de telle sorte que là, le signal de fluorescence est dominé par le signal des protéines liées, et si cette liaison se fait toute dans un état unique avec un taux d’extinction koff, alors la fluorescence en fonction du temps est donnée par

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{\text{off}t}}.

Notez que la récupération dépend uniquement de la constante de vitesse de déliaison, koff. Elle ne dépend pas du taux de on pour la liaison. Bien qu’elle dépende d’un certain nombre d’hypothèses

1. Le taux on doit être suffisamment grand pour que la concentration locale de protéine liée dépasse largement la concentration locale de protéine libre, et nous permette ainsi de négliger la contribution à f de la protéine libre.
2. La réaction est une réaction bimoléculaire simple, où la protéine se lie à des sites localisés qui ne se déplacent pas de manière significative pendant la récupération
3. L’échange est beaucoup plus lent que la diffusion (ou tout autre mécanisme de transport responsable de la mobilité), car c’est seulement à ce moment que la fraction diffusante récupère rapidement et agit alors comme la source de protéine fluorescente qui se lie et remplace la protéine blanchie liée et augmente ainsi la fluorescence. Avec r le rayon du point blanchi, cela signifie que l’équation n’est valable que si la durée de vie liée 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}.
   

   .

Si toutes ces hypothèses sont satisfaites, alors l’ajustement d’une exponentielle à la courbe de récupération donnera la constante de vitesse d’extinction, koff. Cependant, d’autres dynamiques peuvent donner des courbes de récupération similaires aux exponentielles, donc l’ajustement d’une exponentielle n’implique pas nécessairement que la récupération est dominée par une simple réaction bimoléculaire. Une façon de distinguer entre la récupération dont le taux est déterminé par la déliaison et la récupération qui est limitée par la diffusion, est de noter que le taux de récupération pour la récupération limitée par la déliaison est indépendant de la taille de la zone blanchie r, alors qu’il s’échelonne comme r – 2 {\displaystyle r^{-2}}.

, pour la récupération limitée par diffusion. Ainsi, si une petite et une grande zone sont blanchies, si la récupération est limitée par la déliaison, alors les taux de récupération seront les mêmes pour les deux tailles de zone blanchie, alors que si la récupération est limitée par la diffusion, alors elle sera beaucoup plus lente pour la plus grande zone blanchie.

Diffusion et réactionEdit

En général, la récupération de la fluorescence ne sera dominée ni par une simple diffusion isotrope, ni par un seul taux de déliaison simple. Il y aura à la fois diffusion et liaison, et en effet la constante de diffusion peut ne pas être uniforme dans l’espace, et il peut y avoir plus d’un type de sites de liaison, et ces sites peuvent également avoir une distribution non uniforme dans l’espace. Les processus d’écoulement peuvent également être importants. Ce comportement plus complexe implique qu’un modèle avec plusieurs paramètres est nécessaire pour décrire les données ; les modèles avec seulement une seule constante de diffusion D ou une seule constante de taux d’off, koff, sont inadéquats.

Il existe des modèles avec à la fois la diffusion et la réaction. Malheureusement, une seule courbe FRAP peut fournir des éléments insuffisants pour ajuster de manière fiable et unique les données expérimentales (éventuellement bruyantes). Sadegh Zadeh et al. ont montré que les courbes FRAP peuvent être ajustées par différentes paires de valeurs de la constante de diffusion et de la constante de vitesse de réaction, ou, en d’autres termes, que les ajustements de la FRAP ne sont pas uniques. Il s’agit d’ajustements à trois paramètres (constante de vitesse, constante de vitesse et constante de diffusion). Les ajustements qui ne sont pas uniques ne sont généralement pas utiles.

Donc, pour les modèles comportant un certain nombre de paramètres, une seule expérience de FRAP peut être insuffisante pour estimer tous les paramètres du modèle. Il faut alors plus de données, par exemple en blanchissant des zones de différentes tailles, en déterminant certains paramètres du modèle de manière indépendante, etc.

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