- Résultats
- Analyse des échantillons cliniques.
- Sous-typage et analyse phylogénétique.
- Analyse moléculaire des protéines de surface HA et NA.
- Pathogénicité et transmissibilité des virus de la grippe porcine H2N3 chez les porcs.
- Pathogénicité des virus de la grippe porcine H2N3 chez la souris.
- Transmissibilité du virus de la grippe porcine H2N3 chez les furets.
- Enquête sérologique sur les virus de l’influenza porcine H2N3 dans les fermes d’éclosion.
Résultats
Analyse des échantillons cliniques.
En septembre 2006, le virus de l’influenza A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) a été isolé chez plusieurs porcs âgés de 5 à 6 semaines présentant une bronchopneumonie multifocale dans une pépinière porcine commerciale multisource. Les lésions pulmonaires comprenaient une bronchopneumonie modérée, subaiguë à chronique, purulente et une pneumonie interstitielle avec bronchiolite et péribronchite. Les tissus pulmonaires étaient négatifs pour le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV), le circovirus porcin de type 2 (PCV2) et Mycoplasma hyopneumoniae mais positifs pour Streptococcus suis. En raison des lésions caractéristiques de type grippal et des signes cliniques de pneumonie, l’homogénat de tissu pulmonaire a été inoculé sur des cellules de rein canin Madin-Darby (MDCK). Des effets cytopathiques ont été détectés le troisième jour après l’inoculation (p.i.). Le gène de la nucléoprotéine (NP) du virus de l’influenza a été détecté dans les cellules infectées par RT-PCR. Le virus n’a pas réagi avec les antisérums porcins de référence (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) dans les tests d’inhibition de l’hémagglutination (HI), et la RT-PCR multiplex n’a détecté aucun gène H1N1 ou H3N2 (14). Le virus a été soumis au National Animal Disease Center (NADC) en février 2007 pour sous-typage et séquençage.
Après que l’isolat de septembre ait été sous-typé et séquencé (décrit ci-dessous), une recherche dans les dossiers de cas a révélé qu’un autre isolat de grippe » non typable » avait été soumis en avril 2006. Le virus A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) avait été isolé chez un porc de 12 semaines atteint d’une maladie respiratoire dans une autre exploitation commerciale d’élevage de porcs. Les lésions pulmonaires étaient histopathologiquement caractéristiques de la grippe porcine (inflammation grave et subaiguë des alvéoles et des bronches avec nécrose et métaplasie des cellules épithéliales bronchiolaires). Le poumon était négatif pour le PRRSV, le PCV2 et le M. hyopneumonia mais était positif pour le virus de l’influenza A par RT-PCR (spécifique pour le gène NP) et pour S. suis. Le virus a été soumis au CNDA en mars 2007 pour sous-typage et séquençage.
Sous-typage et analyse phylogénétique.
Pour identifier et caractériser les deux virus de l’influenza, un séquençage des acides nucléiques et une analyse moléculaire et phylogénétique ont été réalisés. Les deux virus ont été directement séquencés à partir d’isolats à faible passage en utilisant des cellules MDCK, et les séquences ont été confirmées après purification des plaques et reséquençage. Ils ont été identifiés comme des virus H2N3 par leur séquence nucléotidique et une recherche BLAST dans la base de données des séquences de l’influenza (www.flu.lanl.gov). Le segment du gène HA du virus Sw/4296424 correspondait le plus étroitement à celui des virus H2 isolés chez des colverts en Amérique du Nord. Son segment NA était étroitement lié à celui d’un virus H4N3 de l’influenza aviaire (AIV) isolé chez la sarcelle à ailes bleues (identité de 98,3 %). À l’exception du gène de la polymérase acide (PA), ses gènes internes étaient dérivés de virus contemporains de l’influenza porcine à triple réassortiment que l’on trouve actuellement aux États-Unis. Ces virus portent des gènes internes d’origine humaine (PB1), aviaire (PB2, PA) et porcine (SI Tableau 4). Son segment PA était identique à 99,2 % à celui du VAI H6N5 isolé chez des canards colverts (Tableau SI 4). Les virus Sw/2124514 et Sw/4296424 présentaient une identité de séquence nucléotidique totale de 99,3 à 99,9 % (Tableau SI 5). Les deux isolats ont été clonés par plaque à plusieurs reprises, retestés et confirmés par séquençage comme appartenant au sous-type H2N3. Le sous-type H2N3 a été confirmé sérologiquement par des tests d’inhibition de l’hémagglutination et de la neuraminidase. L’analyse phylogénétique basée sur les gènes HA et NA a montré que ces deux virus appartiennent à la lignée aviaire américaine qui est distincte des souches aviaires eurasiennes et des virus H2N2 isolés chez l’homme après la pandémie de grippe de 1957 (Fig. 1).
Arbres phylogénétiques de certains gènes H2 (a) et N3 (b) du virus de la grippe basés sur les séquences nucléotidiques des ORF. La distance horizontale est proportionnelle à la distance génétique. Les arbres sont enracinés à A/duck/Singapore/97 H5N3 (a) et A/tern/Astrakan/775/83 H3N3 (b). Les chiffres sous les nœuds représentent les valeurs bootstrap de 200 répliques.
Analyse moléculaire des protéines de surface HA et NA.
Les virus de la grippe A contiennent deux protéines de surface : la HA est la glycoprotéine de liaison aux récepteurs et de fusion membranaire, et la NA est une enzyme de destruction des récepteurs. L’HA virale est un facteur critique de la spécificité d’espèce hôte des virus de la grippe (15). Pour caractériser les résidus de l’HA qui pourraient être associés à l’adaptation d’un virus aviaire à l’hôte mammifère, nous avons comparé les séquences d’acides aminés des HA porcines à celles des virus aviaires de référence putatifs. La comparaison moléculaire des molécules d’HA des deux isolats H2N3 porcins a révélé qu’elles diffèrent du virus H2N3 de référence putatif isolé chez le canard colvert par six substitutions d’acides aminés communes (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I et L506V) (Tableau SI 6). La substitution Q226L a été trouvée dans les deux isolats porcins H2N3, alors que la position 228 contenait G, identique à la séquence consensus aviaire (tableau 1) (16). En revanche, les molécules HA humaines du sous-type H2 contiennent 226L et 228S, tandis que les premiers isolats H2 humains contiennent 226L et 228G (tableau 1), comme les isolats porcins. Les positions 36N, 274I, 316I et 419I sont propres aux deux isolats porcins H2N3 (tableau 6 du SI), tandis que les positions respectives des isolats humains et aviaires représentés sur la figure 1a sont 36D, 274T, 316V et 419L. Pour les isolats de la grippe représentés sur la figure 1a, la position 506V est conservée parmi les isolats humains, deux isolats porcins H2N3 et les isolats aviaires, à l’exception de A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), comme le montre le tableau 6 du SI. Deux changements communs d’acides aminés dans la séquence d’acides aminés NA des deux isolats porcins ont été trouvés lorsqu’ils ont été comparés au virus H4N3 de référence isolé de la sarcelle à ailes bleues : H47Y et H253Y (tableau SI 7). La position 47Y dans les deux isolats porcins H2N3 est la même que l’acide aminé respectif dans les isolats aviaires eurasiens décrits dans la figure 1 b ; inversement, la position dans les isolats aviaires nord-américains est 47H. La position 253Y est unique aux isolats H2N3 porcins, et la position 253H est conservée dans les isolats aviaires eurasiens et nord-américains représentés sur la figure 1b. Il est intéressant de noter que Sw/4296424 (H2N3), isolé 5 mois plus tard que Sw/2124514 (H2N3), présentait deux substitutions supplémentaires (P162S et L321V) dans la molécule HA et trois substitutions supplémentaires (V30I, I49T et A135T) dans la molécule NA par rapport à l’HA et à la NA de Sw/2124514 (tableaux SI 6 et 7). La position 30I (Sw/4296424) dans la molécule NA est similaire aux isolats eurasiens, tandis que la position 30V (Sw/2124514) est conservée dans les isolats aviaires nord-américains.
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Comparaison des acides aminés dans le site de liaison au récepteur HA des isolats humains, aviaires et porcins du virus de la grippe H2
Pathogénicité et transmissibilité des virus de la grippe porcine H2N3 chez les porcs.
Pour étudier le degré d’adaptation du virus H2N3 chez le porc, nous avons étudié sa pathogénicité chez cet hôte en inoculant à 20 porcs âgés de 4 semaines 2 × 106 50% de dose infectieuse en culture tissulaire (DICT50) du virus Sw/4296424. Un seul virus H2N3 a été choisi, en raison de la forte identité entre les deux isolats. Douze porcs témoins ont été inoculés à titre simulé avec du surnageant de culture cellulaire non infectieux. Nous avons évalué la transmissibilité en mettant en cohabitation 10 porcs contacts appariés selon l’âge avec les porcs inoculés, à partir du jour 3 p.i. Tous les porcs utilisés pour l’étude étaient séronégatifs au jour 0 pour les anticorps contre les virus de la grippe porcine H1N1, H1N2, H2N3 et H3N2 par test HI. Cinq porcs inoculés et trois porcs témoins ont été euthanasiés pour une autopsie aux jours 3, 5 et 7 p.i. Les 10 porcs contacts et les 5 porcs inoculés ont été testés sérologiquement par un test HI avec H2N3 le jour 24 après contact ou le jour 27 p.i., respectivement. Aucun signe respiratoire aigu n’a été observé. L’autopsie a révélé de graves lésions pulmonaires macroscopiques (zones consolidées de couleur prune) chez les porcs inoculés, mais aucune chez les porcs témoins (tableau 2). Le score histopathologique (0-3) exprimant l’étendue des dommages à l’architecture pulmonaire était >2 chez les porcs inoculés (Tableau 2). Les poumons des porcs inoculés, euthanasiés le jour 3, 5 ou 7 de la p.i., présentaient une pneumonie interstitielle légère à modérée et une bronchiolite nécrosante aiguë à subaiguë avec de légers bourrelets lymphocytaires dans les bronchioles et les vaisseaux (figure 2). Le virus a été titré dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) et isolé à partir d’échantillons d’écouvillons nasaux. Les titres du virus dans le poumon étaient compris entre 104,3 et 106,5 TCID50/ml aux jours 3 et 5 p.i. (tableau SI 8) et étaient négatifs au jour 7 p.i. Dans le groupe inoculé avec H2N3, le virus a été isolé à partir d’échantillons d’écouvillonnage nasal chez 25 % (5 sur 20) des porcs au jour 3, 67 % (10 sur 15) au jour 5 et 20 % (2 sur 10) au jour 7 p.i. ; dans le groupe de contact, 10 % (1 sur 10) des échantillons étaient positifs aux jours 5 et 7 après le contact. En revanche, 100 % (10 sur 10) des porcs de contact étaient séropositifs après 24 jours de contact avec les porcs inoculés (SI Tableau 9). Certains porcs témoins présentaient occasionnellement un petit foyer de pneumonie interstitielle légère (tableau 2), mais ils étaient négatifs pour l’infection par le virus de la grippe porcine. Tous les porcs étaient négatifs pour le PRRSV et M. hyopneumoniae par PCR. Nos résultats indiquent que le virus H2N3 est pathogène chez les porcs et qu’il est transmissible entre les porcs.
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Pneumonie macroscopique et microscopique chez des porcs inoculés avec le virus H2N3 Sw/4296424 ou inoculés par sondage
Sections pulmonaires microscopiques de porcs témoins et infectés. (a) Bronchiole dans le poumon d’un porc témoin inoculé avec du surnageant de culture cellulaire non infectieux. Notez le contour régulier de l’épithélium colonnaire pseudostratifié. (b) Bronchiolite nécrosante dans le poumon d’un porc 3 jours après l’inoculation du virus de la grippe porcine H2N3. Le revêtement épithélial des voies respiratoires est perturbé de façon focale par la desquamation des cellules infectées nécrosées et la prolifération réactive précoce de l’épithélium restant. La lumière contient des cellules épithéliales mortes et des leucocytes mélangés. On observe un petit nombre de lymphocytes infiltrant le tissu conjonctif sous-épithélial et péri-bronchiolaire.
Pathogénicité des virus de la grippe porcine H2N3 chez la souris.
Pour tester la capacité du virus H2N3 Sw/4296424 à se répliquer chez la souris, nous avons inoculé par voie intranasale à des souris BALB/c âgées de 6 à 7 semaines 102-106 TCID50. Les souris inoculées avec 104 TCID50 ou plus ont montré des signes de maladie (par exemple, respiration laborieuse, fourrure rugueuse, perte de poids et léthargie) (SI Tableau 10). Soixante-quinze pour cent des souris ayant reçu 106 TCID50 sont mortes, mais il n’y a pas eu de décès aux doses inférieures. L’ARN viral a été détecté par RT-PCR en temps réel (17) dans les poumons des souris après inoculation de 106 ou 105 TCID50 (tableau SI 10). Sur le plan histopathologique, le virus H2N3 a provoqué des foyers multiples ou coalescents de pneumonie interstitielle et d’alvéolite proliférative caractérisés par une hypertrophie importante des pneumocytes et une infiltration des parois alvéolaires par une population mixte de macrophages, de lymphocytes et de neutrophiles (SI Fig. 3). Certaines lumières alvéolaires contenaient des caillots de fibrine et de légers exsudats leucocytaires mixtes. Pris ensemble, ces résultats indiquent que le H2N3 est pathogène chez les souris sans adaptation préalable.
Transmissibilité du virus de la grippe porcine H2N3 chez les furets.
Pour provoquer une pandémie, un virus de la grippe A émergent doit infecter les humains et être efficacement transmis entre eux. Pour étudier le potentiel de transmission du virus réassortant H2N3 dans les systèmes mammifères, nous avons utilisé le modèle de contact du furet (18). Trois furets âgés de 18 semaines, logés dans des cages séparées, ont été inoculés avec 102,5 TCID50 du virus H2N3 Sw/2124514. Après 24 heures, un animal de contact a été placé dans chaque cage. Des lavages nasaux ont été effectués les jours 1, 4 et 7 p.i., et le virus a été titré dans des œufs embryonnés. Le virus a été détecté chez tous les furets inoculés et de contact, mais aucun n’a présenté de signes cliniques évidents (tableau 3). Ces résultats indiquent que le virus de la grippe H2N3 a infecté les furets et a été transmis par contact de manière efficace.
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Titres de virus dans les lavages nasaux de furets H2N3 (Sw/2124514) inoculés et de furets contacts
Enquête sérologique sur les virus de l’influenza porcine H2N3 dans les fermes d’éclosion.
Pour approfondir la propagation des virus H2N3, nous avons mené une enquête sérologique limitée sur les animaux associés aux deux systèmes de production touchés. Dans la première étude, au printemps 2007, des échantillons de sérum ont été prélevés sur des truies provenant de quatre fermes qui ont fourni des porcelets aux fermes d’élevage pendant l’épidémie de septembre 2006. Quatre-vingt-dix pour cent (54 sur 60) étaient séropositives pour la présence d’anticorps dirigés contre le virus Sw/4296424 (SI Tableau 11). Un certain nombre des animaux testés étaient présents au moment du cas index, et il n’est pas clair s’ils ont été infectés à ce moment-là ou s’ils ont été infectés ultérieurement. Les données montrent toutefois que le virus était présent dans les exploitations de truies et de pépinières et qu’il se transmettait efficacement entre les animaux. Toutes les truies de cette exploitation avaient des titres d’anticorps >1:40 contre les virus de la grippe porcine H1N1 et H3N2, car elles avaient été préalablement vaccinées avec un vaccin bivalent contre la grippe tuée H1N1 et H3N2.
Des échantillons de sérum ont également été prélevés au printemps 2007 sur 30 truies et 90 porcs sevrés associés au foyer d’avril 2006, et ils ont été testés pour la présence d’anticorps contre le virus Sw/2124514 en utilisant le test HI. Sur les 30 truies et les 90 porcs sevrés échantillonnés, 1 sur 30 et 26 sur 90 étaient séropositifs (SI Tableau 11), respectivement.