Croissance et production d’éthanol de S. cerevisiae NCYC 2826 sur un hydrolysat de paille de blé

La figure 1A montre la croissance de S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 cultivée à 30°C pendant 36 h dans une culture contenant un hydrolysat avec une concentration en glucose de 123 mM préparé comme décrit dans la section ‘Méthodes’. La souche S. cerevisiae a été choisie en raison de sa tolérance élevée à l’éthanol et de sa robustesse dans les fermentations industrielles. La figure 1A montre que lorsque la souche S. cerevisiae NCYC 2826 a été cultivée uniquement avec de l’hydrolysat de paille de blé, le taux de croissance μ était lent, de 0,036 h-1, et la densité optique (DO) finale, de 0,8. L’ajout d’une base nutritive pour levures (YNB) au milieu a provoqué une augmentation du μ à 0,135 h-1 et une DO finale de 1,5, tandis que l’ajout de 2,3 mg ml-1 d’urée à l’hydrolysat de paille de blé a donné un μ de 0,99 h-1 et une DO finale de 1,3. Des études antérieures ont montré que les suppléments d’urée peuvent augmenter la production d’éthanol dans la fermentation de la levure et que l’urée elle-même est un composant essentiel dans les milieux de croissance de la levure les plus minimes . Nos résultats appuient ces conclusions antérieures, confirmant la nécessité de l’urée pour une croissance quasi-optimale de la levure. Après 36 heures, la concentration d’éthanol dans les cultures a été mesurée et le rendement d’éthanol obtenu à partir de 123 mM de glucose était d’environ 90 % du rendement théorique total pour toutes les cultures. Bien que l’éthanol ait été produit à un rendement comparable dans ces trois conditions de culture, la croissance a été plus lente et la densité optique finale plus faible avec l’hydrolysat de paille de blé qu’avec l’ajout d’urée ou de YNB à la culture. Cela suggère que, bien que le glucose était disponible pour la fermentation, l’hydrolysat ne contenait pas suffisamment d’éléments nutritionnels pour permettre à la culture de se diviser à son taux maximal et d’atteindre une densité optimale.

Pour étudier la cause de la diminution de la croissance cellulaire sur l’hydrolysat de paille de blé, S. cerevisiae NCYC 2826 a été cultivé sur un hydrolysat fabriqué en utilisant une concentration initiale de paille de 5 %, 10 %, 15 % et 20 % et complété par 2,3 mg ml-1 d’urée. La figure 1B montre qu’à mesure que la concentration initiale de paille augmente, la phase de latence de la croissance augmente également jusqu’à 20 h pour une concentration initiale de paille de 20 %. La DO finale a également augmenté avec la concentration de paille, en raison de l’augmentation des concentrations de glucose libéré. L’augmentation de la phase de latence est caractéristique de l’inhibition de la croissance par les composés furaniques souvent présents dans les hydrolysats de paille. L’analyse de la teneur en furanes de l’hydrolysat a montré que la teneur en HMF était négligeable (données non présentées) mais que la concentration de furfural présent augmentait avec la concentration initiale de paille pour atteindre 0,5 mg ml-1 à 20 % de teneur initiale en paille (Figure 2). Ces données suggèrent que la croissance de S. cerevisiae NCYC 2826 sur l’hydrolysat de paille de blé est limitée par la concentration de furfural présent dans l’hydrolysat.

Concentration de glucose (carrés) et de furfural (triangles) présents dans les hydrolysats de paille de blé réalisés comme décrit dans la section ‘ Méthodes ‘ avec une concentration croissante de paille initiale.

Analyse de la croissance de l’ensemble de souches de SGRP sur le furfural

Afin d’identifier les souches de levure qui pourraient être résistantes au furfural contaminant, l’ensemble de souches de SGRP décrit dans les méthodes a été cultivé dans YNB, 100 mM de glucose et en présence de 1,5 mg ml-1 de furfural. Le tableau 1 montre l’analyse de la tolérance de l’ensemble de souches SGRP à 1,5 mg ml-1 de furfural en utilisant le système de notation décrit dans la section  » Méthodes « . Un système de notation était nécessaire à la place des temps de latence moyens, car les répliques de souches qui n’ont pas réussi à se développer n’avaient pas de phase de latence mesurable, mais devaient quand même être incluses dans l’ensemble de données.

Nous avions précédemment observé que l’augmentation de l’inoculum dans les cultures contenant du furfural entraînait une diminution de la phase de latence, vraisemblablement en maximisant la quantité de cellules de levure viables introduites dans le milieu, ce qui conduit à un établissement plus rapide de la phase exponentielle de croissance (données non présentées). Par conséquent, pour ces expériences, un volume d’inoculum de 5% de la culture de nuit a été utilisé. Les données du tableau 1 montrent que la croissance sur les plaques de réplique était extrêmement variable et également dépendante de la souche, ce qui démontre qu’une concentration de 1,5 mg ml-1 de furfural est suffisante pour distinguer la tolérance au furfural chez les souches de S. cerevisiae et S. paradoxus. Lorsque la croissance des souches a été testée dans un YNB contenant 100 mM de glucose et 2,0 ou 3,0 mg ml-1 de furfural, très peu de croissance a été observée dans ces conditions pour toutes les souches analysées. Il a donc été décidé de sélectionner des souches en utilisant les données de 1,5 mg ml-1 et de les soumettre à un dépistage plus détaillé du furfural. L’analyse des données présentées dans le tableau 1 montre que, dans l’ensemble, les souches de S. cerevisiae ont mieux poussé que les souches de S. paradoxus sur 1,5 mg ml – 1 de furfural. Près de 20 % des souches de S. paradoxus testées n’ont pas obtenu la note maximale du système de notation, alors que pour S. cerevisiae, cette proportion était inférieure à 10 %, ce qui se reflète également dans la note moyenne globale plus élevée de S. cerevisiae, soit 2,5 ± 1,4, contre 2,1 ± 1,4 pour S. paradoxus. Cependant, au sein de chaque groupe de souches, il y avait une variation significative, avec des scores allant de 1,7 à 3,7 pour S. cerevisiae et de 0,3 à 3,0 pour S. paradoxus. Les souches qui ont obtenu un score supérieur à 2,9 avec un écart-type inférieur à 1,5 ont été considérées comme présentant une tolérance significative au furfural. Par conséquent, les souches de S. cerevisiae NCYC 3284 (ex sol, États-Unis), NCYC 3290 (ex vin de bili, Afrique de l’Ouest), NCYC 3312 (ex sol, Pays-Bas) et NCYC 3451 (ex moût, Irlande), ainsi que S. paradoxus NCYC 3277 (ex écorce de chêne, Royaume-Uni) ont été examinées plus en détail dans le cadre d’un dépistage plus détaillé du furfural.

Effets de concentrations croissantes de furfural sur la croissance et la production d’éthanol

La figure 3 montre la croissance en présence de quantités variables de furfural (0,1 à 4,0 mg ml-1) pour les souches NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 et NCYC 3451 de S. cerevisiae et la souche NCYC 3277 de S. paradoxus identifiée dans le tableau 1 de l’ensemble de souches SGRP comme ayant une résistance accrue au furfural. Fichier supplémentaire 1 : La figure S1 montre les données de croissance correspondantes tracées sur une échelle logarithmique. La souche témoin S. cerevisiae NCYC 2826 a également été incluse à des fins de comparaison. Pour les six souches, à mesure que la concentration de furfural augmentait, les courbes de croissance commençaient à montrer une augmentation de la phase de latence, comme cela avait été observé précédemment dans les croissances contenant du furfural. Toutes les souches testées ont été capables de croître sur YNB complété par 100 mM de glucose et 0,1 à 1,5 mg ml-1 de furfural. S. cerevisiae NCYC 2826, notre souche témoin, n’a pu croître qu’avec un maximum de 1,5 mg ml-1, ce qui a entraîné une réduction de 30 % de la DO finale par rapport à la croissance avec 0,1 mg ml-1 de furfural. Le tableau 2 montre que la production d’éthanol par la souche NCYC 2826 dans ces conditions était considérablement réduite par rapport au rendement d’environ 90 % observé lorsqu’elle était cultivée sur YNB et glucose seuls ou sur hydrolysat de paille de blé. S. cerevisiae NCYC 2826 a été isolée à partir de moût de raisin et il est donc peu probable qu’elle ait évolué vers la capacité de croître et de fermenter pendant l’exposition au furfural.

Dans leur étude de génomique des populations, Liti et al. ont identifié cinq lignées de S. cerevisiae bien définies et géographiquement isolées (malaisienne, nord-américaine, saké, ouest-africaine et « Wine/European ») ainsi que de nombreuses souches recombinantes (mosaïques) différentes de ces lignées. Les résultats de la présente étude montrent que la résistance au furfural n’est pas une caractéristique phénotypique spécifique à une lignée particulière de S. cerevisiae. Parmi les quatre souches de S. cerevisiae SGRP résistantes au furfural identifiées, la NCYC 3284 (YPS128) appartient à la lignée nord-américaine, la NCYC 3290 (DBVPG 6044) à la lignée ouest-africaine, la NCYC 3312 (DBVPG 1373) à la lignée  » vinicole/européenne « , tandis que la NCYC 3451 (un dérivé à une seule spore de la NCYC 361) est une souche recombinante.

S. cerevisiae NCYC 3451 a présenté la plus grande résistance au furfural (figure 3F, fichier additionnel 1 : figure S1F) et a été capable de croître en présence de jusqu’à 3,0 mg ml-1 de furfural. De plus, la production d’éthanol dans cette souche ne semble pas être inhibée par le furfural, le rendement en éthanol le plus élevé (95 ± 15 % ; Tableau 2) étant obtenu à une concentration (de furfural) de 3,0 mg ml-1. Comme déjà mentionné, la NCYC 3451 est une souche recombinante et il a été démontré qu’elle possède un génome en mosaïque dérivé d’au moins trois lignées différentes, à savoir Saké, Afrique de l’Ouest et ‘Wine/European’ (Liti et al.). Bien qu’elle ait été isolée du moût en tant que levure de bière, la structure très complexe du génome de cette souche suggère fortement, sans toutefois le prouver, qu’elle est d’origine industrielle (par exemple, une souche de boulangerie ou de brasserie). Parmi les quatre autres souches de SGRP testées, les souches NCYC 3290 et NCYC 3312 de S. cerevisiae étaient toutes deux capables de croître avec 2,5 mg ml-1 de furfural (figure 3D,C, fichier supplémentaire 1 : figures S1D et S1C, respectivement), tandis que les souches NCYC 3284 (figure 3E, fichier supplémentaire 1 : figure S1E) et NCYC 3277 (figure 3B, fichier supplémentaire 1 : figure S1B) de S. cerevisiae ne pouvaient croître qu’avec 2,0 mg ml-1 de furfural. Dans l’ensemble, la production d’éthanol dans les cinq souches SGRP n’a pas été significativement affectée par la présence de furfural. En fait, pour la souche NCYC 3312, la présence de 0,5 mg ml-1 de furfural a entraîné une augmentation notable du rendement en éthanol, passant de 41 ± 8 % du rendement attendu à 75 ± 5 % (tableau 2). Ce phénomène a également été observé pour la souche NCYC 3451, mais dans une moindre mesure (seulement une augmentation de 14 % du rendement ; Tableau 2). En effet, il a été récemment démontré que de petites quantités d’alcool furfurylique, un produit de la déshydratation du furfural dans la levure, peuvent en fait conduire à une augmentation de la production d’éthanol .

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