Chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) et chromatographie liquide haute performance (HPLC) : deux méthodes de chromatographie liquide en comparaison directe. Cet article traite des différences entre les deux techniques en mettant l’accent sur les exigences de leurs analytes respectifs.
Les noms chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) et chromatographie liquide à haute performance (HPLC) offrent un indice des différences entre ces méthodes chromatographiques. Alors que la CLHP fonctionne à haute pression pour analyser de petits composés chimiques, la CLPF purifie de grandes biomolécules comme les protéines ou l’ADN. La chromatographie des biomolécules est très exigeante et sensible car elles ne supportent pas les hautes températures, les hautes pressions ou les solvants habituellement utilisés en HPLC. Pour ces raisons, la séparation des biomolécules nécessite une approche alternative à la CLHP.
Plusieurs termes sont couramment utilisés pour la chromatographie liquide rapide des protéines, comme la biochromatographie, la bioséparation ou la biopurification. Cette forme particulière de chromatographie est appliquée pour purifier de grandes biomolécules de plusieurs kilodaltons (kDa) comme les protéines, les nucléotides ou les peptides (figure 1). L’objectif de l’utilisateur de la FPLC est d’obtenir un produit aussi pur et natif que possible. Les objectifs de la CLHP classique, en revanche, sont d’identifier et de qualifier les analytes, généralement de petits composés dont la taille varie de quelques atomes à environ 3000 Da.
Le défi d’obtenir une protéine pure à partir d’un extrait cellulaire
Typiquement, les biomolécules sont purifiées à partir de cellules bactériennes ou eucaryotes, qui sont remplies de protéines, d’ADN, d’ARN et de membranes cellulaires. Par conséquent, la purification de la protéine d’intérêt à partir d’un extrait cellulaire peut être très difficile. Les biochimistes ont recours à plusieurs astuces : l’une consiste à utiliser des protéines recombinantes, qui sont surexprimées par les cellules. La surexpression de la protéine d’intérêt permet de la purifier en plus grande quantité. La deuxième astuce consiste à ajouter une étiquette à la protéine d’intérêt, qui est spécifiquement reconnue par la résine (matériau de la colonne). Les protéines sans étiquette ne se lient pas à la colonne et éluent immédiatement, tandis que la protéine souhaitée est enrichie et peut être séparée facilement.
Les biomolécules sont purifiées à partir de lysats cellulaires, ce qui signifie des volumes d’échantillons beaucoup plus importants que dans la CLHP analytique. Par conséquent, des boucles d’échantillonnage plus grandes ou même des pompes avec des débits plus élevés sont utilisées pour injecter l’échantillon. De plus, les matériaux des colonnes FPLC et HPLC sont complètement différents. Pour l’HPLC, on utilise des billes de silice avec des particules de très petite taille et une grande résistance aux hautes pressions, alors que la FPLC nécessite de l’agarose ou un matériau polymère avec des particules de plus grande taille pour la plupart des méthodes. Les résines utilisées pour la FPLC ne sont pas aussi stables à la pression que les billes de silice et sont très sensibles aux bulles d’air. En outre, non seulement le matériau de la colonne mais aussi le matériel de la colonne diffèrent. En HPLC classique, on utilise des colonnes en acier inoxydable résistant à la pression. Comme nous l’avons déjà mentionné, la stabilité de la pression n’est pas importante pour la FPLC et il est donc possible de travailler avec des colonnes en verre transparent et biocompatible. C’est un grand avantage car l’utilisateur peut vérifier l’absence de bulles d’air dans la colonne ou surveiller l’état du matériau pendant un cycle de purification.
Diverses biomolécules, diverses méthodes de purification
Les différences dans le matériau de la colonne se reflètent également dans les méthodes. En HPLC analytique, la chromatographie en phase inversée avec des phases stationnaires hydrophobes et des phases mobiles polaires est la méthode de choix, tandis qu’en FPLC, une plus grande variété de méthodes est appliquée (figure 2). L’une des méthodes FPLC est la chromatographie d’exclusion de taille (SEC), où les molécules sont séparées en fonction de leur taille. Les molécules les plus petites peuvent diffuser dans les pores des billes, tandis que les molécules plus grandes traversent la colonne presque sans être retenues. Les plus petites molécules éluent plus tard de la colonne, ce qui génère un gradient de ces molécules en fonction de leur taille. Une autre approche de séparation est la chromatographie par échange d’ions. Les biomolécules sont séparées et purifiées en fonction de leur charge spécifique, qui dépend du pH du tampon. Plus la protéine est chargée, plus elle se fixera à la résine de charge opposée. Pour éluer la protéine de la colonne, la concentration d’ions de sel est augmentée au cours de l’analyse. Les ions de sel entrent en compétition avec la protéine pour la liaison à la résine. Une autre méthode importante de FPLC est la chromatographie d’affinité où la molécule d’intérêt peut se lier spécifiquement à la colonne tandis que les autres molécules ne le peuvent pas et seront éluées sans se lier. On utilise ici des colonnes avec des milieux spéciaux qui reconnaissent la biomolécule souhaitée. Une forme particulière de chromatographie d’affinité est l’affinité par ions métalliques immobilisés (IMAC). La protéine d’intérêt doit être génétiquement modifiée par l’ajout d’une étiquette à la protéine, qui consiste généralement en six histidines. La résine IMAC reconnaît spécifiquement ce « Hisâtag ». L’élution a lieu en augmentant la concentration d’imidazole qui entre en compétition avec les protéines marquées par His. En outre, les protéines peuvent également être séparées par leur hydrophobie spécifique en utilisant la méthode de séparation par interaction hydrophobe. La résine est composée de telle manière que les protéines les plus hydrophobes se lieront le plus fortement à la colonne et seront éluées en diminuant le gradient de sel.
Pour purifier une protéine désirée, on utilise généralement une combinaison de méthodes. Dans la première étape, dite de « capture », la protéine est purifiée à partir de l’extrait brut. Typiquement, la chromatographie d’affinité est utilisée pour cette première étape de purification. La deuxième étape, dite « intermédiaire », élimine toute contamination supplémentaire par chromatographie d’échange d’ions ou par interaction hydrophobe. L’objectif de l’étape finale de « polissage » – généralement une étape de chromatographie d’exclusion de taille – est de se débarrasser de toutes les impuretés restantes pour obtenir un produit de grande pureté. Cette stratégie de purification des protéines dépend totalement de la biomolécule spécifique. Dans certains cas, une purification en deux étapes peut être suffisante. Plus les méthodes sont combinées, plus la protéine d’intérêt est perdue au cours de la purification, mais une pureté plus élevée peut être obtenue.
Après la purification, l’échantillon atteint peut être analysé pour la pureté, la concentration et la fonction ou l’activité enzymatique en utilisant la CLHP, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), les essais d’activité enzymatique ou la spectrométrie de masse.
Exigences de la CLHP
Les protéines sont composées d’acides aminés alignés en chaîne. Cette chaîne est repliée en une structure tridimensionnelle, qui est la clé de la fonction et de l’activité de chaque protéine. Par conséquent, il est très important de maintenir cette structure protéique pendant le processus de purification. Des facteurs externes tels qu’une température élevée, une pression élevée, un pH extrême ou des solvants peuvent perturber la structure de la protéine et sont donc évités dans la FPLC. La température de travail pour les protéines est généralement de 4 °C. C’est pourquoi une machine FPLC est souvent placée à l’intérieur d’une chambre froide ou d’une salle froide où elle est exposée non seulement à une température basse mais aussi à une humidité de condensation. Les composants d’un système FPLC doivent être spécialement conçus pour ces conditions. De plus, les composants FPLC sont confrontés à un défi supplémentaire, à savoir les solutions tampons salines qui sont utilisées comme éluants. On choisit généralement un pH isosmotique et des concentrations de sel similaires à l’environnement cellulaire. Les systèmes de chromatographie sont généralement fabriqués en acier inoxydable. D’une part, le sel contenu dans les tampons peut entraîner une corrosion et d’autre part, les ions métalliques de l’acier inoxydable peuvent interférer avec la protéine et perturber sa structure. Il est donc important d’éviter l’acier inoxydable et d’utiliser des matériaux biocompatibles comme la céramique en polyéther éther cétone (PEEK) ou le titane lors de la réalisation de la FPLC. Comme les systèmes HPLC, les systèmes FPLC sont également contrôlés par un logiciel. Il existe des différences considérables entre les logiciels FPLC et HPLC. Ce dernier est principalement utilisé pour analyser les échantillons et contient de nombreux outils d’analyse. En revanche, en FPLC, peu d’outils analytiques sont nécessaires et il est courant de générer des méthodes basées sur le volume ou même le volume de la colonne (Figure 3). Pour la plupart des applications FPLC, les méthodes basées sur le volume de la colonne sont préférées, ce qui facilite la mise à l’échelle. Les logiciels FPLC sont généralement très intuitifs et conviviaux et comprennent un contrôle direct, qui permet d’ajuster les paramètres en cours d’exécution. L’utilisateur peut ainsi réagir très spontanément à différentes situations.
Il est donc clair qu’il existe des différences majeures entre ces deux domaines chromatographiques (tableau 1). Les méthodes, le matériel et les logiciels diffèrent grandement selon que la molécule est analysée ou purifiée. Pour les applications FPLC, la nature sensible des échantillons et l’ambition de les garder aussi natifs que possible ajoutent au défi. Dans l’ensemble, les deux techniques sont des domaines très intéressants que toute personne travaillant dans ce domaine devrait connaître.
Stephanie Runde a obtenu un diplôme en biochimie à l’Université technique de Munich, en Allemagne. Elle a obtenu son doctorat à la Freie Universität Berlin, en Allemagne, et travaille actuellement chez Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH en tant que chef de produit pour le FPLC.