Abstract

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) est largement utilisé dans les médecines populaires. La glycyrrhizine, un composé actif de G. glabra, possède une activité anti-inflammatoire. Cette étude porte sur l’extrait méthanolique de G. glabra et la glycyrrhizine pour le traitement de la néovascularisation cornéenne (CNV). G. glabra a été extrait dans du méthanol aqueux à 70%. Des tests phytochimiques, la chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) ont été utilisés pour l’analyse de la composition chimique. La solution topique d’extrait méthanolique de G. glabra (2% p/v) et de glycyrrhizine (1% p/v) a été préparée dans une solution saline normale. Après une brûlure cornéenne (NaOH 1 N), les animaux ont été laissés sans traitement pendant une semaine afin que la néovascularisation apparaisse dans tous les groupes. Les traitements ont commencé le 7e jour et se sont poursuivis pendant les 21 jours consécutifs suivants. Les animaux ont été traités avec 3 gouttes de différentes solutions topiques trois fois par jour. L’analyse des photographies numériques et les études histologiques ont été utilisées pour l’évaluation de la NVC. L’analyse phytochimique de l’extrait méthanolique de G. glabra a montré la présence de saponines, de phénols, de glucides, de flavonoïdes et de protéines. La CCL et l’HPLC ont confirmé la présence de glycyrrhizine. L’analyse des photographies du groupe traité par l’extrait et la glycyrrhizine a montré une diminution considérable de la NVC. L’étude histologique des groupes traités au G. glabra et à la glycyrrhizine a montré l’absence de vaisseaux sanguins avec des fibres de collagène correctement disposées. Cette étude a montré que le G. glabra et la glycyrrhizine peuvent être utilisés pour le traitement du CNV. L’isolement guidé par des essais biologiques peut conduire à la préparation de solutions ophtalmiques pour le traitement du CNV.

1. Introduction

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) est originaire de la région méditerranéenne, du centre de la Russie méridionale et de l’Asie, et est maintenant largement cultivée dans toute l’Europe et au Moyen-Orient. La réglisse a une valeur nutritionnelle élevée et était utilisée dans l’alimentation depuis les temps anciens. Dans l’alimentation, elle est principalement utilisée comme agent sucrant. Elle a également la propriété d’inhiber la sensation de soif. L’huile de réglisse est approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) et a des applications dans divers produits alimentaires tels que les boissons, le dentifrice, le chewing-gum et les cosmétiques. G. glabra a été largement utilisé dans la médecine populaire pour le traitement de différentes maladies. Les feuilles de G. glabra sont utilisées pour le traitement des blessures, les racines pour le diabète, la maladie de Graves, et la flatulence et la tige pour le traitement de la tuberculose. Il est également utilisé comme aphrodisiaque. L’extrait méthanolique des parties aériennes de G. glabra a montré une activité antimicrobienne contre plusieurs espèces bactériennes. L’extrait méthanolique aqueux de G. glabra a inhibé la prolifération in vitro et in vivo des cellules tumorales d’ascite d’Ehrlich et a montré une activité antiangiogénique dans les essais in vivo, péritonéaux et sur la membrane chorioallantoïque. La réglisse a également montré des effets antiagrégants plaquettaires et a été utilisée comme plante médicinale pour soulager la toux depuis des temps anciens. Les racines de réglisse chinoise ont inhibé la croissance de Plasmodium falciparum et de Leishmania donovani dans des études in vitro. En outre, la réglisse a été signalée pour avoir des activités antibactériennes et antivirales .

G. glabra contient plusieurs constituants chimiques, tels que la saponine, les flavonoïdes, les isoflavonoïdes, les stilbénoïdes et les coumarines. Les constituants actifs des saponines sont la glycyrrhizine, l’acide liquiritic et le glycyrrétol. Dans les flavonoïdes, les constituants actifs sont la liquirtine, la liquiritigénine et la néoliquiritine. Dans les isoflavonoïdes, ce sont la glabridine, la glabrone, la glyzarine et le galbène. Les constituants actifs des coumarines sont la liqcoumarine et l’umbelliférone. Enfin, dans les stilbénoïdes, le constituant actif est le dihydrostilbène . La glycyrrhizine est un sel de potassium et de calcium de l’acide glycyrrhizinique. C’est un glycoside de saponine qui, après hydrolyse, donne de l’acide glycyrrhétinique. La glycyrrhizine, également connue sous le nom d’acide glycyrrhizique, est le principal constituant actif (10 à 25 %) de l’extrait de racine de G. glabra. La glycyrrhizine aide à inhiber le cancer du poumon et les fibrosarcomes. Au Japon, elle est utilisée pour le traitement de l’hépatite C depuis plus de 60 ans. En outre, la glycyrrhizine a présenté des propriétés proapoptotiques dans un modèle hépatocytaire de lésion hépatique cholestatique. L’acide glycyrrhétinique s’est révélé être un puissant inhibiteur de l’apoptose et de la nécrose induites par les acides biliaires. Les membres des flavonoïdes comme l’isoliquiritigenin et le licochalcone ont été trouvés pour posséder des activités antioxydantes, antitumorales, anti-inflammatoires et antiangiogéniques .

La cornée est un tissu transparent, avasculaire et externe de l’œil. Sa transparence est nécessaire à la clarté de la vision. Dans des conditions normales, l’avascularisation de la cornée est maintenue par un équilibre entre les facteurs angiogéniques et antiangiogéniques. La modification de cet équilibre en faveur des facteurs angiogéniques provoque une néovascularisation cornéenne (NVC) . La NVC est un état pathologique dans lequel la transparence de la cornée est perdue en raison de la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins provenant de la région du limbe de l’œil. Le développement de la NVC entraîne une réduction de la transparence de la cornée et, par conséquent, une déficience visuelle, généralement une perte de la vision centrale, ou peut même entraîner la cécité.

Bien que la cause exacte de la NVC ne soit pas encore complètement identifiée, plusieurs conditions pathologiques telles que l’inflammation, l’infection, la dégénérescence et les troubles traumatiques peuvent induire la NVC. L’utilisation de lentilles de contact induit également une hypoxie, qui peut finalement conduire au NVC. Parmi ces facteurs, les maladies infectieuses de la cornée sont la cause la plus importante du NVC . Actuellement, les options de traitement du NVC comprennent des médicaments comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), les stéroïdes et la cyclosporine, des thérapies au laser comme la photocoagulation au laser argon thermique, la transplantation de membrane amniotique et la transplantation de limbe. Cependant, tous les traitements disponibles présentent des inconvénients tels qu’un coût élevé, une faible efficacité et des effets secondaires graves.

Il est absolument nécessaire de trouver un traitement nouveau et alternatif pour le NVC. Dans le passé, il a été observé que les extraits et les composés ayant des activités anti-inflammatoires et antiangiogéniques ont le potentiel de traiter le CNV. Sur la base des informations ethnopharmacologiques et d’autres informations scientifiques sur les activités anti-inflammatoires et antiangiogéniques de l’extrait de G. glabra et de son principal constituant chimique, la glycyrrhizine, l’étude actuelle a été menée pour évaluer leur potentiel pour le traitement de la NVC. Il a été constaté que l’extrait de G. glabra a efficacement arrêté le CNV mais la glycyrrhizine s’est avérée relativement moins efficace pour arrêter le développement du CNV dans le modèle animal.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Matériel végétal

Les racines de G. glabra ont été achetées en juin 2015 dans une herboristerie authentique à Abbottabad, au Pakistan. L’identification du spécimen (numéro de pièce justificative gg-09-R/15) a été confirmée par le Dr Abdul Nazir, professeur adjoint, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan, et le spécimen de plante a été déposé au département de pharmacie, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan.

2.2. Produits chimiques

La glycyrrhizine (pureté 75%) a été achetée à Sigma Aldrich, USA. La kétamine HCl (Indus Pharma, Pakistan), la xylazine HCl (FARVET, Pérou), la proparacaïne HCl (Alcon Laboratories, Inc., USA) et le sérum physiologique (Otsuka Pakistan Ltd.) ont été achetés dans une pharmacie locale.

2.3. Traitement et extraction

Le matériel végétal séché a été broyé et extrait par trempage du matériel en poudre (745 g) dans du méthanol aqueux à 70% (3 L) à température ambiante. Le mélange a été agité occasionnellement avec une tige en acier inoxydable pendant deux semaines pour obtenir l’extrait maximal. L’extrait a été filtré à travers une toile de mousseline puis sur un papier filtre Whatman numéro 42 (125 mm). L’extrait a été concentré à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide (Yamato Rotary Evaporator, RE 801 ; Corée du Sud) avec le bain-marie réglé à 40°C. Le rendement final en pourcentage de l’extrait était de 12,2%.

2.4. Analyse phytochimique et empreinte digitale

L’extrait brut a été soumis à une analyse phytochimique préliminaire pour tous les principaux constituants chimiques en utilisant des tests chimiques standard . Pour les alcaloïdes, l’extrait (500 mg) a été agité avec 5 mL de HCl à 1% et chauffé doucement pendant 1 min en utilisant un bain-marie. Ensuite, 1 mL de cette solution a été prélevé et 0,5 mL de réactif de Wagner a été ajouté. Le développement d’une turbidité ou de précipités indique la présence d’alcaloïdes. Pour les stéroïdes, on a utilisé le test de Salkwoski dans lequel on a ajouté 2 mL de chloroforme pour dissoudre 100 mg d’extrait dans un tube à essai. Ensuite, 2 mL de H2SO4 concentré ont été soigneusement ajoutés pour former la couche inférieure. Une couleur verte s’est formée sur la couche supérieure, indiquant la présence de stéroïdes. Pour les saponines (test de la mousse), 3 mg d’extrait ont été dissous dans 10 mL d’eau distillée et vigoureusement secoués dans un tube à essai et laissés reposer pendant 1 minute. Le développement d’une mousse consistante indique la présence de saponines. Pour les flavonoïdes (test à l’acétate de plomb), 1 ml de solution d’acétate de plomb (5 %) a été ajouté à 1 mg de l’extrait végétal dans un tube à essai. On a laissé le mélange reposer sans le perturber. La formation de précipités de couleur jaune indique la présence de flavonoïdes. Pour les phénols (test au chlorure ferrique), 2 mg d’extrait ont été pris dans un tube à essai et 3 gouttes de chlorure ferrique à 10% ont été ajoutées. L’apparition d’une couleur bleu-noir indique la présence de phénols. Pour les glycosides (test au nitroprussiate), on ajoute à l’extrait de méthanol quelques gouttes d’hydroxyde de sodium à 10%, puis on ajoute du nitroprussiate de sodium à la solution ci-dessus. L’apparition d’une couleur bleue indique la présence de glycosides dans l’extrait. Pour les sucres réducteurs, la solution de Fehling (A et B) a été ajoutée à l’extrait aqueux de méthanol (100 mg/mL) dans un tube à essai. La solution résultante a été chauffée au bain-marie pendant 10 minutes. La formation d’un précipité rouge-orange était une indication positive de la présence de sucres réducteurs. Pour la détection des protéines, l’extrait végétal a été traité avec quelques gouttes d’acide nitrique concentré. La formation d’une couleur jaune indiquait la présence de protéines.

La chromatographie sur couche mince (CCM) a été utilisée pour l’identification de divers composés, notamment le principal constituant chimique, la glycyrrhizine. L’extrait et la glycyrrhizine ont été appliqués sur des plaques TLC recouvertes de gel de silice (60 F254) et développés dans du n-butanol, de l’acide acétique et de l’eau distillée (12 : 3 : 5) comme phase mobile. Le sulfate cérique a été utilisé comme réactif de pulvérisation pour la visualisation des composés sur les plaques CCM.

La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) (Perkin Elmer, échantillonneur automatique série 200) a été utilisée pour l’analyse de l’extrait et de la glycyrrhizine. Les conditions suivantes ont été appliquées lors de la prise d’empreinte par HPLC : Détecteur UV-Vis (200-700 nm), colonne (C18) (5 μm, 150 mm × 4,6 mm), phase mobile qui était de l’acétonitrile et de l’eau dans le rapport de 10 : 90, volume d’injection qui était de 20 μL, débit qui était de 1 mL/min, et filtre à membrane de 0,45 μm ont été utilisés. Les composés ont été détectés à une longueur d’onde de 254 nm. Pour le G. glabra, 100 mg de l’extrait ont été pris dans 25 mL de méthanol aqueux à 70% dans une fiole volumétrique (50 mL) et sonicaté pendant 50 min à température ambiante. La solution standard de glycyrrhizine a été préparée en dissolvant 5 mg de glycyrrhizine dans du méthanol et le volume final a été porté à 10 mL avec une nouvelle addition de méthanol. Les solutions mères d’extrait de G. glabra et de glycyrrhizine ont été filtrées et dégazées par ultrasons avant analyse.

2.5. Animaux

Des lapins des deux sexes (1,5-2 kg) ont été utilisés comme modèle animal dans l’étude actuelle. Ils ont été achetés sur le marché local de la ville d’Abbottabad. Le protocole expérimental a été approuvé selon les règlements du comité d’éthique du CIIT Abbottabad pour les animaux avec le numéro d’approbation PHM.Eth/SP.14-714-CIIT-ATD le 11 juillet 2015, qui suit toutes les recommandations du NIH Animal Ethical Guideline (1986). Les lapins ont été séparés au hasard en quatre groupes avec un minimum de cinq animaux par groupe. Ensuite, chaque lapin a été étiqueté à l’oreille au sein des groupes afin de garantir leur séparation pendant toute la procédure expérimentale. Les animaux ont été placés dans des conditions standard et ont eu un accès libre à la nourriture et à l’eau.

2.6. Induction de la brûlure cornéenne dans l’œil du lapin

Pour l’induction de CNV, les yeux droits de tous les animaux expérimentaux ont été endommagés par brûlure alcaline (solution d’hydroxyde de sodium 1 N) en utilisant le protocole rapporté . En bref, les animaux expérimentaux ont été affamés pendant 12 heures avant de commencer l’expérience. Les animaux ont été anesthésiés par une injection intramusculaire de kétamine HCl (50 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) en combinaison. Ensuite, l’œil droit du lapin a été ouvert à l’aide d’un spéculum métallique afin de pouvoir induire correctement la brûlure alcaline. Environ 2 minutes avant la brûlure, quelques gouttes de proparacaïne HCl ont été instillées dans l’œil droit de chaque lapin pour minimiser l’irritation de la cornée. Un poinçon en papier a été utilisé pour produire un disque de 7 mm à partir de papier filtre Whatman. Les disques de papier filtre ont été délicatement plongés dans une solution d’hydroxyde de sodium 1 N pendant environ 90 secondes, puis placés au centre de la cornée pendant 2 minutes pour provoquer des brûlures graves. Les yeux ont été lavés avec du sérum physiologique pour les humidifier et les rendre stériles. Après la brûlure cornéenne, les lapins ont été gardés pendant une semaine pour le développement du CNV sans autres traitements.

2.7. Préparations des gouttes oculaires et protocoles de traitement

La solution topique de l’extrait de G. glabra (2% p/v) a été préparée dans une solution saline normale en utilisant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) et quelques gouttes de Tween-80 et mélangée en utilisant un mélangeur vortex. De même, une solution de glycyrrhizine (1% p/v) a été préparée dans une solution saline normale. Pour la préparation du véhicule, du diméthylsulfoxyde (DMSO) (10% v/v) et quelques gouttes de Tween-80 ont été mélangés dans une solution saline normale. La dexaméthasone (0,1%) (ALCON-COUVREUR, Belgique) a été obtenue sur le marché local et utilisée comme contrôle positif. Toutes les solutions topiques ont été conditionnées dans des compte-gouttes spéciaux achetés sur le marché local et conservés à 4°C. Les traitements ont été commencés le 7ème jour des brûlures cornéennes et poursuivis pendant les 21 jours consécutifs suivants. Les yeux des différents groupes d’animaux ont été traités topiquement avec 3 gouttes de différentes solutions trois fois par jour. Le premier groupe a reçu un traitement à base d’extrait de G. glabra tandis que le deuxième groupe a été traité avec de la glycyrrhizine. Le troisième groupe a reçu le véhicule et le quatrième groupe traité avec la dexaméthasone (0,1%) a été considéré comme un contrôle positif.

2.8. Analyse microscopique et photographique

La progression du CNV dans tous les groupes a été périodiquement surveillée à travers un microscope à lampe à fente (Olympus-CX21) avec une source de lumière artificielle fixée manuellement. Les photographies ont été prises à l’aide d’un appareil photo numérique (DSC-W70, Sony, Japon) avec un grossissement ×12, une distance d’objectif de 85 mm, un taux de zoom de 100 % et une distance de prise de vue de 29 cm. Les photographies ont été prises les jours 1, 7, 14, 21 et 28 et stockées dans l’ordinateur pour une utilisation ultérieure.

2.9. Études histologiques des tissus cornéens

Le dernier jour de l’expérience, les animaux ont été sacrifiés par dislocation cervicale. Les yeux entiers ont été extraits et conservés dans du formol neutre à 10%. Après les conservations, des échantillons de tissus cornéens ont été prélevés sur l’œil entier à l’aide de lames chirurgicales. Les tissus ont ensuite été transférés dans des bocaux perforés (capsule) à l’aide de pinces. Ces tissus ont été immergés dans du formol (15%) puis dans une solution saline de formaldéhyde alcoolique (15%) pendant 3 heures chacun. Les tissus ont ensuite été déshydratés en utilisant des degrés croissants d’alcool (éthanol). Au cours de ce processus, les tissus ont été traités avec de l’alcool à 70 % et à 80 % pendant 2 heures chacun et enfin avec de l’alcool à 100 % pendant 6 heures. Dans l’étape suivante, les échantillons ont été nettoyés dans du xylène pur pendant 6 heures (3 changements toutes les 2 heures dans différents bocaux). Les tissus ont ensuite été enrobés dans de la cire de paraffine à l’aide d’une cabine chauffante automatique dont la plage de température est de 58 ± 5°C. Les tissus ont été plongés dans la cire de paraffine pendant 4 h (2 h en 2 fois et dans des bocaux différents). Ensuite, des sections de 4 μm de tissus cornéens ont été obtenues à l’aide d’un microtome rotatif (Thermo Fisher Scientific, Allemagne). Pour une fixation adéquate, des gouttes d’albumine d’œuf ont été placées sur des lames et une seule section de tissu a été montée dessus. Ensuite, les lames ont été placées pendant 2 heures dans un incubateur mécanique de précision pour la fixation (réchauffeur de lames) (modèle 4EM, numéro de catalogue 31574). La coloration histologique à l’hématoxyline &éosine (H&E) a été réalisée à travers différentes étapes dont le déparaffinage, l’hydratation, la coloration à l’hématoxyline, la décoloration (coloration à l’éosine) et la déshydratation.

3. Résultats

3.1. Analyse phytochimique de G. glabra

L’analyse phytochimique de l’extrait de G. glabra a été réalisée pour connaître la présence des principales classes de constituants phytochimiques. Les résultats ont révélé la présence de flavonoïdes, de glucides, de protéines, de saponines et de phénols comme le montre le tableau 1. La présence d’alcaloïdes, de phytostérol et de glycosides n’a pas été confirmée dans l’enquête actuelle (tableau 1).

. Composants phytochimiques Test chimique Présence Alcaloïdes Test de Wagner . de Wagner – Test au phytostérol Test de Salkowski – Saponines Test à la mousse et à la mousse + Flavonoïdes . Test au réactif alcalin + Phénols Test au chlorure ferrique + Glycosides Test au nitroprussiate – Carbohydrates Test de Fehling + Protéines Test xanthoprotéique +

+ = preuve de produits phytochimiques ; – = aucune preuve de la présence de substances phytochimiques.

Tableau 1

L’analyse phytochimique de l’extrait de G. glabra a montré la présence de saponines, de flavonoïdes, de phénols, d’hydrates de carbone et de protéines.

Les résultats obtenus à partir des tests chimiques ont été confirmés par une analyse TLC. L’extrait a été normalisé par rapport à son principal constituant chimique, la glycyrrhizine. Les résultats ont été présentés dans la figure 1. Les valeurs du facteur de rétention (Rf) des constituants de l’extrait ont été comparées à la glycyrrhizine. Comme le montre la figure 1, la valeur Rf pour la tache visible A dans l’extrait de G. glabra était de 0,43 tandis que pour B, elle était de 0,15. La valeur Rf pour la glycyrrhizine (tache visible C) était également de 0,15. Sur la base de ces résultats, on peut confirmer que la glycyrrhizine était présente dans l’extrait comme l’un des principaux composés.

Figure 1

Profil CLT pour l’analyse de l’extrait de G. glabra et de la glycyrrhizine en utilisant des plaques TLC recouvertes de gel de silice et du n-butanol : acide acétique : eau (12 : 3 : 5) comme phase mobile.

L’analyse CLHP de l’extrait brut dérivé de G. glabra et de la glycyrrhizine a été effectuée pour obtenir les pics principaux pour les différents constituants chimiques dans les extraits et pour confirmer la présence du composé principal (glycyrrhizine). Le chromatogramme résultant a montré plusieurs pics à différents temps de rétention pour l’extrait de G. glabra, comme le montre la figure 2(b). Le chromatogramme a également montré un pic à un temps de rétention de 40 minutes pour la glycyrrhizine, comme le montre la figure 2(a). Comme pour la glycyrrhizine, un pic a également été observé dans le chromatogramme pour l’extrait au même temps de rétention (40 min) comme le montre la Figure 2(a). Les résultats ont confirmé la présence de la glycyrrhizine comme composant principal dans l’extrait du G. glabra.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figure 2

Chromatogramme CLHP de (a) glycyrrhizine et (b) G. glabra extrait. Les conditions HPLC étaient la longueur d’onde (254 nm), la phase mobile (acétonitrile : eau), le volume d’injection (20 μL) et le débit (1 mL/min).

3.2. Analyse de la NVC des groupes traités à l’extrait de G. glabra, à la glycyrrhizine, au véhicule et au contrôle positif

Pour observer l’efficacité du traitement à l’extrait de G. glabra et à la glycyrrhizine, la progression de la NVC a été suivie au microscope et par analyse photographique sur différents jours de traitement. Les photographies prises à différents jours de traitement sont présentées dans la figure 3 pour les groupes traités par l’extrait et le véhicule. Il a été observé au microscope et peut également être vu sur les photographies que, même dans la première semaine de traitement, l’épaisseur du néovaisseau (NV) augmente dans le groupe traité par l’extrait. Cependant, une diminution plus rapide de l’épaisseur du vaisseau a été observée après la deuxième semaine (Figure 3) et s’est poursuivie jusqu’à la fin de l’expérience. Les résultats obtenus ont montré que l’extrait de G. glabra a presque complètement fait disparaître le NVC au 28e jour de l’expérience par rapport au groupe témoin avec véhicule (Figure 3). Le groupe traité à la dexaméthasone (contrôle positif) (Figure 3) a également montré la même tendance que le groupe traité à l’extrait de G. glabra. L’observation microscopique et l’analyse photographique ont également révélé que la glycyrrhizine avait des effets positifs sur le blocage du NVC. Lorsque les yeux ont été analysés à l’aide d’un microscope à haute résolution, il a été constaté une disparition progressive des vaisseaux sanguins et une reprise de la forme normale le dernier jour du traitement (Figure 3) avec la présence de quelques NV seulement. Ces résultats ont montré que l’activité anti-VCN de la glycyrrhizine était légèrement inférieure à celle de l’extrait brut.

Figure 3

Photographies représentatives de NVC dans l’extrait de G. glabra, la glycyrrhizine, le véhicule et la dexaméthasone (contrôle positif) aux jours 0, 7, 14, 21 et 28. Il y a une diminution graduelle du diamètre et de l’épaisseur du NV, et elle a presque disparu le dernier jour de l’expérience. Le groupe traité à la glycyrrhizine a également montré une diminution du diamètre et de l’épaisseur des NV mais l’activité était moindre que celle de l’extrait de G. glabra.

3.3. Analyse histologique de la cornée traitée au G. glabra et à la glycyrrhizine en comparaison avec le véhicule et le groupe témoin positif

L’analyse histologique a été réalisée pour connaître la présence d’une inflammation, la récupération des fibres cornéennes et l’existence de vaisseaux sanguins. Les microphotographies représentatives colorées au H&E ont été présentées dans la figure 4. L’histologie de l’œil gauche de chaque animal a été considérée comme un tissu de référence car aucune brûlure alcaline n’a été induite et les animaux ont été maintenus dans des conditions normales. Dans la cornée de référence, il n’y avait pas de croissance épithéliale ni de NV, ni de changement de morphologie, comme le montre la figure 4. Dans le groupe de contrôle avec véhicule (Figure 4), on a observé des vaisseaux sanguins étendus et une perturbation du collagène, ce qui a montré le développement de NVC. D’autre part, l’histologie de la cornée traitée avec des extraits de G. glabra a montré que la région cornéenne est presque redevenue normale avec des vaisseaux sanguins presque diminués et des collagènes de forme normale. L’analyse histologique du groupe traité à la glycyrrhizine (Figure 4) a montré que, bien que la région cornéenne ait presque retrouvé sa forme normale, certains signes indiquent que des dommages sont toujours présents. Il y avait quelques signes d’hypertrophie épithéliale et moins de vaisseaux sanguins ont également été observés. Ces résultats ont montré que la glycyrrhizine est efficace pour inhiber le NVC mais dans une moindre mesure que l’extrait de G. glabra. En comparaison, la microphotographie des lames colorées au H&E de la cornée traitée à la dexaméthasone (Figure 4) a montré une réduction de la croissance épithéliale et de la formation de vaisseaux sanguins dans la région cornéenne mais les fibres de collagène étaient en quelque sorte dans un état détruit et disposées de façon désordonnée.

Figure 4

Microphotographie histologique de G. glabra et du groupe traité à la glycyrrhizine en comparaison avec le contrôle du véhicule et le contrôle positif.

4. Discussion

Le VCN est l’une des principales causes de cécité dans le monde. Il a été estimé qu’environ 4,14% de la population mondiale est affectée par cette maladie . La principale cause moléculaire du NVC est le déséquilibre entre les facteurs angiogéniques et antiangiogéniques. Parmi ces facteurs, le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) favorise la propagation, le passage et la formation de tubes des cellules endothéliales vasculaires. Il est donc possible de traiter le NVC à l’aide d’agents anti-VEGF ; cependant, il ne peut pas être traité complètement par la seule thérapie anti-VEGF car il existe également d’autres régulateurs de l’angiogenèse. De plus, l’inflammation et l’angiogenèse sont des processus interdépendants et le traitement anti-VEGF peut donc ne pas être efficace. Dans le passé, il a été observé que les extraits et les composés ayant une activité antitumorale et anti-inflammatoire sont utiles dans l’inhibition des NV et CNV. L’extrait brut de G. glabra a montré un effet anti-inflammatoire tandis que l’extrait aqueux de G. glabra a inhibé l’angiogenèse dans des essais in vivo. Par conséquent, on a émis l’hypothèse que l’extrait de G. glabra et son principal constituant chimique, la glycyrrhizine, pourraient avoir la capacité de contrôler le CNV et c’est ainsi que l’étude actuelle a été entreprise.

Il est important de connaître la composition chimique de tout extrait avant de l’évaluer pour ses activités biologiques. Par conséquent, l’analyse phytochimique de l’extrait de G. glabra a été effectuée, ce qui a révélé qu’il contient des constituants chimiques importants comme les flavonoïdes, les glucides, les protéines, les saponines et les phénols. Des études antérieures ont signalé la présence de saponine, de flavonoïdes, d’alcaloïdes, de terpénoïdes, de tannins et de glycosides, mais les glucides, les protéines, les phlobatannins, les composés phénoliques et les anthraquinones n’ont pas été détectés. Une autre étude a montré la présence d’hydrates de carbone, de composés phénoliques, de protéines et d’autres constituants dans l’extrait de G. glabra. Les raisons de ces différences peuvent être la saison et l’âge des plantes collectées.

La TLC et la HPLC ont confirmé la présence de glycyrrhizine dans l’extrait brut. Les chromatogrammes TLC et HPLC de l’extrait ont révélé un composé à la valeur Rf (0,15) et au temps de rétention (environ 40 min) comme celui de la glycyrrhizine standard. Ces résultats s’écartent un peu des observations précédentes dans lesquelles la glycyrrhizine standard était repérée à 0,22 . La principale raison de cet écart pourrait être l’utilisation de réactifs et de conditions différents dans l’étude précédente et dans la présente étude. Dans l’étude précédente, le chloroforme, le méthanol et l’eau ont été utilisés comme phase mobile et l’acide anisaldéhyde-sulfurique comme réactif de pulvérisation tandis que dans la présente étude, le n-butanol, l’acide acétique et l’eau distillée ont été utilisés comme phase mobile et le sulfate cérique comme réactif de pulvérisation.

La glycyrrhizine, l’un des principaux composants de G. glabra, a été signalée comme possédant des activités anti-inflammatoires et anticancéreuses . Les résultats de l’étude actuelle ont révélé que l’extrait de G. glabra a réussi à inhiber le NVC car les NV étaient presque diminués après 21 jours de traitement (Figure 3). Comme il s’agit du composé principal, on a pensé que l’inhibition du NVC pouvait être due à la glycyrrhizine. L’analyse anti-CNV de la glycyrrhizine a montré quelques effets positifs sur l’inhibition du CNV mais n’a pas été capable de diminuer complètement les vaisseaux sanguins dans la région cornéenne (Figure 3). La glycyrrhizine est un glycoside triterpénoïde (saponine) avec l’acide glycyrrhétinique. Auparavant, il a été signalé que l’acide glycyrrhétinique a un effet direct sur les récepteurs minéralocorticoïdes et produit des effets semblables à ceux de l’inflammation, ce qui pourrait être l’une des raisons des effets plus faibles de la glycyrrhizine. Cette étude suggère qu’avec la glycyrrhizine certains autres composés peuvent être responsables de l’inhibition du CNV dans l’extrait de G. glabra.

Il était également important d’étudier les effets de l’extrait de G. glabra et de la glycyrrhizine sur l’anatomie microscopique (microanatomie) du tissu cornéen. Une analyse histologique a donc été réalisée et ses résultats ont confirmé les effets anti-CNV de l’extrait de G. glabra. De plus, il n’y avait pas de signe clair de toxicité car les fibres de collagène étaient disposées en réseau dans la cornée des animaux traités avec l’extrait de G. glabra. L’anatomie microscopique de la cornée traitée à l’extrait de G. glabra était très similaire à celle du contrôle normal. En revanche, il n’y avait aucun signe de vaisseaux sanguins dans la cornée traitée à la dexaméthasone (contrôle positif), mais les fibres de collagène étaient toujours en désordre, ce qui montre que la dexaméthasone peut avoir des effets toxiques sur la cornée. Bien que des études précédentes aient également rapporté des effets toxiques de la dexaméthasone, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour confirmer ce phénomène au niveau microanatomique. Il est également important de mentionner que, bien que la glycyrrhizine ait largement réussi à contrôler le NVC, elle n’a pas été en mesure de récupérer complètement la cornée endommagée par les alcalis et certains vaisseaux sanguins ont également été observés.

5. Conclusions

On peut conclure des résultats que les gouttes ophtalmiques de l’extrait brut de G. glabra ont inhibé la croissance des vaisseaux dans la région cornéenne, ce qui indique qu’il serait efficace dans le traitement du CNV. De plus, le composé principal de G. glabra, la glycyrrhizine, n’a pas été capable d’empêcher complètement le NVC. Cela signifie qu’un ou plusieurs autres composants peuvent être responsables, avec la glycyrrhizine, de l’activité anti-CNV de l’extrait. À cette fin, des recherches supplémentaires sont nécessaires sur l’isolement guidé par des essais biologiques pour l’identification du ou des principaux composants responsables de l’inhibition de la CNV. En outre, des études moléculaires seront également utiles pour découvrir le mécanisme moléculaire exact de l’extrait de G. glabra dans le traitement du CNV.

Conflits d’intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Contributions des auteurs

Syed Luqman Shah et tous les autres auteurs ont contribué de manière égale à ce travail. Le document final est approuvé par tous les auteurs.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier Christie Ronge, Département de pharmacie, Froedtert & the Medical College of Wisconsin, 9200 West Wisconsin Avenue, Milwaukee, WI, pour son aide dans les corrections linguistiques/grammaticales.