Découverte de triterpénoïdes de Ganoderma lucidum comme inhibiteurs potentiels de la protéase NS2B-NS3 du virus de la Dengue

Protéase NS2B-NS3
Criblage virtuel et analyse de simulation de docking
Interaction moléculaire et analyse MM/GBSA
Analyse de dynamique moléculaire (MD)

Protéase NS2B-NS3

Les données de structure tridimensionnelle (3D) de la protéine cible ont été établies comme une exigence primaire pour la découverte de médicaments. Les structures cristallographiques aux rayons X et les modèles d’homologie générés pour les protéines cibles ont été utilisés pour identifier des ligands potentiels à partir de bases de données chimiques, mais les structures cristallographiques 3D ont été documentées comme étant plus efficaces que les modèles d’homologie générés in silico. Par conséquent, la structure 3D de la protéase NS2B-NS3 du DENV, qui a été proposée comme une cible thérapeutique majeure contre l’infection par le DENV, a été récupérée dans la banque de données des protéines (PDB) avec l’ID PDB : 2FOM40. La structure cristalline de NS2B-NS3pro a été résolue à 1,5 Å et présente deux chaînes de protéines, à savoir la chaîne A repliée pour former le cofacteur NS2B et la chaîne B comprenant le domaine NS3pro (Fig. 2a). Ici, le domaine protéase (NS3pro) dans la chaîne B (Fig. 2b) a été sélectionné pour un criblage virtuel basé sur la structure avec des triterpénoïdes sélectionnés de G. lucidum.

Criblage virtuel et analyse de simulation de docking

Récemment, le criblage virtuel basé sur la structure a gagné en popularité pour la découverte de nouveaux composés principaux à partir de grandes bibliothèques chimiques bioactives contre des cibles sélectionnées. Cette approche comprend la simulation de docking des ligands à la région du site actif du récepteur sélectionné, suivie par le classement et la notation des inhibiteurs23. Dans ce travail, nous avons effectué un criblage virtuel basé sur la structure de 22 triterpénoïdes antiviraux connus de G. lucidum contre NS3pro en utilisant le module Glide de la suite Schrodinger (Tableau S1). Ces inhibiteurs ont été analysés plus en détail par le protocole de docking XP du module Glide afin de recueillir des informations sur l’énergie de liaison ainsi que des modèles de liaison supplémentaires avec les résidus du site actif. Il a été observé que tous les triterpénoïdes sélectionnés présentaient des affinités de liaison significatives avec NS2B-NS3pro, à l’exception de l’acide ganodérique G (tableau S1). De plus, le docking moléculaire de l’inhibiteur de référence 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone contre le même site actif a produit un score de docking de -5,377 kcal/mol. Par conséquent, les triterpénoïdes dont les scores de docking étaient supérieurs à un seuil de -5 kcal/mol ont été sélectionnés pour l’analyse des interactions moléculaires. Nous avons sélectionné un total de quatre triterpénoïdes, c’est-à-dire le ganodermanontriol (-6,291 kcal/mol), le lucidumol A (-5,993 kcal/mol), l’acide ganodérique C2 (-5,948 kcal/mol) et l’acide ganosporérique A (-5,830 kcal/mol) comme inhibiteurs possibles du domaine NS3pro de la protéase du DENV. Ces scores d’accostage ont été considérés comme significatifs par rapport à l’inhibiteur connu 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone (-5,377 kcal/mol) et aux molécules bioactives rapportées Nimbin (-5,56 kcal/mol), Desacetylnimbin (-5,24 kcal/mol) et Desacetylsalannin (-3,43 kcal/mol) d’Azadirachta indica avec DENV NS3pro41. Ces résultats indiquent le potentiel des triterpénoïdes bioactifs de G. lucidum comme inhibiteurs de la protéase du DENV et suggère qu’ils pourraient être utilisés dans le développement de médicaments antiviraux pour l’infection du DENV.

Interaction moléculaire et analyse MM/GBSA

Parce que les contacts moléculaires dans les complexes docked protéine-ligand peuvent conduire à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires dans les systèmes biologiques42, le profilage de contact moléculaire a également été étudié pour les triterpénoïdes sélectionnés et l’inhibiteur de référence avec la protéase du DENV. Le complexe NS3pro-Ganodermanontriol a présenté une interaction par des liaisons hydrogène simples et doubles modérées dans la région active avec les résidus Lys73 (3 Å), Thr120 (2,94 Å) et Asn167 (3,26 Å, 2,86 Å), respectivement. Des attractions hydrophobes supplémentaires ont également été enregistrées au sein du complexe NS3pro-Ganodermanontriol au niveau des résidus Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 et Ala164. De même, les résidus His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 et Gly153 ont présenté des interactions polaires et glycines, respectivement avec le Ganodermanontriol. Parallèlement, des interactions de charge positive (Lys73 et Lys74) et négative (Asp75) avec des résidus ont également été enregistrées dans le complexe docké NS3pro-Ganodermanontriol (Fig. 3a,b).

Les profils d’interaction de NS3pro-Lucidumol A ont reflété deux liaisons hydrogène simples formées avec les résidus Asp75 (3,31 Å) et Asn152 (2,48 Å) et la formation de liaisons hydrogène doubles à Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å), ce qui contribue également à une interaction glycine avec le résidu Gly151. De plus, des interactions hydrophobes (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 et Tyr161) et polaires (His51, Ser135 et Asn152) ont également été enregistrées dans le complexe ancré. L’Asp75 présente des interactions de charge négative au niveau de la poche active de la protéase avec le Lucidumol A (Fig. 3c,d). De même, l’acide ganodérique C2 complexé avec NS3pro a montré la formation de doubles liaisons hydrogène modérées avec Gly151 (2,73 Å, 3,12 Å) tandis que la formation de simples liaisons hydrogène a été observée au niveau des résidus Trp50 (2,66 Å) et Arg54 (1,93 Å). De plus, la formation d’un pont salin entre le groupe hydroxyle de l’acide ganodérique C2 et le résidu Arg54 de la protéase a également été enregistrée dans ce complexe. En outre, des interactions polaires (résidus His51 et Asn152), négatives (résidu Asp75) et positives (résidu Arg54) ont également été enregistrées dans le complexe NS3pro-acide ganodérique C2 (Fig. 3e,f). Le complexe arrimé NS3pro-acide panosporéique A a montré trois liaisons hydrogène simples formées aux résidus Thr120, Asn152 et Asn167, tandis que Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 et Ala164 ont été marqués comme présentant des interactions hydrophobes (Fig. 3g,h). De plus, la NS3pro arrimée avec l’acide ganosporérique A présentait des interactions de charge polaire (résidus Thr118, Asn119, Thr120, Asn152 et Asn167), positive (Lys73 et Lys74) et négative (Asp75).

En outre, un inhibiteur de référence, la 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone, a également été arrimé au site actif de la protéase NS3pro et des interactions significatives ont été enregistrées. Ce complexe présente une formation de liaison hydrogène simple au niveau du résidu Phe130, tandis que His51 a été noté pour un pont salin et une interaction pi-pi avec l’inhibiteur. De plus, des interactions hydrophobes (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 et Tyr151), polaires (His51, Ser131 et Ser135) et glycine (Gly151 et Gly153) ont également été marquées dans le complexe docké.

Il a été conclu que tous les triterpénoïdes criblés présentaient une liaison hydrogène avec NS3pro au niveau de la triade catalytique (résidus His51, Asp75 et Ser135), ainsi que certains autres résidus conservés (Phe130, Tyr150, Asn152 et Gly153) qui ont été signalés comme jouant un rôle important dans la liaison du substrat pour la protéase du DENV43,44. En outre, certains résidus supplémentaires ont également été enregistrés pour partager des liaisons hydrogène avec différents ligands. Ces observations suggèrent que les liaisons hydrogène entre un ligand et l’un des résidus de la triade catalytique de NS3pro peuvent perturber le transfert d’électrons entre les groupes carboxyle et imidazole des résidus Asp75 et His51, respectivement. Une telle perturbation a été signalée comme conduisant à une attaque nucléophile avortée du groupe hydroxyle (ß-OH) du résidu Ser135, qui est essentiel pour initier l’activité protéolytique43,44. Par conséquent, il a été conclu que les triterpénoïdes criblés peuvent afficher une forte affinité envers le domaine NS3pro du DENV par le biais de diverses interactions intermoléculaires et suggéré qu’ils pourraient agir comme des médicaments contre l’infection du DENV par l’inhibition de NS2B-NS3pro.

De plus, les complexes dockés des quatre triterpénoïdes, le Ganodermanontriol, le Lucidumol A, l’acide ganodérique C2 et l’acide ganosporérique A avec la NS3pro du DENV ont également été analysés en utilisant des calculs MM/GBSA pour calculer les affinités de liaison des ligands respectifs au niveau du site actif. Ces calculs ont montré des valeurs MM/GBSA relativement négatives pour les quatre complexes dockés, c’est-à-dire NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Acide ganosporérique C2 (-19.039 kcal/mol) et NS3pro-acide ganosporérique A (-11,449 kcal/mol), tandis que le complexe inhibiteur de référence NS3pro-1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone a produit une valeur plus importante (-38,934 kcal/mol). Ces observations suggèrent que l’activité d’inhibition des triterpénoïdes sélectionnés contre la NS3pro pourrait être plus faible que celle de l’inhibiteur de référence, mais elles suggèrent également que l’affinité de liaison plus forte du Ganodermanontriol avec la NS3pro, par rapport aux autres triterpénoïdes, est soutenue par les scores prédits de docking. En outre, les valeurs ΔG prédites et les composantes physico-chimiques, c’est-à-dire, ΔGBind Coulomb, ΔGBind covalent, ΔGBind vdW (forces de van der Waals), ΔGBind Solv SA (surface accessible au solvant) et ΔGBind Solv GB (énergie de solvatation de Born généralisée), pour les triterpénoïdes sélectionnés et le contrôle positif complexés avec la protéine NS3pro du DENV indiquent que, selon le ligand, ΔGBind Coulomb et/ou ΔGBind vdW ont le plus contribué à la stabilité des complexes du triterpénoïde et de l’inhibiteur de référence avec la protéine DENV NS3pro. (Figs. 4, S2, Table S2). Par conséquent, le Ganodermanontriol a été conclu comme le triterpénoïde fonctionnel le plus prometteur pour la protéine DENV NS3pro, et analysé plus en détail avec les autres triterpénoïdes en utilisant la dynamique moléculaire et l’analyse in vitro.

Analyse de dynamique moléculaire (MD)

Les informations d’interaction prédites à partir de sur la cible-ligand calculée en utilisant l’approche de docking moléculaire peuvent être validées davantage par la simulation de dynamique moléculaire et les études cristallographiques38,41. Dans le présent document, la stabilité des complexes triterpénoïde-domaine NS3pro sélectionnés a été évaluée à l’aide d’une simulation MD de 10 ns en termes d’écart quadratique moyen (RMSD), de fluctuation quadratique moyenne (RMSF) et d’analyse de carte de contact protéine-ligand.

L’analyse RMSD des atomes C-alpha et du squelette dans le DENV NS3pro complexé avec les quatre ligands a montré des écarts stables et acceptables pendant la simulation MD de 10 ns (figure 5). Il est intéressant de noter que la fluctuation finale pour le récepteur a été enregistrée comme <2 Å RMSD tandis que l’inhibiteur Ganodermanontriol a montré une variation stable et maximale de 6 Å en complexe avec le domaine NS3pro à la fin de l’intervalle de simulation (Fig. 5a). De même, les RMSF calculés pour les résidus individuels du récepteur et les atomes du ligand ont montré des variations tolérables (moins de 2,8 Å) pendant l’intervalle de simulation (Figs. S3a, S4a). Cependant, des fluctuations RMSF insignifiantes ont également été observées pendant un intervalle de temps de 5 à 7 ns dans les groupes céto et méthyle de l’anneau cyclopenta-phenanthren-7-one du ligand (Fig. S3a).

De même, l’analyse RMSD pour le complexe NS3pro-Lucidumol A a révélé que le récepteur et le ligand présentaient tous deux des variations inférieures à 3 Å pendant l’intervalle de simulation de 10 ns (Fig. 5b). Parallèlement, l’analyse RMSF pour le complexe NS3pro et le Lucidumol A a prédit des variations <3 Å, et des écarts acceptables ont également été enregistrés au niveau du groupe méthyle et du groupe hydroxyle dans la région heptane du ligand pendant l’intervalle de simulation de 10 ns (Fig. S3b). De même, le ligand dans le complexe NS3pro-acide panodérique C2 a montré des déviations acceptables au cours de la période initiale de 2 à 5 ns, suivies par une stabilité et une déviation finale a été enregistrée à moins de 8 Å pendant l’intervalle de simulation de 10 ns (Fig. S4b).

Le complexe NS3pro-acide panodérique C2 a également présenté des déviations insignifiantes dans le récepteur entre 2 et 5 ns, suivies par une stabilité avec une variation finale enregistrée à moins de 1,75 Å pendant l’intervalle de simulation (Fig. 5c). Ces déviations acceptables dans le ligand (moins de 6 Å) et le récepteur (3 Å) ont également été soutenues par le RMSF calculé pour le complexe respectif (Figs. S3c, S4c).

En outre, l’analyse de simulation du ligand dans le complexe docked NS3pro-acide ganosporique A a présenté une déviation initialement faible pendant 6 ns dans le groupe carboxylique situé à la partie heptan du ligand initial suivi par l’acquisition d’un état stable à 4,6 Å RMSD jusqu’à la fin de l’intervalle de 10 ns (Fig. 5d). Parallèlement, NS3pro a affiché des oscillations stables autour de 1,6 Å RMSD avec des déviations insignifiantes dans la région N-terminale initiale (Fig. 5d). Ces observations suggèrent la stabilité du complexe docké respectif, comme le confirment les courbes RMSF pour les résidus individuels (moins de 3,5 Å) et les atomes (3 Å) du récepteur et du ligand, respectivement (Figs. S3d, S4d).

Une carte d’interaction protéine-ligand décrivant la contribution des résidus individuels à la liaison intermoléculaire a également été générée à partir des courbes de trajectoire de simulation (Fig. 6). La carte d’interaction protéine-ligand pour le complexe NS3pro-Ganodermanontriol a montré la participation des résidus Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 et Asn167, formant des liaisons hydrogène, des attractions hydrophobes, des interactions ioniques et des ponts d’eau (Fig. 6a). Les résidus Leu149 et Asn152 ont été mis en évidence pour avoir contribué à la formation de ponts d’eau et d’attractions par liaison hydrogène pendant l’intervalle de simulation de 10 ns (Fig. 6a). Le résidu Asn152 a également été prédit pour former des liaisons hydrogène dans le complexe de docking (Fig. 3a,b), a suggéré l’importance de ce résidu dans NS3pro pour l’interaction avec Ganodermanontriol.

La carte d’interaction NS3pro-Lucidumol A a montré la participation de His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 et Asn167 dans les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes et les ponts d’eau, avec les résidus Asp75 et Gly153 pour les plus grandes contributions dans les ponts d’eau et la formation de liaisons hydrogène, respectivement (Fig. 6b). L’analyse de docking moléculaire a également suggéré le rôle de Gly153 dans la liaison hydrogène avec le ligand (Fig. 3c,d), indiquant l’importance de ce résidu dans la stabilité protéine-ligand. En outre, les résidus Tyr161, Asp75 et Leu128 ont également été indiqués pour leurs contributions majeures dans les interactions médiées par l’eau, les liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes, respectivement, avec ce ligand (Fig. 6b). Ces résultats ont suggéré que Gly153, Tyr161, Asp75 et Leu128 étaient proéminemment responsables de la conformation stable du complexe NS3pro-Lucidumol A pendant l’intervalle de simulation.

De même, le profil d’interaction NS3pro-acide ganodérique A a montré que les résidus Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 et Asn167 ont activement contribué aux ponts d’eau, aux interactions hydrophobes et ioniques (Fig. 6d). Cependant, les résidus Lys73, Lys74, Val155 et Asn167 ont été prédits comme contribuant le plus à la stabilité de NS3pro complexé avec le ligand acide ganosporérique A via des liaisons hydrogène, suivies par des ponts d’eau, des interactions hydrophobes et ioniques (Fig. 6d). De même, l’Asn167 a été marqué comme présentant une formation de liaison hydrogène avec l’acide ganosporéique A dans le complexe ancré, révélant sa contribution significative à la stabilité du complexe. Ces résultats ont validé et suggéré la stabilité significative de chaque triterpénoïde avec le domaine NS3pro de la protéase du DENV dans les complexes ancrés. Par conséquent, il a été à nouveau suggéré que ces triterpénoïdes pourraient être utilisés dans la formulation de médicaments contre l’infection par le DENV.

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