Tulokset

Alun perin osoitimme, että sykloheksimidin antaminen pilokarpiini-SE:n induktion välittömässä läheisyydessä esti supragranulaarisen MFS:n rotilla – mutta ei estänyt myöhempää spontaanien kohtausten kehittymistä tai vaikuttanut niiden esiintymistiheyteen. Näillä tuloksilla saatiin ensimmäistä kertaa suoraa näyttöä supragranulaarisen MFS:n syy-yhteydestä ohimolohkon epileptogeneesiin. Yksi mahdollinen selitys tälle erimielisyydelle on se, että epilepsian pilokarpiini- ja kainaattimalleissa kohtausten synty voisi johtua ekstrakampuksen ulkopuolisista lähteistä. Itse asiassa talamuksen, amygdalan ja piriformisen aivokuoren suhteelliset osuudet spontaanien kohtausten käynnistymisessä näissä malleissa on osoitettu useissa tutkimuksissa.

Tämän kysymyksen käsittelemiseksi käytimme seuraavaksi kainiinihapon pientä annosta intrahippokampuksen sisällä. Tässäkin tapauksessa sykloheksimidi pystyi täysin estämään supragranulaarisen MFS:n useimmissa eläimissä muuttamatta spontaanien ictal- ja interictal-EEG-tapahtumien taajuutta ja voimakkuutta. Päättelimme, että myös intrahippokampuksen sisäisessä pienen annoksen kainaattimallissa, jossa spontaanit kohtaukset alkoivat todennäköisemmin ruiskutetussa hippokampuksessa, supragranulaarinen MFS ei ole välttämätön ictal-tapahtumien esiintymiselle.

Kun otetaan huomioon, että suurimmassa osassa analyyseistämme alkuperäisissä kokeissa arvioitiin eläimiä 2 kuukautta alkuperäisen saostavan vamman jälkeen, pyrimme sen jälkeen tutkimaan, miten spontaanit kohtaukset vaikuttaisivat supragranulaariseen MFS:ään. Jotkut tätä aihetta koskevat julkaisut ovat osoittaneet, että eläimillä, joilla on useammin kohtauksia, on voimakkaampi supragranulaarinen MFS, mikä viittaa siihen, että tämä synaptisen uudelleenjärjestelyn muoto liittyy jotenkin suurempaan taipumukseen saada kohtauksia (vaikka se ei määrittele, syntyykö kohtauksia vai ei). Toiset tutkijat ovat väittäneet, että supragranulaarisen MFS:n tiheys ei liity elinikäisten kohtausten kokonaismäärään tai kohtaustiheyteen (kokeellisessa tai ihmisen ohimolohkoepilepsiassa), ja monet kirjoittajat eivät enää pidä MFS:ää välttämättömänä tai riittävänä tapahtumana ohimolohkoepilepsiassa. Ihmistilanteessa emme kuitenkaan voi vaikuttaa kudoksen taustatilaan. Useimmissa kokeellisissa tutkimuksissa kohtausten syntyminen edellytti SE:tä – jolloin ei ole epäilystäkään siitä, etteikö supragranulaarinen MFS olisi suurelta osin edeltävän SE-episodin heijastuma. Luomalla kokeellisen tilan, jossa supragranulaarista MFS:ää ei johdettu alkuperäisestä SE-jaksosta, pystyimme tutkimaan myöhempien spontaanien kohtausten suhteellista osuutta tähän synaptiseen uudelleenjärjestelyyn. Tulimme siihen tulokseen, että supragranulaarinen MFS ei osoittanut mitään yhteyttä spontaanien kohtausten taajuuteen ja näytti riippuvan kriittisemmin ajasta alkuperäisen vamman jälkeen. Tässä tilanteessa supragranulaarinen MFS kehittyi lopulta kaikissa eläimissä, vaikkakin paljon hitaammin; lisäksi se ei näyttänyt olevan vahvempi eläimillä, joilla toistuvien spontaanien kohtausten esiintymistiheys oli suurempi.

Kuvaus granulussolujen hajanaisuudesta ohimolohkoepilepsiapotilaiden ihmiskudoksessa antoi aihetta olettaa, että kehitysmuutokset voisivat olla näiden potilaiden myöhemmän epilepsian taustalla. Se, että aikuisille jyrsijöille saattoi kehittyä granulussolujen dispersio, osoitettiin ensin pilokarpiini-rottamallissa ja myöhemmin kainaattihoitoa saaneilla hiirillä, osoitti, että nämä sytoarkitoneettiset muutokset saattoivat myös olla seurausta SE:n alkuvaiheen käynnistävästä episodista. Myöhemmin osoitettu osoitus siitä, että hammasrakkulasolujen neurogeneesi lisääntyi SE:n jälkeen, toi esiin lisämahdollisuuden – että epileptogeneesiin liittyvä hippokampusverkon plastisuus voisi johtua vasta syntyneiden hammasrakkulasolujen muodostamista poikkeavista yhteyksistä. Siksi tutkimme, vaikuttaisiko sykloheksimidi supragranulaarisen MFS:n puhkeamiseen estämällä granulussolujen neurogeneesiä. Yllätykseksemme havaitsimme, että solujen proliferaatio DG:ssä lisääntyy dramaattisesti epilepsiaa sairastavilla eläimillä, joita hoidetaan sykloheksimidillä. SE:n indusointi pelkällä pilokarpiinilla ruiskutetuissa eläimissä johti 2-7-kertaiseen lisääntymiseen dentatin granulussolujen mitoosinopeudessa verrattuna 5-30-kertaiseen lisääntymiseen pilokarpiinilla/sykloheksimidillä käsitellyissä eläimissä. Oletimme, että tällainen lisääntynyt mitoosinopeus liittyi siihen, että sykloheksimidi suojasi haavoittuvaa esisolupopulaatiota, joka muutoin rappeutuisi pilokarpiinin aiheuttaman SE:n jälkeen. Lisäksi ehdotimme, että MFS ja granulussolujen neurogeneesi eivät välttämättä liity toisiinsa. Tämä dissosiaatio on johdonmukainen sen havainnon kanssa, että pilokarpiinin aiheuttaman SE:n saaneiden eläinten säteilytys poisti olennaisesti hammasrakeisten granulussolujen neurogeneesin, mutta ei pystynyt estämään mossy-kuitujen uudelleenorganisoitumista hammasrakeisessa molekyylikerroksessa.

Kokosolujen patch-clamp-nauhoitukset hippokampuksen viipaleissa olivat osoittaneet, että spontaanien eksitoivien postsynaptisten virtojen amplitudi ja frekvenssi rakeisissa soluissoluissa kasvoivat ajan myötä kainaattihoidon jälkeen. Tämä lisääntynyt eksitatorinen synaptinen tulo korreloi Timm-värjäyksen voimakkuuden kanssa sisäisessä molekyylikerroksessa. Kun inhibitiota vähennettiin bikukuliinilla kainaattikäsiteltyjen eläinten viipaleissa, granulaattisolukerrokseen levitetyn häkkiin kytketyn glutamaatin salamavalolyysi aiheutti epileptiformisia toimintapotentiaalipurkauksia (tätä vaikutusta ei havaittu kontrollirottien granulaattisoluissa). Nämä tiedot tukivat hypoteesia, jonka mukaan kainaatin aiheuttama supragranulaarinen MFS johtaa asteittaiseen poikkeavien heräteyhteyksien muodostumiseen granulussolujen välille. Sykloheksimidihoidon aiheuttamien elektrofysiologisen profiilin muutosten arvioimiseksi suoritettiin in vitro -elektrofysiologiaa (solunulkoiset rekisteröinnit) 2 kuukautta pilokarpiinin aiheuttaman SE:n jälkeen. Pilokarpiinilla ja pilokarpiinilla/sykloheksimidillä käsiteltyjen rottien viipaleissa havaittiin pienen amplitudin polyspiking-aktiivisuutta (epileptiformisia vasteita) CA1:ssä ja ilmeisesti normaalia eristettyä populaatiopiikkiä DG:ssä. Vielä tärkeämpää on, että pilokarpiini- ja pilokarpiini-/sykloheksimidi-eläinten viipaleiden DG ei eronnut toisistaan elektrofysiologisten poikkeavuuksien suhteen edes korkeassa K+- tai korkeassa K+/bikukliinipitoisuudessa. Neo-Timm-värjäyksen analyysi paljasti odotetusti voimakkaan supragranulaarisen MFS:n pilokarpiini-injektion saaneilla rotilla ja huomattavasti pienemmän värjäyksen pilokarpiini/sykloheksimidi-rotilla. Siten epänormaalien ärsykevasteiden esiintyminen ja korkean K+- tai korkean K+/bikukliinin aiheuttamat epileptiformiset aktiviteetit eivät riippuneet supragranulaarisen MFS:n asteesta.

Yksi pitkään esillä olleista kysymyksistä, jotka koskevat MFS:n kehittymistä SE:n eläinmalleissa, on se, lisäävätkö itäneet sammaloituneet mossy- eli sammaloidiset kuidut molekyylikerroksen dendriittejä uusilla synapseilla, – vai korvasivatko nuo itävät kuidut yksinkertaisesti tyhjentyneitä synapseja (jotka ovat seurausta hilasolujen rappeutumisesta). Useimmissa aihetta koskevissa tutkimuksissa ehdotettiinkin, että hilaristen sammalsolujen häviäminen, joka on tavallisesti granulussolujen sammaloituneiden kuitujen tärkein hilarinen kohde, olisi tärkeä tekijä supragranulaarisen MFS:n käynnistymisessä. Pilokarpiinin aiheuttama SE sykloheksimidin läsnäollessa johti loukkaantuneiden hilarisolujen määrän vähenemiseen verrattuna rottiin, joita ei esikäsitelty sykloheksimidillä. Oletetut mossy-solut, jotka tunnistettiin kalsitoniinigeeniin liittyvällä peptidillä (CGRP) immunohistokemiallisesti, eivät vähentyneet merkittävästi kummassakaan ryhmässä 60 päivää SE:n jälkeen (kun otetaan huomioon tämän havainnon näennäinen epäjohdonmukaisuus mossy-solujen SE:n häviämistä osoittavien todisteiden ylivoimaisen enemmistön kanssa, oletamme, että CGRP saattaa olla mossy-solujen osapopulaation merkkiaine). Kun kontrolleissa oli voimakas CGRP-positiivisten kuitujen kaistale (oletetut mossy-solujen aksonit) eikä sisemmässä molekyylikerroksessa ollut neo-Timm-värjäytyneitä kuituja, pilokarpiinilla käsitellyillä rotilla ei ollut CGRP-kuituja eikä voimakasta neo-Timm-värjäytymistä. Sykloheksimidi-pilokarpiinilla käsitellyillä eläimillä sen sijaan oli CGRP- ja neo-Timm-värjäytyminen samanlaista kuin kontrolleissa. Päättelimme, että sykloheksimidi voi suojella hilan CGRP-positiivisia soluja SE:n aikana; sallimalla näiden solujen säilyttää normaalin aksoniprojektionsa, MFS estettiin – skenaario, joka on yhdenmukainen ”ärtyvän” mossy-soluhypoteesin kanssa, joka perustuu mossy-solujen eloonjäämiseen verkon yliherkistettävyyden vuoksi. Ehdotimme, että sykloheksimidi estää SE:n aiheuttaman supragranulaarisen MFS:n estämällä hilan CGRP-positiivisten solujen (oletettujen mossy-solujen) häviämisen.

Sekä se, että sykloheksimidi suojasi hilasoluja ja lisäsi edelleen solujen proliferaatiota DG:ssä SE:n jälkeen, loi puitteet nykyiset havainnot yhdistävälle hypoteesille. Tutkijat ovat osoittaneet, että jotkut vastasyntyneet granulussolut kehittyvät poikkeaviin paikkoihin hiluksen sisällä. Nämä ektooppiset granulussolut osoittavat säännöllisiä toimintapotentiaalien purkauksia, jotka ovat synkronoituja CA3-pyramidisolujen purkauspurkausten ja hilaneuroneiden (mukaan lukien mössösolut) purkausten kanssa. Ektooppisten hilan granulussolujen muodostumisen lisäksi useissa artikkeleissa luonnehdittiin hilan basaalisten dendriittien muodostumista granulussoluihin epilepsiaa sairastavilla eläimillä. Molemmat piirteet mahdollistavat varmasti poikkeavat synapsit hiluksessa, joko ektooppisten tai ärsytettävien solujen tai poikkeavien basaalisten dendriittien kautta, mikä voi selittää muutokset yliherkistyvyydessä – riippumatta supragranulaarisen MFS:n esiintymisestä.