Promoottorit ohjaavat RNA-polymeraasin ja transkriptiotekijöiden sitoutumista. Koska promoottorialue ohjaa kohdegeenin transkriptiota, se määrittää näin ollen geenin ilmentymisen ajoituksen ja määrittelee pitkälti tuotettavan rekombinanttiproteiinin määrän. Monet yleiset promoottorit, kuten CMV-, EF1A- ja SV40-promoottorit, ovat aina aktiivisia, joten niitä kutsutaan konstitutiivisiksi promoottoreiksi. Toiset ovat aktiivisia vain tietyissä olosuhteissa. Tässä postauksessa keskustelemme indusoituvista promoottoreista, jotka voidaan kytkeä OFF-tilasta ON-tilaan, ja siitä, miten voit käyttää niitä tutkimuksessasi. Kun olet lukenut tämän postauksen, tutustu jatkopostaukseemme, joka käsittelee repressiivisiä promoottoreita.

Miten indusoituvia promoottoreita säädellään?

Indusoituvia promoottoreita voidaan säädellä positiivisella tai negatiivisella kontrollilla.

Positiivinen indusoituva

Off-tilassa promoottori on inaktiivinen, koska aktivaattoriproteiini ei voi sitoutua. Kun induktori sitoutuu aktivaattoriproteiiniin, aktivaattoriproteiini voi sitoutua promoottoriin, jolloin se kytkeytyy PÄÄLLE ja transkriptio käynnistyy.

Negatiivisesti indusoituva

Pois päältä (OFF) -tilassa promoottori on inaktiivinen, koska siihen sitoutunut repressoriproteiini estää transkriptiota aktiivisesti. Kun induktori sitoutuu repressoriproteiiniin, repressoriproteiini poistuu DNA:sta. Kun repressoriproteiinia ei ole, transkriptio kytkeytyy päälle.

Indusoituvien promoottorien tyypit

Kemialliset aineet, lämpötila ja valo ovat kaikki esimerkkejä tekijöistä, jotka voivat johtaa promoottorin indusoitumiseen. Alla on lyhyt kuvaus näistä kolmesta indusoituvien promoottorien tyypistä ja esimerkkejä kustakin tyypistä. Monet näistä promoottorijärjestelmistä ovat saatavilla Addgenessä!

Kemiallisesti indusoituvat promoottorit

Kemiallisesti säädellyt promoottorit ovat yleisimpiä indusoituvia promoottoreita. Positiivisesti indusoituva tetrasykliini ON (Tet-On) -järjestelmä, joka on monipuolinen työkalu, joka on kehitetty käytettäväksi prokaryooteissa ja eukaryooteissa, toimii suoran aktivoinnin kautta. Tässä järjestelmässä aktivaattori rtTA (käänteinen tetrasykliiniohjattu transaktivaattori) on normaalisti inaktiivinen eikä voi sitoutua promoottorin tetrasykliinivaste-elementteihin (TRE). Tetrasykliini ja sen johdannaiset toimivat indusoivina aineina, jotka mahdollistavat promoottorin aktivoitumisen.

Yksi yleisimmin käytetyistä prokaryoottisista promoottoreista on negatiivisesti indusoituva pLac-promoottori. Tämä promoottori edellyttää lac-repressorin (lacI-proteiini) poistamista, jotta transkriptio aktivoituisi. Laktoosin tai laktoosianalogin IPTG:n läsnä ollessa lac-repressori kokee konformaatiomuutoksen, joka poistaa sen promoottorin lacO-kohdista ja lopettaa kohdegeenin repression. Yksinkertaistettu lac-indusoituva järjestelmä löytyy monista bakteerien ekspressiovektoreista.

Negatiivinen indusoituva promoottori pBad on toinen suosittu prokaryoottinen promoottori, jota käytetään usein bakteeriproteiinien puhdistukseen. Kun arabinoosia ei ole, säätelyproteiini AraC sitoutuu O- ja I1-kohtiin pBadin ylävirtaan ja estää transkription. Arabinoosin lisääminen saa AraC:n sitoutumaan I1- ja I2-kohtiin, jolloin transkriptio voi alkaa. Arabinoosin lisäksi myös cAMP, joka on kompleksissa cAMP-aktivaattoriproteiinin (CAP) kanssa, voi stimuloida AraC:n sitoutumista I1- ja I2-kohtiin. Solujen kasvualustan täydentäminen glukoosilla vähentää cAMP:ia ja repressoi pBad:ia, mikä vähentää promoottorin vuotoa.

Muita esimerkkejä kemiallisesti indusoituneista promoottoreista ovat esimerkiksi positiivisesti indusoituvat alkoholin ja steroidien säätelemät promoottorit, joita käytetään yleisesti kasvintutkimuksessa.

Promoottorin alatyyppi	Promoottorin esimerkki	Aktivaattori	Addgene Plasmid/Kit
Alkohol-.regulated	AlcA-promoottori	AlcR	pGGA008 (AlcA) ja pGGC011 (AlcR) red flame GreenGate kitistä
Steroidi-säädelty	LexA-promoottori	XVE (synteettinen)	pFZ19 (Keltainen liekki)

Lämpötilan indusoimat promoottorit

Lämpötilan vaikutuksesta herkät ilmentymisjärjestelmät ovat tyypillisesti vähemmän vuotavia kuin kemiallisesti indusoidut promoottorit; ne osoittavat lähes nollaekspressiota tavanomaisissa lämpötiloissa, mutta ne voidaan indusoida lämpö- tai kylmäaltistuksella. Esimerkkeinä voidaan mainita lämpöshokkiin indusoituvat Hsp70- tai Hsp90-alkuiset promoottorit, joissa haluttu geeni ilmentyy vain lyhytaikaisen lämpöshokkialtistuksen jälkeen. Hsp70:n tapauksessa lämpöshokki vapauttaa lämpöshokkitekijä 1:n (HSF-1), joka sitten sitoutuu promoottorin lämpöshokkielementteihin ja aktivoi transkription. Addgenen tallettajat ovat kehittäneet lämpöshokkiin indusoituvia Cre- ja Cas9-ohjelmia helpon genomitekniikan mahdollistamiseksi lajeissa, kuten C. elegansissa ja Drosophilassa.

Valolla indusoituvat promoottorit

Valo on toinen tapa aktivoida geeniekspressiota, ja synteettisessä biologiassa käytetyt kaksikomponenttiset systeemit hyödyntävät valoa transkription säätelyyn. Punaisen liekin plasmidi pDawn sisältää sinistä valoa aistivan proteiinin YFI. Kun valoa ei ole, YFI fosforyloi FixJ:n, joka sitoutuu FixK2-promoottoriin indusoidakseen faagin repressori cI:n transkription. Repressori cI estää transkription faagipromoottorista pR, mikä estää reportterigeenin ilmentymisen. Valon ollessa läsnä YFI on inaktiivinen, mikä estää repressori cI:n synteesin ja mahdollistaa reporterigeenin transkription. Addgenellä on myös Taborin laboratorion suunnittelemia keltaisen liekkivalon säätelemiä kaksikomponenttisia järjestelmiä.

Mikä indusoituva promoottori sopii minulle?

Tässä on luettelo eräistä tärkeistä muuttujista, jotka on otettava huomioon valittaessa indusoituvaa promoottoria.

Kokeellinen systeemi

Koska transkriptiokoneisto eroaa solutyypeittäin tai eri organismien välillä, promoottoritkin ovat yhtä lailla muuttuvia. Bakteeripromoottorit toimivat vain prokaryoottisoluissa ja tyypillisesti vain samassa tai läheisessä sukulaislajissa, josta ne ovat peräisin. Vastaavasti erilaiset eukaryoottiset solutyypit (nisäkäs, hiiva, kasvit jne.) vaativat yksilöllisiä promoottoreita, ja risteytyminen on hyvin vähäistä. Induktiomekanismin on myös oltava yhteensopiva koejärjestelmäsi kanssa.

Vuotavuus

Jos olet ilmentämässä geeniä, joka voi olla myrkyllinen, on tärkeää, että indusoituva promoottori ei ole liian vuotava. Indusoitavissa prokaryoottisissa promoottoreissa pLac on tunnetusti hieman vuotava, ja pBad on todennäköisesti parempi vaihtoehto, koska glukoosi voi tukahduttaa ilmentymisen. Lämpötilaindusoituvat promoottorit tunnetaan myös vähäisestä vuotavuudestaan.

Indusoituvuustaso

Miten paljon haluat indusoida kohdegeenisi transkriptiota? Indusoituvien promoottorien vahvuus voi vaihdella paljon. Jos etsit korkeaa indusoituvuutta, Tet-On-järjestelmä voi olla hyvä valinta, sillä sen on dokumentoitu indusoivan transkriptiota >1 000-kertaisesti aktivoituna.

Lag-aika

Tietyn promoottorin indusoimiseen tarvittava aika vaihtelee. Promoottorit, jotka vaativat vain ulkoisen induktorin lisäämisen, kuten Tet-järjestelmät, voivat aktivoitua hyvin nopeasti. Sitä vastoin promoottorijärjestelmillä, jotka vaativat repressorin/induktorin transkriptiota, on suurempi viiveaika transkriptioon/translaatioon tarvittavan ajan vuoksi.

Monet kiitokset Nicole Zurcherille, joka osallistui tämän artikkelin kirjoittamiseen.

Lisälähteitä Addgene-blogista:

• Plasmidit 101: Promoottorialue
• Plasmidit 101: Cre-lox
• Valokytkettävät kaksikomponenttiset järjestelmät E. coli -bakteereille
• Selaa muita blogikirjoituksia Plasmidit 101 -sarjamme blogikirjoituksista