- Abstract
- Esittely
- Hiiren sukulinjan mutageenistäminen
- Sairausmallien eristäminen ENU:n avulla
- Suuren mittakaavan seuloja
- Pienimuotoiset seulonnat
- Geenilähtöisten ja fenotyyppilähtöisten lähestymistapojen yhdistäminen
- Pistemutaatioiden tunnistaminen
- Tautien fenotyyppien seulonta
- Mutaatiohiirien resurssien luominen
- Geneettiset resurssit
- arkistointi
- Tietokannat
- Jakelu
- Tulevaisuus näyttää valoisalta
- Kiitokset
Abstract
Ihmisen genomin sekvensoinnin edistyminen edistää geneettisiä lähestymistapoja geenien toiminnan määrittämiseksi. Geenipyydysten ja kemiallisen mutageneesin kaltaiset strategiat tuottavat pian laajan mutanttisten hiirten resurssin. N -etyyli-N -nitrosourean (ENU) indusoimat pistemutaatiot tarjoavat ainutlaatuisen mutanttiresurssin, koska ne: (i) heijastavat yksittäisen geenimuutoksen seurauksia riippumatta sijaintivaikutuksista; (ii) mahdollistavat proteiinien toiminnan hienorakenteisen läpileikkauksen; (iii) osoittavat erilaisia mutanttivaikutuksia täydellisestä tai osittaisesta toimintakadosta liioiteltuun toimintaan; ja (iv) paljastavat geenien toimintoja puolueettomalla tavalla. Hiiren fenotyyppilähtöisissä ENU-seulonnoissa korostetaan merkitystä ihmisen kliinisten sairauksien kannalta kohdistamalla ne kardiologiaan, fysiologiaan, neurologiaan, immuniteettiin, hematopoieesiin ja nisäkkäiden kehitykseen. Tällaiset lähestymistavat ovat erittäin tehokkaita ihmisen monimutkaisten sairauksien ja ominaisuuksien ymmärtämisessä: emäsparimuutokset voivat mallintaa tarkasti ihmisen sairauksissa esiintyviä emäsmuutoksia, ja hienovaraiset mutanttialleelit tavanomaisella geneettisellä taustalla antavat mahdollisuuden analysoida yhdistettyjen genotyyppien seurauksia. Käynnissä olevat hiirten ENU-mutageenikokeet tuottavat uusien mutaatioiden aarreaittoja, joiden avulla voidaan tutkia syvällisesti yksittäistä geeniä, kromosomialuetta tai biologista järjestelmää.
Esittely
Manipulatiiviset geneettiset työkalut hiiressä ovat laajoja ja tehokkaita. Hiirigeneetikot voivat eliminoida tai yliekspressoida geenejä koko eläimessä tai tietyssä kudoksessa, lisätä genomiin suuria paloja omaa tai vierasta DNA:ta ja muokata kokonaisia kromosomeja. Nämä tekniikat yhdistettynä hiiren ja ihmisen geneettisiin, kehitykseen liittyviin, patologisiin ja fysiologisiin yhtäläisyyksiin ovat vakiinnuttaneet laboratoriohiiren ensisijaiseksi malliorganismiksi ihmisen sairauksien tutkimuksessa. Sisäsiittoiset hiirikannat tarjoavat mahdollisuuden tutkia sairauden ominaisuutta määritellyllä geneettisellä taustalla, jolloin voidaan erottaa toisistaan yksittäisen mutaation aiheuttamat fenotyypit ja muiden geneettisten muuttajien vaikutus.
Kyky luoda toimintakyvyn menetysmutaatioita homologisella rekombinaatiolla alkion kantasoluissa johti vallankumoukseen hiiren biologiassa. Alkion kantasoluteknologian avulla voidaan häiritä mitä tahansa ihmisen sairauteen liittyvää geeniä, mikä antaa arvokasta tietoa mutaation seurauksista koko eläimessä. Vaikka nollamutaatiot ovat välttämättömiä, N -etyyli-N -nitrosourean (ENU) aiheuttamat hienovaraiset mutaatiot ovat korvaamattomia, kun tutkitaan geenien toiminnan koko kirjoa. Koodaavien alueiden ja säätelyelementtien mutaatiot voivat johtaa hyvin erilaisiin fenotyyppeihin, ja samalla ne mahdollistavat proteiinien toiminnan ja geenien säätelyn hienorakenteisen tarkastelun. Alleleiden sarjoja voidaan tuottaa homologisella rekombinaatiolla, mutta fenotyyppilähtöinen mutageneesi tarjoaa monia etuja, koska se nopeuttaa tuottamista ja poistaa tutkijan ennakkoluulot. Siksi hiiren genomin knockout-tietokantaa olisi pidettävä vain lähtökohtana; funktionaalisen analyysin loppuunsaattaminen edellyttää lisää alleeleja ja kudospesifisyyksiä.
Hiiren sukulinjan mutageenistäminen
ENU voi siirtää etyyliryhmänsä happi- tai typpiradikaaleihin DNA:ssa, jolloin syntyy vääränlaista parinmuodostusta ja emäsparien korvautumista, jos sitä ei korjata. Suurimmat mutaatioluvut esiintyvät premeioottisissa spermatogoniaalisissa kantasoluissa, joissa yksittäisen lokuksen mutaatiotaajuudet ovat 6-1,5 × 10 -3 ( 1-3 ), mikä vastaa mutaation saamista yksittäiseen valittuun geeniin yhdessä jokaista 175-655:tä seulottua sukusolua kohden. Koska ENU:n avulla voidaan eristää mutaatioita missä tahansa kiinnostavassa geenissä tai alueella, sitä on käytetty hiirissä: (i) saada yksittäisten geenien multiallelisia sarjoja toiminnan tarkemmaksi määrittelemiseksi, (ii) selvittää biokemiallisia tai kehityspolkuja, (iii) saada uusia resessiivisiä mutaatioita yhdestä kromosomista tai koko genomista ja (iv) tyydyttää hiiren genomin alueita, jotka ovat jääneet deletioiden ulkopuolelle ( 4-10 ). Analyysi 62:sta sekvensoidusta sukusolumutaatiosta 24 geenistä paljastaa, että ENU muuttaa pääasiassa A/T-emäspareja: 44 % A/T→T/A-siirtymiä, 38 % A/T→G/C-siirtymiä, 8 % G/C →A/T-siirtymiä, 3 % G/C→C/G-siirtymiä, 5 % A/T→C/G-siirtymiä ja 2 % G/C→T/A-siirtymiä ( taulukko 1 ; kuva 1 ). Kun nämä muutokset käännetään proteiinituotteeksi, ne johtavat 64 %:ssa missense-mutaatioihin, 10 %:ssa nonsense-mutaatioihin ja 26 %:ssa splikointivirheisiin ( taulukko 1 ; kuva 1 ).
Koska ENU on pistemutaageeni, se voi indusoida monia erityyppisiä alleeleja. Toimintakyvyn menetysmutaatioita, letaalisten komplementtiryhmien elinkelpoisia hypomorfeja, antimorfeja ja toimintakyvyn lisäysmutaatioita on eristetty hiirten mutageeniseuloissa ( 4 , 9-16 ). Yksittäisten lokusten alleelien sarjat ovat erittäin tehokkaita, kun niitä analysoidaan yhdessä toiminnan määrittelemiseksi. Monimutkaisten lokusten alleelisarjat voivat häiritä yksittäisiä proteiinien isoformeja, mikä johtaa erilaisten toimintojen löytämiseen eri kudoksissa koko organismin elämän ajan ( 17 ). Silmiinpistävä esimerkki tällaisesta alleelisarjasta on quaking ( qk ) -lokus. Ennen ENU:n aiheuttamien alleelien eristämistä quaking-lokus määriteltiin yhdellä spontaanilla alleelilla, qkV , jonka homotsygoottinen fenotyyppi oli kouristuskohtauksia ja vapinaa, joka johtui vakavasta keskushermoston (CNS) dysmyelinaatiosta ( 18 ). ENU:n indusoimat alleelit paljastavat kuitenkin, että quaking toimii myös alkionkehityksen aikana ( 7 , 13 ). Neljä viidestä ENU:n aiheuttamasta alleelista ( qk1-1 , qkkt1 , qkkt2 , qkkt3/4 ) homotsygootit kuolevat alkion päivinä (E) 8,5-10,5 CNS-vaurioihin, kun taas vain yksi on elinkelpoinen, ja sillä on vapinaa ja kouristuskohtauksia ( qke5 ) (19; J. K. Noveroske ja M. J. Justice, julkaisemattomat tiedot). Vaikka quaking-alleelit voidaan ryhmitellä alkion letaliteetin tai elinkelpoisen dysmyelinaation perusteella, jokainen alleeli poikkeaa jollakin merkittävällä tavalla näistä yleisistä fenotyypeistä, mikä tekee siitä ainutlaatuisen ja arvokkaan resurssin hienorakenne/toimintatutkimuksiin ja ihmisen hermostoputken vikojen sekä kouristuskohtausten ja myelinaatiohäiriöiden mallintamiseen ( taulukko 2 ). ENU:lla tai geenien kohdentamisella muihin monimutkaisiin lokuksiin luodut alleelisarjat ovat arvokkaita välineitä proteiinien toiminnan selvittämiseksi ( 17 ).
Yhteenveto sekvensoiduista ENU:n aiheuttamista mutaatioista
Yhteenveto sekvensoiduista ENU-indusoidut mutaatiot
ENU-mutageneesi mutaatioiden eristämiseksi. ENU aiheuttaa hiiren spermatogonien kantasolujen DNA:ssa vaurioita, jotka vaikuttavat pääasiassa AT-emäspareihin. Nämä vauriot esiintyvät uroksen siittiöissä, ja kun ne on eristetty geneettisten ja fenotyyppisten seulojen avulla, ne synnyttävät erilaisia fenotyyppisiä mutaatioita. Mutaatioproteiinituotteet ovat pääasiassa missense-mutaatioita, jotka ovat arvokas mutaatioluokka proteiinien rakenteen ja toiminnan selvittämiseksi. Hiirellä tehtävässä mutageneesissä korostuu ihmisen sairauksien mallintaminen fenotyyppilähtöisten määritysten avulla.
ENU-mutageneesi mutaatioiden eristämiseksi. ENU aiheuttaa hiiren spermatogonien kantasolujen DNA:ssa vaurioita, jotka vaikuttavat pääasiassa AT-emäspareihin. Nämä vauriot esiintyvät uroksen siittiöissä, ja kun ne on eristetty geneettisten ja fenotyyppisten seulojen avulla, ne synnyttävät erilaisia fenotyyppisiä mutaatioita. Mutaatioproteiinituotteet ovat pääasiassa missense-mutaatioita, jotka ovat arvokas mutaatioluokka proteiinien rakenteen ja toiminnan selvittämiseksi. Hiirellä tehtävässä mutageneesissä korostuu ihmisen sairauksien mallintaminen fenotyyppilähtöisten määritysten avulla.
Sairausmallien eristäminen ENU:n avulla
Enun aiheuttamien mutaatioiden eristämiseen voidaan käyttää erilaisia geneettisiä seuloja. Yhden sukupolven seulalla voidaan nopeasti tuottaa elinkelpoisia ja hedelmällisiä mutaatioita, jotka edustavat alleelisarjoja, modifioivia tai dominoivia mutaatioita. Kahden sukupolven deletointiruuduilla voidaan tunnistaa resessiivisiä tappavia mutaatioita genomin määritellyllä alueella. Kolmen sukupolven polveutumisseuloja voidaan käyttää koko genomin skannaamiseen kiinnostavan elinkelpoisen mutaation löytämiseksi tai yhdistettynä linkitettyihin markkereihin tai tasapainottaviin kromosomeihin letaalien tai steriilien alleelien eristämiseksi (ks. jäljempänä).
Suuren mittakaavan seuloja
Useita suuren mittakaavan mutaatioseuloja on jo rahoitettu kansainvälisesti. Näiden seulontojen pääpiirteet on esitetty taulukossa 3 . Jokaisessa näistä seuloista käytetään erilaista geneettistä strategiaa mutaatioiden eristämiseksi: jotkin seulat kohdistuvat dominoiviin mutaatioihin, kun taas toiset on suunniteltu eristämään resessiivisiä mutaatioita. Jotkut ryhmät seulovat resessiivisiä tappavia ja haitallisia mutaatioita alueellisella mutageneesillä geenien toiminnan selvittämiseksi rinnakkain ihmisen geeniperimähankkeen kanssa. Toiset ryhmät tutkivat suuria määriä mutagenisoituja genomeja dominoivien neurologisten ja kliinisten hematologisten tai biokemiallisten varianttien löytämiseksi.
Pienimuotoiset seulonnat
Mutaatioiden seulontaa ei tarvitse tehdä suuressa mittakaavassa. Kaksi kustannustehokasta strategiaa pienelle laboratoriolle ovat alleelisarjat ja herkistetyt reittiseulat. Herkistetyn reitin seulonta kohdistuu yhteen biologiseen tai biokemialliseen reittiin, ja siinä hyödynnetään ei-allelista ei-komplementoitumista mutaatioiden eristämiseksi mutageenisten urosten ensimmäisen sukupolven jälkeläisistä. Tällaisessa seulassa indusoitu mutaatio (*) lokuksessa, joka on vuorovaikutuksessa kiinnostavan lokuksen ( m ) kanssa, voi epäonnistua komplementoinnissa (*/+;+/ m ), mutta tuottaa kuitenkin alkuperäistä homotsygoottista mutanttia muistuttavan fenotyypin ( m/m ). Jotkin herkistetyt seulonnat voidaan suorittaa geneettisen muutoksen sijasta lääkkeen tai ympäristömuutoksen taustalla. Esimerkiksi käyttämällä fenyylialaniini-injektiota herkistävänä aineena eristettiin heterotsygoottina useita fenyylialaniinin aineenvaihduntareittiin vaikuttavia mutaatioita ( 20 , 21 ).
Geenilähtöisten ja fenotyyppilähtöisten lähestymistapojen yhdistäminen
Ainutlaatuinen lähestymistapa mutaatioiden eristämiseen yhdistää geenilähtöisen kohdentamisen alkion kantasoluissa ja fenotyyppilähtöisen ENU-mutageneesin. Tehokkaat geneettiset strategiat Drosofiassa perustuvat geneettisten reagenssien, kuten deleetioiden, duplikaatioiden ja inversioiden saatavuuteen, jotka helpottavat geneettisiä seulontoja ja tarjoavat yksinkertaisen ja kustannustehokkaan kannan ylläpidon. Deletiot ovat hyödyllisiä haploidian tuottamisessa geneettisissä seuloissa sekä kartoituksessa, jossa käytetään ei-komplementtistrategioita ( kuva 2 B) ( 22 ). Inversiot, jotka kantavat dominoivaa merkkiainetta ja ovat homotsygoottisesti letaaleja, ovat ihanteellisia tasapainokromosomeja rekombinaation tukahduttamiseksi ja jälkeläisluokkien tunnistamiseksi helposti letaalien tai haitallisten mutaatioiden eristämistä ja ylläpitoa varten ( kuva 2 C). Kyky muokata kokonaisia kromosomialueita Cre/loxP-tekniikoiden avulla mahdollistaa näiden geneettisten reagenssien luomisen kaksivaiheisessa geenin kohdentamisprosessissa ( Kuva 2 A) ( 23 , 24 ). Lähestymistapa on geenipohjainen, koska deletion tai inversion päätepisteet ovat tiedossa, mikä minimoi uudelleenjärjestelyjen karakterisointiin tarvittavan työmäärän. Muokkaustekniikat mahdollistavat sen, että uudelleenjärjestelyt voidaan merkitä dominoivalla keltaisella karvapeitteen värin merkkiaineella, K-14 agoutilla , joka tarjoaa resurssin yksinkertaiseen kartoitukseen, kannan ylläpitoon ja geneettisiin seulontoihin ( 22 , 24 , 25 ). Kohdistustapahtumiin tarvittavia konstruktioita sisältävien hiiren genomikirjastojen luominen tarjoaa nopean järjestelmän niiden tuottamiseksi missä tahansa hiiren genomissa ( kuva 2 A) ( 25 ).
Vakioalleleiden erityispiirteet
Vakioalleleiden erityispiirteet
Funded large-scale ENU screens
An initial mutagenesis effort, jonka tarkoituksena on eristää resessiivisiä mutaatioita useista fenotyyppiluokista, kohdistuu hiiren kromosomiin 11, joka on geenirikas kromosomi, joka on hyvin konservoitunut ihmisen kromosomin 17 kanssa. Tavoitteena on kyllästää kromosomi mutaatioilla geenien toiminnan määrittelemiseksi, minkä jälkeen hiiren ja ihmisen välisen linkityskonservaation avulla voidaan ennustaa geenien toimintaa ihmisessä. Cre/loxP-tekniikalla tuotettujen geneettisten reagenssien avulla toteutetaan kaksi mutageenisointisuunnitelmaa: kahden sukupolven deleetioiden sukutaulut ( kuva 2 B) ja kolmen sukupolven sukutaulut, joissa käytetään tasapainottavia kromosomeja ( kuva 2 C). Molemmissa järjestelmissä hyödynnetään K14-agouti-transgeenin antamaa keltaista turkin väriä. Deleetiojärjestelyä voidaan käyttää vain suuriin deleetioihin, jotka eivät ole haitallisia eläimelle, jolloin seulonta rajoittuu tiettyihin alueisiin, mutta mutaatiot voidaan eristää vain kahdessa sukupolvessa. Inversiojärjestelmän avulla voidaan seuloa suurempi osa kromosomista mutaatioiden varalta, mutta se vaatii kolmen sukupolven jalostuksen.
Pistemutaatioiden tunnistaminen
Jotta uudet mutaatiot olisivat arvokkaita, ne on paikannettava, jotta kandidaattigeenit ja asiaankuuluvat ihmisen tautimallit voidaan tunnistaa. Fenotyypin perusteella eristetyt pistemutaatiot on kartoitettava fenotyyppitiedon avulla, koska molekyylitunnistetta ei ole saatavilla. Perinteisesti nämä mutaatiot kartoitetaan meioottisissa takaristeytyksissä, joissa fenotyyppi segregoituu suhteessa useisiin molekulaarisiin polymorfismeihin (katsaus ks. viite 26 ). Kartoittaminen 10 cM:n tarkkuudella edellyttää 100 meioosin analysointia. Näin ollen 100 uutta mutaatiota, jotka on eristetty koko genomin laajuisesti, edellyttäisi 10 000 hiiren analysointia. Korkean resoluution kartoitusstrategiat positionaalista kloonausta varten edellyttävät yleensä 1000-2000 meioosin analysointia mutaatiota kohti. Missä tahansa ENU-seulassa voidaan eristää lukuisia dominoivia ja resessiivisiä mutaatioita, mikä tekee kartoituksesta prosessin pullonkaulan ja edellyttää yksinkertaisempia kartoitustekniikoita, kuten DNA:n yhdistämistä ( 27 ). Edellä kuvatut karvavärillä merkityt seulat ovat ainutlaatuisia siinä mielessä, että mutaatio eristetään näkyviin kromosomimerkkeihin kytkettynä, joten sen kromosomipaikkakunta on tiedossa eristyksen yhteydessä, jolloin meioottista kartoitusta ei tarvita. Lisäksi Cre/loxP:n tuottamia deletioita voidaan käyttää mutaatioiden lokalisoimiseen subkromosomaaliselle alueelle ei-komplementaation avulla ( 22 , 28 ). Koska hiiren genomin sekvenssi on pian saatavilla, monet mutaatiot voidaan lokalisoinnin jälkeen kohdistaa geeneihin sijaintiehdokkuuden perusteella. Lisäksi BAC-komplementointia voidaan käyttää mutaatio-geenikorrelaatioiden tunnistamiseen ( 29 ).
( A ) Kromosomien uudelleenjärjestelyjen tuottaminen Cre /loxP:n avulla . On rakennettu kaksi lambda-hiiren genomikirjastoa, jotka sisältävät valikoivia markkereita, joita tarvitaan kaksivaiheisiin kohdentamistapahtumiin. Toinen sisältää selektiivisen merkkiaineen neomysiini ( Neo ), hypoksantiini-fosforibosyylitransferaasin ( Hprt ) 5′-pään, loxP-kohdan ja tyrosinaasin minigeenin ( Ty ). Toinen kirjasto sisältää valikoivan merkkiaineen puromysiini ( Puro ), Hpr:n 3′-pään, loxP-kohdan ja K14-Agouti-transgeenin ( Ag ). Jos loxP-kohdat on sijoitettu cis:ssä samaan orientaatioon, rekombinaatio Cref-transektion jälkeen tuottaa deletion ja HAT-resistenttejä, Puro-herkkiä ja Neo-herkkiä ES-soluja. Jos loxP-kohdat on asetettu vastakkaiseen orientaatioon, rekombinaatio Cre-transektion jälkeen johtaa inversioon, jolloin saadaan HAT-resistenttejä, Puro-resistenttejä, Neo-resistenttejä ES-soluja. (B ja C) Hiiren kromosomin 11 mutageneesisuunnitelmat, joissa käytetään keltaisella karvavärillä merkittyjä kromosomien uudelleenjärjestelyjä. Deleetio tai inversio on merkitty dominoivalla keltaisella karvavärimerkillä, K-14-agouti (keltainen). Jokaisessa skeemassa käytetään Chr 11:n dominoivaa Rex ( Re , ja merkitty mustalla kromosomilla) -mutaatiota, joka aiheuttaa kiharan turkin (pilkullinen). Jokaisessa järjestelmässä villityypin uroksille (C57BL/6J, musta) ruiskutetaan 3 × 100 mg/kg ENU-annosta. (B) Deleetiojärjestelmä. Kun hedelmällisyys on palautunut, ENU-käsitellyt urokset paritetaan homotsygoottisten Re/Re-naaraiden kanssa. Re-mutaatio merkitsee kromosomia, joka ei ole mutageeninen, sillä varoituksella, että rekombinaatiota voi tapahtua uuden linkitetyn mutaation ja Re:n välillä. G1-eläimet, jotka ovat heterotsygootteja ENU-mutageenisten kromosomien ja Re:n suhteen, paritetaan hiirillä, jotka ovat hemotsygootteja keltaisella merkillä varustetun deletion suhteen. Tuloksena syntyvät jälkeläisluokat voidaan helposti tunnistaa: (i) mutanttiluokka on keltainen ja suorakarvainen, ja jos se puuttuu, se osoittaa tappavan mutaation todennäköisyyden; (ii) kantajaluokka, joka on villityyppinen ja jota voidaan käyttää mahdollisten tappavien mutaatioiden palauttamiseen; (iii) kaksi kiharakarvaista hiiriluokkaa (musta ja keltainen), jotka eivät ole informatiivisia ja jotka voidaan välittömästi hylätä. ( C ) Inversiojärjestelmä. Tasapainotuskromosomissa on inversio, joka estää rekombinaation kohtuullisella, 20-30 cM:n alueella, ja se on merkitty dominoivalla K14-agouti-transgeenillä, joka antaa keltaisen karvapeitteen värin, ja se on homotsygoottisesti letaali yhden tai useamman letaalisen geenin katkeamisen vuoksi sen päätepisteissä. Kun hedelmällisyys on palautunut, ENU-käsitellyt urokset paritetaan naaraiden kanssa, joilla on tasapainottava kromosomi (keltainen). G1-eläimet, jotka ovat keltaisia, paritetaan eläinten kanssa, jotka ovat heterotsygootteja tasapainottavan kromosomin ja Re:n suhteen (keltainen pilkullinen). Toisessa sukupolvessa voidaan tunnistaa kolme jälkeläisluokkaa, ja neljäs luokka, joka on homotsygootti tasapainottajakromosomin suhteen, kuolee (ylösalaisin). Hyödyllisiä G2-eläimiä ovat keltaiset, suorakarvaiset eläimet, jotka ovat veli-sisar-paritettuja. G3 jälkeläiset on helppo luokitella seuraavasti: (i) villin tyypin mutanttiluokka, jonka puuttuminen osoittaa yhdistetyn tappavan mutaation todennäköisyyttä, ja (ii) kantajaluokka, jota käytetään tappavien mutaatioiden pelastamiseen ja joka kantaa tasapainotettua pistemutaatiota ja joka on ihanteellinen kannan ylläpitoon.
( A ) Kromosomien uudelleenjärjestelyjen tuottaminen Cre /loxP:n avulla . On rakennettu kaksi lambda-hiiren genomikirjastoa, jotka sisältävät valikoivia markkereita, joita tarvitaan kaksivaiheisiin kohdentamistapahtumiin. Toinen sisältää selektiivisen merkkiaineen neomysiini ( Neo ), hypoksantiini-fosforibosyylitransferaasin ( Hprt ) 5′-pään, loxP-kohdan ja tyrosinaasin minigeenin ( Ty ). Toinen kirjasto sisältää valikoivan merkkiaineen puromysiini ( Puro ), Hpr:n 3′-pään, loxP-kohdan ja K14-Agouti-transgeenin ( Ag ). Jos loxP-kohdat lisätään cis:ssä samassa orientaatiossa, Cref-transektion jälkeinen rekombinaatio tuottaa deletion ja HAT-resistenttejä, Puro-herkkiä ja Neo-herkkiä ES-soluja. Jos loxP-kohdat on asetettu vastakkaiseen orientaatioon, rekombinaatio Cre-transektion jälkeen johtaa inversioon, jolloin saadaan HAT-resistenttejä, Puro-resistenttejä, Neo-resistenttejä ES-soluja. (B ja C) Hiiren kromosomin 11 mutageneesisuunnitelmat, joissa käytetään keltaisella karvavärillä merkittyjä kromosomien uudelleenjärjestelyjä. Deleetio tai inversio on merkitty dominoivalla keltaisella karvavärimerkillä, K-14-agouti (keltainen). Jokaisessa skeemassa käytetään Chr 11:n dominoivaa Rex ( Re , ja merkitty mustalla kromosomilla) -mutaatiota, joka aiheuttaa kiharan turkin (pilkullinen). Jokaisessa järjestelmässä villityypin uroksille (C57BL/6J, musta) ruiskutetaan 3 × 100 mg/kg ENU-annosta. (B) Deleetiojärjestelmä. Kun hedelmällisyys on palautunut, ENU-käsitellyt urokset paritetaan homotsygoottisten Re/Re-naaraiden kanssa. Re-mutaatio merkitsee kromosomia, joka ei ole mutageeninen, sillä varoituksella, että rekombinaatiota voi tapahtua uuden linkitetyn mutaation ja Re:n välillä. G1-eläimet, jotka ovat heterotsygootteja ENU-mutageenisten kromosomien ja Re:n suhteen, paritetaan hiirillä, jotka ovat hemotsygootteja keltaisella merkillä varustetun deletion suhteen. Tuloksena syntyvät jälkeläisluokat voidaan helposti tunnistaa: (i) mutanttiluokka on keltainen ja suorakarvainen, ja jos se puuttuu, se osoittaa tappavan mutaation todennäköisyyden; ii) kantajaluokka, joka on villityyppinen ja jota voidaan käyttää mahdollisten tappavien mutaatioiden palauttamiseen; iii) kaksi kiharakarvaista hiiriluokkaa (musta ja keltainen), jotka eivät ole informatiivisia ja jotka voidaan välittömästi hylätä. ( C ) Inversiojärjestelmä. Tasapainotuskromosomissa on inversio, joka estää rekombinaation kohtuullisella, 20-30 cM:n alueella, ja se on merkitty dominoivalla K14-agouti-transgeenillä, joka antaa keltaisen karvapeitteen värin, ja se on homotsygoottisesti letaali yhden tai useamman letaalisen geenin katkeamisen vuoksi sen päätepisteissä. Kun hedelmällisyys on palautunut, ENU-käsitellyt urokset paritetaan naaraiden kanssa, joilla on tasapainottava kromosomi (keltainen). G1-eläimet, jotka ovat keltaisia, paritetaan eläinten kanssa, jotka ovat heterotsygootteja tasapainottavan kromosomin ja Re:n suhteen (keltainen pilkullinen). Toisessa sukupolvessa voidaan tunnistaa kolme jälkeläisluokkaa, ja neljäs luokka, joka on homotsygootti tasapainottajakromosomin suhteen, kuolee (ylösalaisin). Hyödyllisiä G2-eläimiä ovat keltaiset, suorakarvaiset eläimet, jotka ovat veli-sisar-paritettuja. G3 jälkeläiset on helppo luokitella seuraavasti: (i) villin tyypin mutanttiluokka, jonka puuttuminen osoittaa yhdistetyn tappavan mutaation todennäköisyyttä, ja (ii) kantajaluokka, jota käytetään tappavien mutaatioiden pelastamiseen ja joka kantaa tasapainotettua pistemutaatiota ja joka on ihanteellinen kannan ylläpitoon.
Kun uusia tekniikoita kehitetään korkean läpimenon yhden nukleotidin polymorfismien havaitsemiseen, pistemutaatioiden havaitsemiseen käytettävät tekniikat yksinkertaistuvat ( 30 , 31 ). Toisin kuin ihmisillä, hiirten sisäsiitoskannoissa luonnollisesti esiintyvät polymorfismit ovat harvinaisia, erityisesti koodaavilla alueilla. Näin ollen pistemutaatioiden havaitseminen on mahdollista sisäsiitoskantataustassa, jolloin mutaatioiden havaitseminen mismatch repair -entsyymien avulla on mahdollinen lähestymistapa vaurioiden nopeaan kartoittamiseen ja tunnistamiseen.
Tautien fenotyyppien seulonta
Missä tahansa mutaatioiden seulonnassa, jossa käytetään ENU:ta, mutaatioiden eristäminen perustuu fenotyyppimääritykseen, mikä edellyttää, että mutantin fenotyypin on poikettava merkittävästi taustasta. Mutaatioiden seulonta edellyttää kuitenkin monien eläinten analysointia, joten fenotyyppiseulontojen on oltava laajoja ja edullisia. Näkyvät fenotyypit, jotka vaikuttavat silmiin, turkkiin, kokoon tai neurologiseen käyttäytymiseen, on helppo tunnistaa, ja tällaiset seulat tuottavat usein uusia mutaatioita. Käyttäytymisen ja aistielinten fenotyyppejä voidaan seuloa käyttämällä tavanomaisia testejä, jotka koskevat refleksejä, näön tai kuulon heikkenemistä, motorista kehitystä, tasapainoa ja koordinaatiota sekä oppimista ja muistia. Luuston kehitystä ja pehmytkudosten morfologiaa voidaan tutkia korkean resoluution matalaenergisellä röntgenanalyysillä. Hiiren verellä tehdyillä kliinisillä testeillä voidaan saada laaja valikoima fenotyyppejä, joilla on merkitystä ihmisen kliinisten sairauksien kannalta, vaikka hiiren kehon nesteillä tehtävät testit on tehtävä mikroskooppisesti. Koska ihmisvauvoille on jo olemassa mikroskooppisia testejä, monia kliinisiä testejä on jo saatavilla. Täydellisellä verenkuvalla ja mikroskooppisella differentiaalianalyysillä voidaan tunnistaa punasolujen ja valkosolujen lukumäärän tai morfologian poikkeavuudet sekä verihiutaleiden poikkeavuudet. Verisolujen analysoinnin laajentaminen virtaussytometrialla voi paljastaa muita immunologisia vikoja. Antinukleaaristen vasta-aineiden kvantitatiivisella määrityksellä voidaan havaita seerumin autovasta-aineet monissa erilaisissa autoimmuunisairauksissa, kuten systeemisessä lupus erythematosuksessa. Kliinisillä kemiallisilla testeillä voidaan diagnosoida useita elinjärjestelmän poikkeavuuksia, kuten maksa-, haima-, sydän- ja munuaishäiriöitä. Hiirten virtsa-analyysi paljastaa kohonneet proteiinipitoisuudet tai muut sairauden epänormaalit sivutuotteet. Tandem-massaspektrometrialla voidaan havaita erilaisia aineenvaihdunnan häiriöitä, jotka vaikuttavat lipideihin, rasvahappoihin tai aminohappoihin. Lisämäärityksiä kehitetään neurologisten, kardiovaskulaaristen, hematopoieettisten ja immunologisten fenotyyppien tunnistamiseksi käyttäen korkean läpimenon tekniikoita, kuten mikroarrayjä.
Mutaatiohiiren resurssi. Aluksi Baylor College of Medicinessä kehitetään hiiren kromosomille 11 mutanttihiiriresurssi, ja sitä käytetään tässä demonstraationa siitä, millaisia geneettisiä resursseja hiiressä on käytettävissä. Ihannetapauksessa tällaisia resursseja kehitetään muille hiiren kromosomeille. Mutaatioresurssi koostuu erilaisista mutaatioista, kuten ENU:n aiheuttamista pistemutaatioista, kohdennetuista geenihäiriöistä ja lisäyksistä sekä geneettisistä reagensseista, kuten deletioista ja inversioista. Nämä mutaatiot muodostavat kromosomin toiminnallisen kartan, ja ne lokalisoidaan molekyyliväleihin, jotta ne voidaan ankkuroida BAC- ja YAC-kontigeista koostuvaan fyysiseen karttaan. Kun hiiren genomi sekvensoidaan, mutaatiot voidaan suhteuttaa molekyyliväleissä sijaitseviin geeniehdokkaisiin.
Mutaatiohiiren resurssi. Aluksi Baylor College of Medicinessä kehitetään hiiren kromosomille 11 mutanttihiiriresurssi, ja sitä käytetään tässä demonstraationa siitä, millaisia geneettisiä resursseja hiiressä on käytettävissä. Ihannetapauksessa tällaisia resursseja kehitetään muille hiiren kromosomeille. Mutaatioresurssi koostuu erilaisista mutaatioista, kuten ENU:n aiheuttamista pistemutaatioista, kohdennetuista geenihäiriöistä ja lisäyksistä sekä geneettisistä reagensseista, kuten deletioista ja inversioista. Nämä mutaatiot muodostavat kromosomin toiminnallisen kartan, ja ne lokalisoidaan molekyyliväleihin, jotta ne voidaan ankkuroida BAC- ja YAC-kontigeista koostuvaan fyysiseen karttaan. Kun hiiren genomi sekvensoidaan, mutaatiot voidaan suhteuttaa molekyyliväleissä sijaitseviin geeniehdokkaisiin.
Mutaatiohiirien resurssien luominen
Mutaatioiden suurten määrien tuottaminen synnyttää uusia eettisiä ja tieteellisiä kysymyksiä hiiriä tutkivassa yhteisössä: tarvitaan uusia tietokantoja ja fenotyyppitestejä, mutaatioiden kustannustehokkaasta talteenotosta kryosäilötyistä tai pakastekuivattujen siittiöiden siemennesteen avulla tulee olennaisen tärkeää, ja eläinten hoitoa ja kustannuksia koskevat kysymykset korostuvat. Nämä toimet edellyttävät valtavaa panostusta hiiriresursseihin.
Geneettiset resurssit
Yksi tehokkaimmista hiiren geneettisistä resursseista ovat tällä hetkellä sisäsiitoskannat. Näiden kantojen geneettisen monimuotoisuuden tarkempi määrittely on yksi hiiriyhteisön ensisijaisista tavoitteista, ja parhaillaan pyritään kehittämään kantojen ominaisuustietokantaa. Tämä edellyttää sisäsiitoskantojen analysointia monien fenotyyppisten parametrien, kuten kliinisen hematologian ja kemian, patologian, käyttäytymisen ja fysiologian, osalta.
Suurten hiirimutaatiomäärien ylläpito, analysointi ja kartoitus edellyttävät geneettisten resurssien tuottamista kustannusten alentamiseksi ja virheiden vähentämiseksi. Geneettisiä reagensseja, kuten deleetioita, kehitetään erilaisilla menetelmillä, kuten Cre/ loxP ja säteily ( 22 , 23 , 25 , 32 , 33 ). Balancer-kromosomeja voidaan tällä hetkellä tuottaa nopeasti ja tehokkaasti Cre/loxP-menetelmillä ( 24 , 25 ). Ihmisen YAC- tai BAC-kromosomeja sisältävät siirtogeeniset hiiret voivat olla hyödyllisiä komplementaatio- ja pelastustutkimuksissa ( 34 ). Koska mutanttien fenotyypit voivat vaihdella eri sisäsiitoskantataustoilla, geneettisiä reagensseja olisi myös ylläpidettävä vakioperäisillä geneettisillä taustoilla.
arkistointi
Suurten hiirikantamäärien tuottaminen edellyttää kantojen tehokasta arkistointia ja rekonstruointia. Hiirten alkioiden varastointi kryosäilyttämällä on tehokas tekniikka, jota on käytetty jo yli vuosikymmenen ajan. Viime aikoina onnistumiset siittiöiden kryosäilytyksessä ovat tehneet siitä käyttökelpoisen tekniikan ( 35-37 ). Erityisesti hiiren siittiöitä voidaan käyttää kantojen palauttamiseen useilla avusteisen lisääntymisen tekniikoilla: keinosiemennyksellä, koeputkihedelmöityksellä ja sytoplasmasisäisellä siittiöinjektiolla (ICSI) ( 38 ). Hiirikantojen onnistunut rekonstruointi pakastekuivattujen siittiöiden avulla ICSI:n avulla voi tarjota uuden menetelmän hiirikantojen arkistointiin ja elvyttämiseen ( 39 ).
Tietokannat
Hiirten geneettisten ja fenotyyppisten tietojen käsittelyyn tarvitaan jo tietokantoja. Ensisijainen hiiritietokanta on Jackson Laboratoryssa (Bar Harbor, ME; http://www.informatics.jax.org ) sijaitseva Mouse Genome Database, joka sisältää Mouse Locus Catalogue -luettelon, jossa kuvataan olemassa olevia hiirimutaatioita ja joka sisältää laajoja karttatietoja, joissa kuvataan niiden sijainti. Mutanttihiirten etsimisen helpottamiseksi on äskettäin kehitetty International Mouse Strain Resource ( 40 ), jota peilataan kahdella www-sivustolla: Jackson Laboratory osoitteessa www.jax.org/pub-cgi/imsrlist ja MRC, Harwell, osoitteessa imsr.har.mrc.ac.uk/. Lisäksi fenotyyppitietoja kertyy todennäköisesti suuria määriä suuresta määrästä mutanttihiirikantoja, minkä vuoksi tarvitaan fenotyyppitietokantoja, jotka voidaan yhdistää kartoitus- ja mutageenitietokantoihin.
Jakelu
Yhteisön geneettisen resurssin tarjoamiseksi mutanttihiirten on oltava helposti saatavilla. Vaikka monia mutanttikantoja on saatavilla kaupallisilta myyjiltä tai Jacksonin laboratoriosta, tarvitaan lisää jakelukeskuksia. Tämän kysynnän tyydyttämiseksi useat NIH:n rahoittamat mutanttihiiriresurssikeskukset toimivat kantojen arkistoina ja jakelukeskuksina Yhdysvaltojen eri alueilla. Euroopan mutanttihiiri-arkisto, jonka solmukohdat sijaitsevat Monteretondossa (Roma, Italia), CNRS:ssä (Orleans, Ranska), Gulbenkian-instituutissa (Lissabon, Portugali) ja Karolinska-instituutissa (Huddings, Ruotsi), on resurssi eurooppalaisille toimille. Nämä resurssikeskukset on suunniteltu levittämään kaikentyyppisiä mutanttihiirikantoja.
Tulevaisuus näyttää valoisalta
Seuraavan vuosikymmenen aikana tuotetaan suuri määrä mutanttihiirikantoja, jotka sisältävät hiiriä, joilla on deleetioita, duplikaatioita, tasapainottavia kromosomeja, kohdennettuja häiriötekijöitä, geenipyydystimiä, retroviraalisia tai transgeenisiä insertioita ja pistemutaatioita. Näiden mutaatioiden kokoaminen mutanttihiiriresurssiksi edellyttää niiden sijainnin tarkentamista hiiressä ja niiden sijainnin ennustamista ihmisessä. Mutaatiot tuottavat genomin toiminnallisen kartan, joka voidaan suhteuttaa sekvenssi- ja transkriptiokarttaan, jolloin saadaan runsaasti toiminnallista tietoa ( kuva 3 ). Jo nyt on tuotettu suuri määrä ENU:n aiheuttamia mutaatioita, jotka edustavat vain murto-osaa nisäkkäiden genomin mutaatiopotentiaalista, ja lisäkokeet tuottavat uusia ihmisen sairausmalleja ja paljastavat uusia nisäkkäiden kehityspolkuja. Nämä kokeet muuttavat dramaattisesti ja pysyvästi käsitystämme nisäkkäiden geenien toiminnasta, mikä vaikuttaa suuresti lääkekehitykseen ja ihmisten terveyteen.
Kiitokset
Tekijät kiittävät Yin-Chai Cheahia avusta käsikirjoituksen viimeistelyssä. Kromosomi 11 -työtä rahoittaa Yhdysvaltain kansanterveysministeriön apuraha P01 CA75719. A.B. on Howard Hughes Medical Instituten tutkija.
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
.
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
.
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
.
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.