Der übliche Ansatz zur Untersuchung von Genfunktionen besteht darin, das Gen in eine Zelle oder ein Individuum einzufügen oder zu inaktivieren und Veränderungen im zellbiologischen Verhalten oder im individuellen Phänotyp zu beobachten, um seine Funktion zu ermitteln.

Daher kann die Untersuchung der Genfunktion mit den folgenden zwei Arten von Strategien durchgeführt werden:

• Funktionsverlust

• Funktionsgewinn

Funktionsverlust

Gen-Knockout ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Untersuchung von Funktionsverlusten bei Mäusen. Gen-Knockout bezieht sich auf die Entdeckung biologischer Funktionen von Zielgenen durch die Untersuchung von Organismen, die die inaktivierten (ausgeschalteten) Zielgene tragen. Bei dieser Technik werden Änderungen an Teilsequenzen von Zielgenen vorgenommen, die die Funktionen der spezifischen Gene deaktivieren und damit die Funktion des Zielgens ganz oder teilweise außer Kraft setzen. Gen-Knockout kann weiter unterteilt werden in konventionellen Gen-Knockout und bedingten Gen-Knockout.

Konventioneller Gen-Knockout

• Konventioneller Knockout (Abkürzung: KO) bezieht sich auf den Knockout bestimmter lebenswichtiger Exons, funktioneller Domänen des Zielgens oder sogar aller Exons in allen Mäusezellen, was zu einem Verlust der Expression des Zielgens führt.

• KO-Mäuse tragen die manipulierten Zielgen-Sequenzen in allen Geweben und Zellen. Zielgene werden in homozygoten Mäusen nicht exprimiert

• KO-Mäuse werden im Allgemeinen verwendet, um die Auswirkungen von Zielgenen oder Proteinfunktionen auf die Physiologie oder Pathologie zu untersuchen.

Conditional Gene Knockout

• Conditional Knockout (Abkürzung: CKO) ist das zeitlich und räumlich spezifische Engineering des Mausgenoms durch Beschränkung des Gen-Engineerings auf bestimmte Zelltypen in der Maus oder auf ein bestimmtes Entwicklungsstadium

• Gen-Targeting wird bei CKO-Mäusen verwendet, um ein oder mehrere wichtige Exons des Zielgens mit loxP-Stellen zu flankieren. Die Expression des Zielgens war vor der Kreuzung mit dem Cre-Rekombinase-exprimierenden Stamm normal. Bei der Verpaarung mit Cre-Rekombinase-exprimierenden transgenen Mäusen kann das Zielgen in einem bestimmten Gewebe oder Zelltyp ausgeschaltet werden, während seine Expression in anderen Geweben oder Zelltypen normal bleibt.

• CKO-Mäuse werden im Allgemeinen verwendet, um Gene zu untersuchen, die embryonale Letalität verursachen, Funktionen von Zielgenen oder -proteinen in einem bestimmten Gewebe oder Zelltyp oder die Rolle von Zielgenen oder -proteinen in einem bestimmten Zeitraum oder Stadium.

Fall: Anwendung von Drd2 KO- und Drd2 CKO-Mausmodellen in der Erforschung der Immunantwort des Gehirns

Funktionsgewinn

Die Untersuchung der Genfunktion durch Beobachtung von Veränderungen der biologischen Eigenschaften der Zelle oder des Individuums, in die das Zielgen eingeführt wurde, um neue oder höhere Expressionsniveaus zu erzeugen.

Zufalls-Transgene

Zufalls-Insertions-Transgenese ist die zufällige Integration eines exogenen Gens in das Mausgenom, um Mausmodelle mit Überexpression des Zielgens zu erzeugen. Sie wird verwendet, um die Auswirkungen der Überexpression des Zielgens auf die Physiologie und Pathologie zu untersuchen.

Zielgen-Überexpression

Die exogene DNA-Sequenz wird in Mäusen stabil exprimiert, nachdem sie in den Maus-Gt (ROSA) 26S oder auch Rosa26-Genlocus eingeschleust wurde. Die Expression des exogenen Gens kann auch gewebespezifisch oder medikamenteninduziert sein.

• Nützlich für Überexpressionsexperimente zur Gen- und Proteinfunktion

• Kann für Rettungsexperimente für KO-Phänotypen verwendet werden

Gen-Knock-in

Knock-in (Abkürzung: KI) bezieht sich auf die Einführung spezifischer Mutationen oder exogener DNA-Sequenzen an der Stelle des Zielgens.

(1) Einführung einer Basenmutation in das Zielgen, um ein menschliches genetisches Krankheitsmodell zu imitieren.

(2) Einführung eines Reportergens, wie EGFP, RFP, mCherry, YFP, LacZ und Luziferase, in das murine endogene Gen, um das Expressionsmuster des Zielgens zu beobachten.