Bildunterschrift

Oben sehen Sie ein JMOL-Bild von MK-0518, das das 3′-Ende der viralen DNA an der Bindung des aktiven Zentrums hindert. Beachten Sie die Metallchelat-Sauerstoffatome in MK-0518, die mit den Magnesiumkationen im aktiven Zentrum interagieren.

Im Jahr 2010 sind mehr als 25 Millionen Menschen an AIDS gestorben, und es wird geschätzt, dass etwa 33 Millionen Menschen mit HIV leben. Für retrovirale Integraseinhibitoren siehe Raltegravir und Retrovirale Integraseinhibitoren Pharmakokinetik.

Auswirkungen der Struktur

Dreidimensionale Strukturen für bestimmte Wirtszellproteine, die für das Verständnis des Mechanismus der HIV-Infektion und der Virulenz entscheidend sind, sind aus röntgenkristallographischen Analysen hervorgegangen. Die Strukturen der HIV-Protease und -Integrase gehören zu den am besten bewerteten Strukturen, die dazu beigetragen haben, viele Leben zu retten und die Lebensqualität vieler HIV-Infizierter zu verbessern. Sie wird im strukturbasierten Wirkstoffdesign zur Entwicklung von Protease- und Integrase-Inhibitoren eingesetzt und ist ein wichtiger Bestandteil der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART).

Die bestehenden antiretroviralen Wirkstoffe verbessern zwar die Lebensqualität und verlängern das Leben vieler Patienten, können aber die Krankheit nicht ausrotten. Studien mit Integrase-Inhibitoren zeigen, dass die Kombination mit anderen antiretroviralen Medikamenten die viralen Anpassungen verringert und das Potenzial hat, für die Rettungstherapie von Patienten eingesetzt zu werden, die eine Resistenz gegen andere Medikamente erworben haben. Weitere Informationen finden Sie unter

• AIDS vor Protease-Inhibitoren & HIV-Protease-Inhibitoren: A Breakthrough
• Treatments:Retroviral Integrase Inhibitor Pharmacokinetics References.

PFV Intasome Crystallization

Um die viralen DNA-Enden von HIV-1 zu imitieren, verwendeten Hare et al. (2010) lösliche und voll funktionsfähige Prototyp Foamy Virus (PFV) Intasom-Präparate, die mit rekombinanter PFV-Integrase und doppelsträngigen Oligonukleotiden hergestellt wurden.

Die bemerkenswerte Stabilität der Integrase-DNA-Komplexe wurde durch Beobachtung der in vitro-Strangtransferreaktionen ermittelt, die in drei Modi der Deproteinationsmigration unterteilt wurden: (1) einzelne konzertierte Ereignisse: linearisiertes Zielplasmid; (2) mehrfache konzertierte Ereignisse: Abstrich; (3) Halbstellenereignisse: offene zirkuläre DNA. Die weitere Charakterisierung des PFV-Intasoms zeigte auch strukturelle Substanzialität, was auf starke Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen trotz längerer Inkubation unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke schließen lässt. Umfassende Kristallisationsversuche ergaben eine brauchbare Kristallkonfiguration, die Röntgenstrahlen mit einer Auflösung von 2,9 Angström beugte. Schließlich wurde eine dreidimensionale Struktur bestimmt. Die asymmetrische Einheit enthielt ein einzelnes Integrase-Dimer mit einem stabil gebundenen viralen DNA-Molekül und ein Paar von Integrase-Dimeren, die mit der Symmetrie verbunden waren und ein längliches Tetramer bildeten. Die Dimer-Grenzfläche wird durch intermolekulare Wechselwirkungen zwischen dem Aminoterminal und den katalytischen Kerndomänen (innere Untereinheit – äußere Untereinheit) stabilisiert. Die Gesamtform des länglichen Tetramers ist einzigartig, auch wenn sie Ähnlichkeiten mit früher berichteten HIV-1-Integrase-Komplexen aufweist.

Kristallisationstechnik

Die Protein-DNA-Komplexe wurden unter Verwendung des PFV-IN in voller Länge und synthetischer dsDNA, die das virale Ende modellierte, gebildet.

Das Intasom wurde unter Verwendung der Dampf-Tropfen-Hängediffusionstechnik kristallisiert. Die Reservoirlösung bestand aus 1,35 M Ammoniumsulfat, 25% (v/v) Glycerin, 4,8% (v/v) 1,6-Hexandiol und 50mM 2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure (MES) bei pH 6,5. Die Protein-DNA-Kristalle wurden auch in Gegenwart von MK0518, GS9137, Mg(II) und/oder Mn(II) eingeweicht. Die Kristallstruktur wurde durch molekulare Ersetzung gelöst.

Kristallographische und Verfeinerungsstatistiken

Hare et al. (2010) haben Daten zu sieben Kristallstrukturen veröffentlicht. Diese Daten umfassen den PFV-IN-Komplex (Apo-Form) und sechs weitere Strukturen, darunter den an Mg, Mn, Mg/MK0518, Mn/MK0518, Mg/GS9137 und Mn/GS9137 gebundenen Komplex. Alle sieben Strukturen gehören der Raumgruppe P41212 an. Sie wurden mit einer Auflösung zwischen 2,85 und 3,25 Å verfeinert.

Gesamtarchitektur & Komponenten

Struktur

Die Gesamtstruktur des zusammengesetzten PFV-Intasoms ist ein Tetramer-Modell, das auf zwei Domänenstrukturen mit einer Dimer-Dimer-Schnittstelle basiert. Frühere Intasom-Modelle zeigen eine ähnliche, aber flexiblere Struktur, während sich das PFV-Intasom als stark eingeschränkt erwiesen hat. Unter Verwendung von Homologiemodellen schlagen Hare et al. (2010) vor, dass kürzere Interdomänen-Linker ein Faktor für die Flexibilität sein könnten, insbesondere bei der HIV-1-Integrase. Die inneren Untereinheiten des Tetramers sind an der gesamten Tetramerisierung und der viralen DNA-Bindung beteiligt. Die katalytischen Kerndomänen der äußeren Untereinheiten könnten als Stützen fungieren, aber da die amino- und carboxyterminalen Domänen in den Elektronendichtekarten nicht aufgelöst sind, bleibt ihre Funktion unklar. Der Linker der katalytischen Kerndomäne und der carboxyterminalen Domäne nimmt über den größten Teil seiner Länge eine verlängerte Konformation an und befindet sich parallel zur aminoterminalen Domäne und dem Linker der katalytischen Kerndomäne der inneren Untereinheit. Die Interdomänen-Linker Die Interdomänen-Linker (CCD-CTD-Linker und NTD-CCD-Linker) binden beide Hälften des Intasoms zusammen, und die Struktur wird durch ein Paar carboxyterminaler Domänen, die mit beiden inneren katalytischen Kerndomänen interagieren, weiter stabilisiert.

Integrase und DNA-Wechselwirkungen

Starke Protein-DNA-Wechselwirkungen finden sich innerhalb der terminalen sechs Nukleotide. Jede carboxyterminale Domäne interagiert mit dem Phosphodiester-Grundgerüst beider viraler DNA-Moleküle. Darüber hinaus interagieren die aminoterminale Domänen-Erweiterungsdomäne und die aminoterminale Domäne mit der viralen DNA an der aktiven Stelle der gegenüberliegenden katalytischen Kerndomäne.

Aktive Stelle

Die Carboxylate der aktiven Stelle sind Seitenketten von Asp 128, Asp 185, Glu 221.

Je ein Zinkatom befindet sich in der Nähe der aktiven Stellen.

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Integrase-Inhibitoren

Siehe auch Pharmakokinetik von retroviralen Integrase-Hemmern.